劉 欣,黃銀珠,金成日

齲病是在以細(xì)菌為主的多種因素影響下,牙體硬組織發(fā)生慢性進(jìn)行性破壞的一種疾病。藥物治療是臨床上常用的預(yù)防齲病和治療早期釉質(zhì)齲的方法,通過使用某些藥物(氟、礦化液、中藥及木糖醇等)使牙釉質(zhì)再礦化,阻止齲病進(jìn)展。各種藥物治療中,以局部涂氟治療最為常見。臨床上有多種氟化物制劑可供使用,如氟化物溶液、氟凝膠、含氟牙膏等[1-2]。2009年,DMG公司開發(fā)了一種新型滲透材料即Icon滲透樹脂應(yīng)用于治療早期齲。它是一種低黏度樹脂[3],主要由雙酚A甲基丙烯酸縮水甘油酯(bisphenol a methacrylate glycidol,Bis-GMA)、二甲基丙烯酸三甘醇酯(triethylene glycol dimethyl acrylate,TEGDMA)、光引發(fā)劑和溶劑乙醇組成。研究認(rèn)為Icon滲透樹脂的粘接性能、抗磨耗性能、硬度及粗糙度、美觀性能等方面均具有優(yōu)勢,因此Icon滲透樹脂的治療效果受到肯定[3-10]。

本實驗對離體牙采用酸凝膠法形成人工齲,運(yùn)用原子吸收分光光度計檢測經(jīng)滲透樹脂處理后牙釉質(zhì)在酸性環(huán)境下溶出的Ca2+含量,以氟保護(hù)漆和氟化鈉溶液作對照,評價滲透樹脂對人牙釉質(zhì)抗酸性的影響。采用掃描電鏡觀察釉質(zhì)表面及縱剖面的超微結(jié)構(gòu),評價滲透樹脂封閉釉質(zhì)脫礦區(qū)的情況,從而深入探討滲透樹脂的抗酸性能及防齲效果,為選擇安全有效、簡單易行的早期釉質(zhì)齲治療方法提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般材料

收集北京航天總醫(yī)院口腔門診2021—2022年因正畸拔除的上下前磨牙110顆,患者10～25歲。10倍體視顯微鏡下觀察并選擇牙冠完整、無齲壞、無缺損、無變色、無裂紋的牙齒。排除標(biāo)準(zhǔn):有充填物或齲壞的牙齒、釉質(zhì)發(fā)育不全、氟斑牙、四環(huán)素牙、死髓牙。去除牙周膜,用超聲潔治器去除牙齒表面菌斑和牙石,充分清潔后放于含有1%麝香草酚液的生理鹽水中冷藏(4 ℃)保存,6個月內(nèi)使用。

1.2 主要儀器與試劑

體視顯微鏡(Alpha,英國);Isomet 4000硬組織切片機(jī)(Buehler,美國);S-4800掃描電鏡(HITACHI,日本);Ⅱ6300原子分光光度計(島津,日本);37 ℃生化培養(yǎng)箱(上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司,中國);pH離子計(ORION868,美國);3.0 mm打孔器(Harris Micro-punch,美國);HZS-H水浴振蕩器(東方化?？萍加邢薰?中國);B3510E-DTH超聲波洗滌器(Branson,美國);YM-ZA金相試驗預(yù)磨機(jī)(上海金相機(jī)械設(shè)備有限公司,中國);BSA124S電子天平(賽多利,德國);多功能圖像分析儀、BH-2顯微鏡(奧林巴斯,日本)。

抗酸指甲油(大寶公司,中國);Icon滲透樹脂(DMG公司,德國);15%鹽酸膠狀酸蝕劑(DMG公司,德國);0.5%氟保護(hù)漆(萊可麗專業(yè)產(chǎn)品公司,美國)。制備人工唾液(1 000 mL蒸餾水中加入KH2PO40.330 g,Na2HPO40.340 g,KCl 1.270 g,NH4Cl 0.160 g,CaCl2·2H2O 0.170 g,NaCl 0.580 g,NaSCN 0.160 g,尿素 0.200 g,葡萄糖 0.030 g,維生素C 0.002 g,黏蛋白2.700 g,以上各成分混合溶解后,pH調(diào)至6.8,高壓消毒滅菌后備用);制備人工齲液(0.1 mol/L 乳酸100 mL加入高黏度羥乙基纖維素3 g,調(diào)勻,用NaOH調(diào)節(jié)pH=4.5,37 ℃恒溫下靜置,待氣泡完全消失后使用);0.02%氟化鈉溶液、酸性溶液(50 mmol/L HAC,2.2 mmol/L Na2HPO4,以去離子水配成1 L,用NaOH調(diào)節(jié)pH=5.0)、0.5 mol/L硝酸溶液、20 g/L氧化鑭溶液(稱取純度>99.99%的氧化鑭23.45 g,先用少量水濕潤再加75 mL鹽酸于1 000 mL容量瓶中,加去離子水稀釋至刻度)。

1.3 方法

1.3.1 人工釉質(zhì)齲的建立

用打孔器在膠帶上打出直徑為3 mm的圓孔,粘接于經(jīng)過處理的離體牙頰側(cè)釉質(zhì)表面處,揭去膠帶,形成直徑為3 mm的圓形開窗區(qū),剩余牙體用抗酸指甲油覆蓋兩次。在距牙根尖1 mm處打孔,穿入鐵絲,將離體牙懸吊在含有人工齲液的燒杯內(nèi)(一般1個樣本需要20～25 mL的人工齲液),保證離體牙牙冠完全浸入人工齲液中,牙根部位暴露在空氣中,樣本連續(xù)浸泡4 d,每天更換一次人工齲液,保證37 ℃恒溫。4 d后取出標(biāo)本,清水沖洗待用。

1.3.2 實驗分組

隨機(jī)取樣本10個,將牙根部包埋于自凝樹脂材料中,用硬組織切片機(jī)垂直開窗區(qū)表面。沿牙齒縱剖面由牙冠向根方進(jìn)行連續(xù)切片,在玻璃磨板上磨至250 μm厚,在40倍光鏡和掃描電鏡下觀察脫礦情況。每個樣本選擇3個切片,每個切片隨機(jī)選擇3個位置進(jìn)行測量,取其平均值作為該樣本的平均脫礦深度。余下100顆樣本隨機(jī)分成5組,每組20顆。滲透樹脂組為A組,氟保護(hù)漆組為B組,氟化鈉組為C組,去離子水組為D組,涂布指甲油組為E組。

滲透樹脂組(A組):開窗區(qū)涂布滲透樹脂,按照產(chǎn)品說明書操作,首先在開窗區(qū)采用15%HCl酸蝕120 s,沖洗30 s,99%乙醇干燥脫水30 s,用小毛刷涂布Icon滲透樹脂3 min,輕微吹干10 s,光照40 s,再涂布滲透樹脂1 min,同樣光照40 s。

氟保護(hù)漆組(B組):開窗區(qū)吹干,涂布氟保護(hù)漆(含有5%的NaF,其中氟離子濃度為2.26%,以松香作為基質(zhì))2次,自然干燥。

氟化鈉組(C組):樣本浸入0.02%氟化鈉溶液中24 h,然后取出,自然干燥。

陽性對照組(D組):開窗區(qū)涂布去離子水,自然干燥。

陰性對照組(E組):開窗區(qū)涂布抗酸指甲油2次,自然干燥。

5組樣本均保存在人工唾液中24 h,37 ℃恒溫。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 Ca2+溶出量的測定

將樣本分別懸吊放入10 mL帶蓋的一次性塑料離心管內(nèi),每個離心管中加入酸性溶液5 mL(保證樣本牙冠全部浸入),蓋緊,放置于水浴恒溫振蕩器內(nèi)。37 ℃恒溫回旋振蕩24 h后取出樣本,離心管內(nèi)的溶液留作進(jìn)行Ca2+溶出量的測量。Ca2+溶出量采用原子分光光度計測量。

1.4.2 掃描電鏡觀察

使用硬組織切片機(jī)垂直開窗區(qū)表面,沿牙齒長軸方向切開,一部分做連續(xù)切片,玻璃磨板磨至250 μm厚,超聲洗滌后備用,開窗區(qū)的縱剖面進(jìn)行掃描顯微鏡觀察。另一部分超聲洗滌備用,開窗區(qū)的表面進(jìn)行掃描電鏡觀察。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包,5組樣本的Ca2+溶出量采用單因素方差分析方法(one-way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)檢驗,Tukey HSD法進(jìn)行各組間比較,分析3種材料對釉質(zhì)表面抗酸性能影響的差異。

2 結(jié) 果

2.1 人工釉質(zhì)齲的建立

脫礦后樣本的切片在40倍體視顯微鏡下觀察,釉質(zhì)層形成以表層下脫礦為主要特征的病理改變,可見較為完整的釉質(zhì)表層及下方的病損體部。并且病損范圍均在釉質(zhì)淺層,未達(dá)到釉牙本質(zhì)界(圖1)。測量樣本的脫礦深度為(0.551±0.658)mm(n=10)。

A:正常牙釉質(zhì);B:脫礦牙釉質(zhì);黑箭頭:脫礦的釉質(zhì)表層;白箭頭:釉質(zhì)脫礦范圍

在掃描電子顯微鏡下觀察,正常釉質(zhì)表面光滑平整(圖2A)。人工齲釉質(zhì)表面可見孔隙增大,呈現(xiàn)帶有很多凹坑狀的、不規(guī)則的外觀。釉柱晶體溶解,結(jié)構(gòu)破壞(圖2B)。人工齲剖面見釉質(zhì)表層較完整,表層下方釉柱間隙增大,可見與釉質(zhì)生長線一致的短裂隙狀改變,向內(nèi)延伸。表層下方脫礦區(qū)脫礦深度較一致,病損范圍局限在釉質(zhì)層(圖3)。

A:正常釉質(zhì);B:釉質(zhì)齲表面

a:牙釉質(zhì);b:牙釉質(zhì)脫礦區(qū);白箭頭:脫礦的釉質(zhì)表層

2.2 Ca2+溶出量的測定結(jié)果

陰性對照組、滲透樹脂組、氟保護(hù)漆組、氟化鈉組、陽性對照組Ca2+溶出量分別為(0.109±0.535)、(6.432±1.867)、(31.208±7.784)、(41.176±3.512)、(77.616±10.789)μg/mL。

經(jīng)單因素方差分析(one-way ANOVA),滲透樹脂組、氟保護(hù)漆組及氟化鈉組分別與陽性對照組、陰性對照組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其中陽性對照組的Ca2+溶出量明顯高于滲透樹脂組、氟保護(hù)漆組及氟化鈉組(P<0.01),氟保護(hù)漆組及氟化鈉組的 Ca2+溶出量明顯高于陰性對照組(P<0.01),滲透樹脂組的Ca2+溶出量略高于陰性對照組(P<0.05)。經(jīng)one-way ANOVA中的Tukey HSD檢驗,3個實驗組之間兩兩比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(表1)。

表1 實驗組和對照組牙釉質(zhì)Ca2+溶出量(24 h)的比較

2.3 實驗后的樣本SEM觀察結(jié)果

滲透樹脂組(A組)可見釉質(zhì)表面有完整、相對平滑的材料覆蓋,呈條紋狀,在高倍鏡下未見到明顯的孔隙結(jié)構(gòu)(圖4A、B)。觀察開窗區(qū)縱剖面,可見釉質(zhì)表層覆蓋一薄層樹脂材料,較致密。滲透樹脂能較好地占據(jù)表層下釉質(zhì)由于脫礦所產(chǎn)生的孔隙,且材料相對致密,呈密集的網(wǎng)篩狀。材料沿著牙釉質(zhì)的釉柱間隙滲透,病損體部的大部分被材料完全滲入,僅有少部分脫礦的釉質(zhì)區(qū)域未見滲入的材料。齲損部位從底部到上方形成了一個不規(guī)則的樹脂帶(圖4C、D)。氟保護(hù)漆組(B組)可見牙釉質(zhì)表面完整,覆蓋一層漆膜,似碎玻璃狀晶體結(jié)構(gòu),局部可見凹陷痕跡、裂紋、孔隙,但裂紋和孔隙較小(圖4E、F)。觀察開窗區(qū)縱剖面,可見釉質(zhì)表層被一薄層材料覆蓋,材料呈絲網(wǎng)狀,不致密,釉質(zhì)內(nèi)可見到大面積的白色團(tuán)塊狀沉積物,形態(tài)不規(guī)則,但仍有部分脫礦區(qū)域未見到白色沉積物(圖4G、H)。氟化鈉組(C組)釉質(zhì)表面孔隙清晰,孔隙直徑明顯大于氟保護(hù)漆組,釉質(zhì)表面有成片的小塊狀的白色沉積物覆蓋,數(shù)量較少,釉質(zhì)表面結(jié)構(gòu)尚完整(圖4I、J)。開窗區(qū)縱剖面見釉質(zhì)表層覆蓋物不完整,釉質(zhì)內(nèi)可見少量的不規(guī)則白色沉積物充填釉質(zhì)孔隙,正常釉柱結(jié)構(gòu)消失,結(jié)構(gòu)紊亂(圖4K、L)。陽性對照組(D組)表現(xiàn)為釉質(zhì)表面結(jié)構(gòu)的破壞,高倍鏡下釉質(zhì)表面布滿了酸蝕脫礦的孔隙(圖5)。

紅箭頭示釉質(zhì)表面暴露的牙體組織;白箭頭示白色沉積物斑外觀。Icon滲透樹脂滲入后的折光率接近正常牙釉質(zhì)的折光率,使美觀得以改善[15]。Enan等[13]提出正畸患者在戴上托槽后很可能會出現(xiàn)白堊病變,可以在矯正前或矯正后使用滲透樹脂,通過再礦化脫礦的牙釉質(zhì)來達(dá)到更滿意的矯正效果。國內(nèi)學(xué)者也有類似報道,通過比較滲透樹脂與氟保護(hù)漆治療正畸后產(chǎn)生的齲白斑,發(fā)現(xiàn)滲透樹脂能明顯改善白堊斑的美觀問題[16-17]。

圖5 陽性對照組釉質(zhì)表面SEM圖像

3 討 論

本實驗采用構(gòu)建人工齲模型來模擬自然狀態(tài)下形成的齲。酸凝膠法模擬口腔的酸性環(huán)境,較其他方法操作簡單、重復(fù)性強(qiáng)、容易控制,能獲得與自然釉質(zhì)齲損相似的病變結(jié)構(gòu)[11],單純研究齲病的進(jìn)展和礦物鹽離子的變化常采用此方法。本實驗采用酸凝膠法連續(xù)脫礦4 d制備人工釉質(zhì)齲,樣本經(jīng)過酸凝膠脫礦液處理后,肉眼可見呈均勻的白堊色改變的脫礦區(qū)。光鏡及掃描電鏡觀察,脫礦的牙釉質(zhì)表層完整,且表層下方脫礦區(qū)脫礦深度較一致,脫礦深度為(0.551±0.658)mm,病損局限在牙釉質(zhì)層。

早期齲的發(fā)生是牙釉質(zhì)脫礦與再礦化交替進(jìn)行的動態(tài)過程,酸對釉質(zhì)的損害首先發(fā)生在釉柱鞘,然后是釉柱芯和釉柱間質(zhì),釉質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞,呈多孔性,從表及里有許多微小通道,這些微小通道相互連通構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng),使脫礦過程中溶解的礦物質(zhì)如鈣、磷離子等向外擴(kuò)散,通過檢測從牙齒中脫出的Ca2+濃度,可以反映釉質(zhì)脫礦的程度。原子吸收分光光度計是一種檢測溶液中微量原子濃度的常用標(biāo)準(zhǔn)儀器,它可以準(zhǔn)確地定量檢測牙釉質(zhì)中脫出的Ca2+濃度。本實驗通過測量釉質(zhì)中Ca2+溶出量來衡量滲透樹脂材料提高釉質(zhì)抗酸性能的程度。實驗結(jié)果顯示滲透樹脂組Ca2+溶出量為(6.432±1.867)μg/mL,明顯低于陽性對照組(77.616±10.789)μg/mL、氟保護(hù)漆組(31.208±7.784)μg/mL及氟化鈉組(41.176±3.512)μg/mL。說明滲透樹脂應(yīng)用后,減少了釉質(zhì)表面在酸性環(huán)境下的Ca2+溶出量,可以提高釉質(zhì)表面的抗酸能力,且優(yōu)于氟保護(hù)漆及氟化鈉。滲透樹脂組檢出的Ca2+溶出量高于陰性對照組(0.109±0.535)μg/mL,說明滲透樹脂組仍有一定的Ca2+溶出,即滲透樹脂材料不能完全抑制釉質(zhì)的進(jìn)一步脫礦,這與Paris等[12]報道的研究結(jié)果相同。Enan等[13]用可樂和紅牛制造酸性環(huán)境,經(jīng)實驗得出在酸性環(huán)境中滲透樹脂對脫礦的牙釉質(zhì)有保護(hù)作用。梁向陽等[14]同樣在碳酸飲料中做實驗發(fā)現(xiàn)滲透樹脂能夠有效地阻斷碳酸飲料所致牙釉質(zhì)脫礦的發(fā)展。本實驗中,樣本一直處于酸性環(huán)境中,滲透樹脂雖然不能完全抑制釉質(zhì)脫礦,但是與氟保護(hù)漆、氟化鈉相比,滲透樹脂在提高釉質(zhì)表面的抗酸性能方面,已經(jīng)具有明顯的優(yōu)勢。滲透樹脂提高釉質(zhì)表面的抗酸性能效果還需要長期觀察和研究。

Torres等[10]進(jìn)行了滲透樹脂的顏色穩(wěn)定性實驗,證明了滲透樹脂可以較好地覆蓋脫礦釉質(zhì)區(qū)的白堊色,使其接近正常釉質(zhì)色,恢復(fù)美觀。其中釉質(zhì)的折光率取決于晶體的空間大小,在早期齲時隨著晶體開始溶解,產(chǎn)生了脫水,水又被替換成空氣,折光率從大變小, 因此隨著對光的散射不同出現(xiàn)了白滲透樹脂是一種采用滲透原理治療早期齲的新型材料。滲透樹脂治療早期齲的原理是封閉釉質(zhì)由于脫礦造成的孔隙,從而阻止進(jìn)一步脫礦[18]。Meyer-Lueckel等[3]使用橫斷顯微放射照相術(shù)(transverse microradiography,TMR)和激光掃描共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscope,CLSM)檢測發(fā)現(xiàn),Icon滲透樹脂在自然齲釉質(zhì)層內(nèi)的滲透深度大約為171 μm,經(jīng)過光照固化,滲透樹脂機(jī)械性地固化在部分溶解的羥基磷灰石上,形成樹脂-多孔羥基磷灰石復(fù)合體,填滿釉柱間隙,堵塞釉質(zhì)表面孔隙,封閉了齲損進(jìn)展通道,使致齲酸不能滲入釉質(zhì)深層,阻止病變發(fā)展。Perdig?o[19]發(fā)現(xiàn)白堊區(qū)域釉質(zhì)表面晶體被滲透樹脂聚合物包裹,而實驗得出樹脂聚合物與釉質(zhì)的結(jié)合相比于釉質(zhì)更能抵抗酸的侵蝕,從而阻止進(jìn)一步脫礦。梁向陽等[14]通過激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)經(jīng)滲透樹脂處理的離體牙釉質(zhì)表面較光滑平坦,無明顯凹陷,熒光染料沉積較少,僅在釉質(zhì)最表面看到較微弱的熒光圖像。本實驗SEM觀察結(jié)果顯示,滲透樹脂組可見釉質(zhì)表面完整、相對平滑,條紋狀,未見到明顯的孔隙結(jié)構(gòu)?？v剖面觀察可見釉質(zhì)表層覆蓋一薄層樹脂材料,較致密均勻。少部分脫礦的釉質(zhì)區(qū)域未見滲入的材料。釉質(zhì)表層一薄層未滲入的樹脂材料構(gòu)成了一個樹脂膜,雖然能較好地封閉釉質(zhì)表面孔隙,提高了釉質(zhì)的抗酸性能,但也說明了滲透樹脂的滲透性能有限。滲透樹脂具有聚合收縮性能[20],樹脂材料在聚合時會伴隨一定的體積收縮,材料內(nèi)部會產(chǎn)生內(nèi)聚力,從而引發(fā)材料的微裂紋、微隙[21],酸性物質(zhì)易通過這些微裂紋或者微隙進(jìn)入釉質(zhì),使釉質(zhì)繼續(xù)脫礦。雖然本實驗SEM觀察顯示釉質(zhì)表面未見到明顯裂紋及孔隙,但滲透樹脂提高釉質(zhì)抗酸性能的長期效果還有待于研究。

本實驗的結(jié)果提示滲透樹脂能提高釉質(zhì)表面的抗酸性能,阻止齲進(jìn)展,明顯優(yōu)于氟保護(hù)漆及氟化鈉,在早期釉質(zhì)平滑面齲防治方面具有優(yōu)勢。由于此材料臨床應(yīng)用時間較短,長期的臨床效果還有待進(jìn)一步研究;滲透樹脂具有較強(qiáng)的滲透性,材料能在釉質(zhì)表層形成一薄層樹脂膜,并能較好地滲入到釉質(zhì)孔隙中,和氟保護(hù)漆在釉質(zhì)表面形成的漆膜相比,此層結(jié)構(gòu)更加均勻致密、平滑,能較好地封閉釉質(zhì)的脫礦孔隙,阻止酸性物質(zhì)對釉質(zhì)的進(jìn)一步侵蝕。本實驗采用體外形成的人工釉質(zhì)齲,和臨床上致齲環(huán)境存在一定差異,真實的口腔環(huán)境有可能存在影響滲透樹脂治療效果的因素[22],還需研究其臨床的使用效果。此材料在口腔臨床領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。