張琴林, 張佳蕊, 郭仰東, 張喜春

(1.北京農(nóng)學院植物科學技術學院/北京市蔬菜遺傳育種與生物技術實驗室,北京102206; 2.中國農(nóng)業(yè)大學園藝學院,北京100094)

番茄(SolanumlycopersicumMill.)為茄科番茄屬植物。低溫冷害可能發(fā)生在番茄生長的各個階段,對番茄種子發(fā)芽率、幼苗葉片生長、植株根系生長、花芽分化以及開花坐果等都有影響[1]。因此,挖掘番茄抗寒相關基因及轉錄因子,探究低溫脅迫下的基因功能及分子作用機制,對番茄抗寒育種具有重要意義。近年來,主要圍繞番茄生物合成、抗病蟲害和非生物脅迫響應方面展開番茄MYB家族轉錄因子的功能研究。劉壯斌的研究結果表明,SlMYB113基因受赤霉素(GA)、低溫和干旱等多種脅迫誘導表達,過表達SlMYB113的轉基因番茄株系葉背呈明顯紫色,表明該基因通過促進花青素的積累來提高番茄植株的耐寒性[2]。番茄SlMYB75能促進番茄果實揮發(fā)性香氣的產(chǎn)生,提高花色苷、酚類和黃酮類物質(zhì)的含量并加快果實成熟,提高果實營養(yǎng)品質(zhì)[3]。番茄SlMYB41過表達株系對低溫更加敏感,而SlMYB41沉默株系使抗氧化酶的活性提高,增強了番茄低溫抗性,SlMYB41在低溫應答過程中起負調(diào)控作用,其表達受低溫、高溫和NaCl誘導[4]。木瓜果肉中克隆出的基因CpMYB44-like(命名為CpMYB1)可以與細胞壁降解基因(CpPME1、CpPME2和CpPG5)以及類胡蘿卜素生物合成基因(CpPDS2、CpPDS4和CpCHY-b)的啟動子結合,進一步研究發(fā)現(xiàn),CpMYB44-like(CpMYB1)是轉錄抑制因子,它可以抑制上述啟動子的活性[5]。沉默病毒誘導的番茄SlSWEET1a基因使幼葉中的己糖積累減少約50%,而成熟葉中的己糖積累增加了2倍,表明該基因參與糖的轉運[6]。瞬時沉默番茄SlAR基因影響了番茄果實中類胡蘿卜素的積累,番茄紅素和總類胡蘿卜素含量低,說明該基因調(diào)控類胡蘿卜素合成過程[7]。病毒誘導的基因沉默(VIGS)介導的番茄MYB80基因沉默使番茄植株耐寒性降低,說明MYB80基因表達受低溫誘導[8]。用病毒誘導的基因沉默方法對番茄SlILL1、SlILL5、SlILL6的表達進行沉默,結果表明,3個基因在番茄花梗脫落中起著十分重要的作用[9]。用VIGS沉默處理谷胱甘肽轉移酶(GSTU43)后,抗氧化酶活性降低,膜損傷程度高,表明該基因通過降低膜脂過氧化程度,進而提高番茄低溫耐受性[10]。本研究中番茄基因SlMYB44-like(LOC101262913)是從實驗室前期番茄低溫轉錄組測序結果中篩選出的基因,但在番茄中尚未見關于該基因響應低溫脅迫功能的研究。通過對基因沉默植株的抗寒性分析檢測該基因是否影響番茄植株的抗寒性。運用VIGS技術瞬時沉默SlMYB44-like基因,獲得基因沉默植株,測定低溫處理后相關生理指標,進一步探究SlMYB44-like基因的功能,為番茄抗寒育種提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為番茄品種 O-33-1(北京農(nóng)學院實驗室,品種編號 63)。

菌株及試劑：大腸桿菌(Escherichiacoli) DH5α感受態(tài)細胞、GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞購于北京博邁德基因技術有限公司;限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司;抗氧化酶活性[超氧化物岐化酶(SOD)、過氧化物(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性]測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所,其他試劑為實驗室保存分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 番茄SlMYB44-like基因的VIGS載體構建 利用番茄基因組數(shù)據(jù)庫(https://solgenomics.net/)中VIGS Tool選定番茄SlMYB44-like基因片段,根據(jù)插入片段序列設計特異性引物,引物兩端分別加上有酶切位點XbaⅠ和SmaⅠ的同源臂(表1)。用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和SmaⅠ雙酶切pTRV2載體質(zhì)粒,載體與目的片段分別純化回收后用同源重組酶進行連接,構建TRV2-SlMYB44-like載體質(zhì)粒。將連接后的質(zhì)粒轉入大腸桿菌DH5α感受態(tài),涂板37 ℃倒置培養(yǎng),挑取單菌落并搖菌,隨后進行PCR驗證并對有目的條帶的菌液進行測序。從測序結果完全正確、無點突變的菌液中提取質(zhì)粒,利用凍融法轉入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞中,驗證正確后用于下一步試驗。

表1 引物名稱及序列

1.2.2 番茄SlMYB44-like基因的VIGS侵染體系構建 分別將轉入pTRV1、pTRV2空載和pTRV2-MYB44-like質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液放入搖床振蕩培養(yǎng)16 h,溫度28 ℃,200 r/min,LB培養(yǎng)基中加卡那霉素。待到3種菌液的D600 nm=0.6～1.0時離心收集菌體,調(diào)節(jié)侵染液pH值為5.6,侵染Buffer重新懸浮菌體(200 μmol/L AS,10 mmol/L MES,10 mmol/L MgCl2),使菌液D600 nm調(diào)整到1.0。將pTRV1分別與pTRV2和pTRV2-MYB44-like菌液以1 ∶1比例混合,在室溫條件下靜置3～4 h,注意避光,活化農(nóng)桿菌菌液。用1 mL的無針注射器吸取活化后的菌液,侵染3～4周苗齡番茄葉片和子葉背部,至葉背面有明顯水漬狀,之后將番茄幼苗放在人工氣候培養(yǎng)箱(16 ℃,60% 濕度)黑暗培養(yǎng)24 h,然后將番茄植株轉移至25 ℃/20 ℃(日/夜),16 h/8 h條件下培養(yǎng)。3組供試番茄植株數(shù)：野生型(WT)30株;攜帶pTRV2空載組(CK)及基因沉默組(TRV-SlMYB44-like)各50株。

1.2.3 陽性植株鑒定 侵染番茄植株10 d后,利用Trizol總RNA提取試劑盒分別取野生型(WT)、空載組(CK)和基因沉默組(TRV-SlMYB44-like)植株的新鮮葉片提取RNA。利用反轉錄試劑盒將提取好的RNA反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板,用pTRV2-F和VIGS 44-like R特異引物進行PCR擴增,篩選出沉默組陽性植株,而空載組的引物為pTRV2-F和pTRV2-R。

1.2.4 基因沉默后植株的抗寒性分析 將WT、CK、基因瞬時沉默組3組番茄植株置于4 ℃、濕度60%、晝—夜16 h—8 h的培養(yǎng)條件下低溫處理。取樣方法：在低溫處理0、5 d采集新鮮的番茄葉片,用于測定葉片生理生化指標進行抗寒性分析,吸光度值用紫外分光光度計測定。3組番茄植株置于 4 ℃ 培養(yǎng)箱中低溫處理5 d后進行表型觀察;游離脯氨酸、丙二醛(MDA)、可溶性蛋白和可溶性糖含量按《植物生理學實驗教程》[11]和Kong等的方法[12]測定;抗氧化酶(CAT、POD、SOD)活性用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定;番茄葉片的可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍G-250染色法測定。所有測定保證至少3個生物學重復,最終結果是3次試驗數(shù)據(jù)的平均值。用SPSS分析數(shù)據(jù),當P<0.05時,認為具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 SlMYB44-like基因的VIGS載體構建

在番茄基因組數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站中用VIGS Tool工具選定300 bp左右的SlMYB44-like基因插入目的片段。經(jīng)酶切連接,構建pTRV2-SlMYB44-like載體質(zhì)粒。用插入片段特異性引物V44-like F和 V44-like R進行PCR驗證并測序,載體驗證結果見圖1。300 bp左右出現(xiàn)目的條帶,測序結果比對正確,證明載體構建成功,可進行下一步試驗。

2.2 陽性植株驗證

侵染植株10 d后,取番茄植株新鮮葉片提取RNA,反轉錄合成cDNA用于特異性引物PCR擴增,進行陽性植株驗證。凝膠電泳結果如圖2所示,460 bp 處有明亮條帶,證明載體已經(jīng)轉入植物體,得到了陽性植株。經(jīng)過陽性植株鑒定,共得到pTRV2空載組22株,SlMYB44-like基因沉默組植株24株。

2.3 SlMYB44-like基因沉默植株在低溫脅迫處理后的表型變化

將野生型、空載組和基因沉默組放入4 ℃光照培養(yǎng)箱低溫處理5 d。通過表型觀察和測定抗寒相關生理指標,對基因沉默植株進行抗寒性分析。如圖3所示,在常溫條件下,沉默株系與野生型番茄植株生長狀況良好,3組無明顯差別,植株挺立,葉片舒展,而經(jīng)過5 d低溫處理后,基因沉默植株表現(xiàn)受冷害程度更明顯,葉片卷曲,萎蔫下垂,下部葉片嚴重失水,而野生型番茄冷害癥狀相對較輕。說明SlMYB44-like基因沉默后植株抗寒性降低。

2.4 低溫脅迫下SlMYB44-like基因沉默植株抗寒生理指標的測定

脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白這3種物質(zhì)都是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),在細胞滲透調(diào)節(jié)過程中起著十分重要的作用。從圖4-A可以得出,低溫脅迫后野生型、空載組和基因沉默組植物體內(nèi)的游離脯氨酸含量都增加。在常溫條件下,3組植株間的脯氨酸含量無顯著差異。低溫處理后,野生型和空載組的脯氨酸含量顯著增加,而基因沉默組脯氨酸含量略有增加?？赡苁荢lMYB44-like基因沉默影響了脯氨酸代謝途徑,從而降低了植株低溫耐受性。由圖4-B可以看出,基因沉默組植株和空載組的可溶性蛋白含量均低于野生型,低溫處理后,3組植株的可溶性蛋白含量均下降,這可能是低溫脅迫影響了蛋白質(zhì)的合成,野生型可溶性蛋白含量高,也提高了抗寒性。低溫處理后,沉默組可溶性糖含量高于野生型與空載組,可能是沉默組植株對低溫脅迫更敏感,受到的傷害更大,需要合成大量的可溶性糖來抵御低溫(圖4-C)。丙二醛是衡量植物氧化脅迫程度的常用指標,具有細胞毒性。MDA的產(chǎn)生會加重細胞膜的損傷,反映了植物體內(nèi)膜的過氧化程度。從圖4-D可以看出,基因沉默組的丙二醛含量高于另外2組,說明基因沉默組植株體內(nèi)能積累更多的活性氧含量,細胞受損更嚴重。低溫前后丙二醛含量只有少量增長,而低溫處理5 d后的丙二醛含量剛好達到處理前近似水平。

由圖5-A可知,超氧化物歧化酶活性經(jīng)低溫處理后出現(xiàn)下降,野生型明顯低于沉默組,可能低溫處理5 d后,沉默組植株啟動自我保護機制,清除體內(nèi)過量的活性氧。由圖5-B可以看出,低溫處理后野生型植株過氧化物酶活性升高,而沉默組過氧化物酶活性低于常溫條件,可能是因為植株受到低溫脅迫,POD活性降低。低溫處理后3組植株過氧化氫酶活性都有升高,野生型高于沉默組,基因沉默組植株CAT活性的上升明顯低于野生型,說明基因沉默組植株具有較強的抗氧化能力,為基因沉默組植株與野生型的抗氧化比較提供了依據(jù)。能清除更多的活性氧,減小低溫對植株的傷害(圖5-C)。這些結果進一步說明了SlMYB44-like基因沉默后,植株對低溫的敏感性上升。

綜上所述,由抗寒生理指標測定結果可得,SlMYB44-like基因沉默后,沉默組植株低溫耐受性低于野生型植株,與表型觀察結果一致。說明SlMYB44-like基因響應低溫脅迫,參與植物體低溫脅迫應答調(diào)控過程。

3 討論

VIGS技術因試驗周期短、成本低的特點被廣泛應用于基因功能的探究。病毒誘導的基因沉默效率受環(huán)境溫度因素制約[13],Burch等的研究表明,相對較低的溫度可以促使植株盡早開啟病毒防御機制,使植株出現(xiàn)更為明顯的沉默表型,同時,病毒侵染過程也與溫度相關,較低溫度利于病毒感染植株,利于提高沉默效率[14]。在番茄中,21 ℃是病毒誘導基因沉默的最適溫度[15]。另一個影響因素是植株侵染時期,研究發(fā)現(xiàn),相較于成熟期植株,幼嫩的組織或植株更容易被侵染,且有更高的沉默效率[16]。本試驗中侵染3周苗齡的番茄葉片,侵染后置于培養(yǎng)箱黑暗環(huán)境24 h,溫度控制在20～25 ℃,以提高沉默效率,侵染10 d后鑒定沉默陽性植株,進行抗寒性分析。經(jīng)PCR驗證共得到24株陽性植株。

利用TRV誘導SlMYB44-like基因沉默時,基因沉默組番茄植株受冷害的程度比較嚴重,說明SlMYB44-like基因參與番茄冷脅迫響應,影響番茄御冷機制。林多等的試驗結果表明處理時間越長,番茄葉片POD活性越高,且苗期POD活性比坐果期高,而2個時期冷敏感程度相近,說明苗期番茄比坐果期更耐低溫[17]。SOD是抗氧化酶清除自由基的第1個參與者,延緩了自由基對細胞的進一步傷害,有研究表明根際低氧脅迫下初期SOD活性提高,而后酶活性隨脅迫時間延長逐漸降低[18]。本試驗中超氧化物歧化酶低溫處理后出現(xiàn)下降,野生型明顯低于沉默組,可能低溫處理5 d后,沉默組植株啟動自我保護機制,清除體內(nèi)過量的活性氧。低溫后野生型植株過氧化物酶活性升高,而沉默組過氧化物酶活性低于常溫條件,可能是因為植株受到脅迫,POD活性降低。

丙二醛是植物體內(nèi)膜脂過氧化產(chǎn)生的有毒物質(zhì)。因此,MDA含量是膜脂過氧化的一個重要指標,代表植物膜的傷害程度。[19]。張靜等試驗探究了不同耐寒性的番茄品種在低溫脅迫下丙二醛和葉綠素含量的變化和差異,結果顯示,MDA含量隨脅迫時間增加累積,耐寒性強的品種中MDA含量變化較緩慢[20]。而游離脯氨酸是植物體內(nèi)一種維持細胞滲透壓平衡的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。羅丹等探究了低溫脅迫下脯氨酸代謝相關關鍵酶的活性及脯氨酸含量的變化,結果表明脯氨酸含量在低溫初期先升高,之后逐漸降低,相關酶活性趨勢相同,與脯氨酸積累呈正相關[21]。本試驗中未低溫處理時基因沉默組、空載組及野生型指標差異不大,低溫處理后,基因沉默組可溶性蛋白含量低于對照組和空載組,丙二醛含量明顯高于野生型和對照組,說明基因沉默后植株受冷害損傷程度更重。低溫處理5 d時野生型和空載組植株脯氨酸含量大幅上升,而基因瞬時沉默組脯氨酸含量較0 d僅有小幅度上升,可能MYB44-like基因沉默后影響了脯氨酸的代謝,植株抗寒性降低,細胞受損,不能及時調(diào)節(jié)滲透平衡。陽性植株生理指標測定結果表明,在低溫脅迫下,基因沉默組植株的脯氨酸含量和可溶性蛋白含量均低于野生型,而丙二醛含量高于野生型,說明低溫脅迫后基因沉默組植株細胞受損程度更嚴重,因此SlMYB44-like基因沉默降低了番茄植株的抗寒性。初步認為番茄SlMYB44-like轉錄因子響應低溫脅迫,參與植株低溫脅迫應答與調(diào)控。

4 結論

本研究構建了pTRV2-SlMYB44-like沉默載體并侵染番茄幼苗,獲得基因沉默植株,通過測定基因沉默植株低溫處理后的生理指標進行抗寒性分析,結果顯示SlMYB44-like基因沉默降低了番茄植株的抗寒性。表明SlMYB44-like基因響應了低溫脅迫,參與植物體低溫脅迫應答調(diào)控過程。本結果進一步探究了SlMYB44-like基因的功能,為番茄抗寒育種提供理論基礎。