中國抗癌協(xié)會腫瘤與微生態(tài)專業(yè)委員會

腸道微生態(tài)（intestinal microecology，IM）的多樣性和生物功能與各種疾病之間關(guān)系的研究越來越多，并逐漸向臨床轉(zhuǎn)化[1-3]。較傳統(tǒng)方法，采用糞菌移植（fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT）、腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)劑、基因工程細菌等微生態(tài)治療策略在難治性艱難梭菌感染（Clostridioides difficile infection，CDI）、炎癥性腸病、移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GVHD）等疾病的治療有更好的療效[4-5]。腸道微生物對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及治療反應(yīng)等方面均有重要影響，通過檢測腸道菌群能夠及時發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)的菌群異常，對預(yù)防和治療疾病都有重要的意義。IM 維持宿主免疫系統(tǒng)功能，在控瘤藥物治療中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6-7]。

1 IM 檢測技術(shù)概況

目前，IM 檢測方法主要有16S rRNA 測序、元基因組測序和基于納米孔測序的全長基因測序。16S rRNA 測序相對簡便，成本較低，元基因組測序涵蓋范圍更全面，能鑒定微生物到菌株水平。隨著NGS 技術(shù)快速發(fā)展，越來越多微生物16S rRNA 序列能夠被測定并收錄入國際基因數(shù)據(jù)庫中，16S rRNA 基因成為系統(tǒng)進化分類學研究中最常用的分子標記，廣泛用于微生物生態(tài)學研究。通過提取樣品中DNA，特異性擴增某個或兩個連續(xù)高變區(qū)，采用高通量測序平臺對高變區(qū)序列測序，然后通過生物信息學行序列分析和物種注釋，可了解樣品群落組成；進一步通過alpha 多樣性和beta 多樣性分析以進一步比較樣品間差異性?；诩{米孔技術(shù)的16S 測序，可設(shè)計引物覆蓋整個16S 基因，甚至整個核糖體操縱子。納米孔測序在準確分辨更多物種方面優(yōu)于傳統(tǒng)測序平臺[8-9]。

元基因組測序指對環(huán)境樣品中微生物群落的基因組進行高通量測序，除細菌外，還可覆蓋真菌、病毒和寄生蟲等。元基因組在分析微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)和進化關(guān)系基礎(chǔ)上，進一步探究IM 功能活性、菌間協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境間的關(guān)系，發(fā)掘潛在生物學意義。與傳統(tǒng)微生物研究方法比，元基因組測序擺脫了微生物分離純培養(yǎng)的限制，克服了未知微生物無法檢測的缺點，擴展了微生物檢測與利用空間，因此近年在微生物組學研究中得到廣泛應(yīng)用。對特定患者如CDI、化療后粒細胞缺乏應(yīng)用廣譜抗生素后腹瀉患者及擬行糞菌移植或益生菌預(yù)防或治療患者，推薦選擇更深入的微生物檢測，其中16S rRNA 測序相對簡便，結(jié)合保守區(qū)和高變區(qū)設(shè)計引物，成本較低。部分帶有分類信息的區(qū)域在被分析的擴增子之外，該方法在鑒定分辨能力上有所降低。元基因組測序在菌種水平和菌株水平鑒定更有優(yōu)勢，涵蓋范圍更全面，除細菌外，還可鑒定真菌、病毒和寄生蟲等，可鑒定無法培養(yǎng)及未知的微生物[10]。

2 IM 檢測技術(shù)流程

2.1 檢測流程

IM 檢測流程較為復(fù)雜，涉及標本采集和管理、核酸提取、文庫制備、上機測序、數(shù)據(jù)分析和質(zhì)控等多個過程，檢測結(jié)果受多方面因素影響（圖1）。標本采集建議在糞便內(nèi)部位置多點取樣，既可避免污染，又能更真實地反映腸道內(nèi)部的微生物情況；為保證腸道菌群穩(wěn)定性，建議取樣后立即加入腸菌保藏液，保藏液可迅速裂解腸道菌群以達固定作用，避免腸菌體外增殖會大大改變腸道菌群原始狀態(tài)，保藏液可幫助腸菌在常溫下一周內(nèi)保持穩(wěn)定。

圖1 標本采集流程圖

2.2 核酸提取及文庫制備

應(yīng)使用經(jīng)過性能確認的核酸提取試劑，推薦使用商品化的DNA 抽提試劑盒，建立完整核酸檢測流程，確保提取方法可重復(fù)性和提取效率。DNA 降解程度和各種雜質(zhì)污染均會對檢測靈敏度造成影響，通過測定核酸濃度、純度和完整性，制定合格樣本標準。操作過程嚴格遵守無菌操作，污染防控對標本檢測結(jié)果的質(zhì)控至關(guān)重要。每批實驗需包括內(nèi)參照、陰性對照品和陽性對照品。DNA 合格樣本參考：DNA A260/A280 在1.7～1.9，A260/A230＞2，DNA 質(zhì)量可用1%瓊脂糖凝膠電泳驗證（無拖尾、無雜帶、無蛋白污染）。DNA 完整性可用分析儀等檢測，如大部分片段低于200 nt，說明DNA 降解嚴重，需重提DNA[11]。

文庫制備流程包括核酸片段化、末端修復(fù)、標簽接頭連接和PCR 文庫等。文庫制備對核酸樣本有嚴格要求，每次提取核酸樣本需定量檢測，起始核酸量定量≥0.1 ng/μL，確保核酸滿足實驗要求。若不滿足重新提取核酸或再次送檢樣本。目前常用建庫方法有酶切建庫、超聲波打斷建庫及轉(zhuǎn)座酶建庫等。推薦使用經(jīng)性能確認的建庫試劑或商品化建庫試劑盒。文庫質(zhì)量直接影響測序數(shù)據(jù)質(zhì)量，文庫DNA 質(zhì)量合格參考：A260/A280 在1.75～2.00，文庫濃度≥1 ng/μL，若不滿足需重新構(gòu)建文庫。此外，還應(yīng)使用Agilent 2100 或其他生物分析儀器檢測文庫片段大小及峰型，合格文庫插入片段長度大于100 bp，文庫應(yīng)有明顯主峰、無雜峰、無引物二聚體、無接頭。若不滿足重新構(gòu)建文庫或重新提取，如仍不合格需重新送檢樣本。文庫定量目前常用Qubit 熒光計、實時熒光定量PCR 等。推薦使用實時熒光定量PCR 方法，可使用NGS 定量PCR 檢測試劑盒[12]。

2.3 上機測序及生物信息學分析

目前國內(nèi)實驗室常用NGS 測序平臺有Illumina、Thermo Fisher 和MGI 等，各平臺有不同型號設(shè)備配置。測序前需根據(jù)測序平臺確定相應(yīng)數(shù)據(jù)參數(shù)，并據(jù)測序片段長度、檢測標本數(shù)量、標本質(zhì)量和最低測序深度等選用合適芯片，以保證測序結(jié)果數(shù)據(jù)質(zhì)量合格。推薦使用商品化的上機試劑盒。檢測過程中，分別根據(jù)所用芯片容量、構(gòu)建文庫片段大小等指標判斷所得讀長總數(shù)、測序平均讀長等數(shù)據(jù)是否合理。不同測序平臺的參數(shù)要求有差異。16S rRNA 測序常用PCR技術(shù)對16S rRNA 的V2、V3、V4、V6、V7、V8、V9高變區(qū)行擴增，擴增產(chǎn)物行定量，經(jīng)末端修復(fù)后加特異性接頭行擴增，完成測序文庫構(gòu)建。檢查腸道菌群16S 測序質(zhì)控合格標準：片段長度在200、250、300 bp左右處有3 個峰。元基因組測序是通過對微生物基因組隨機打斷，然后在片段兩端加入接頭進行擴增，文庫片段主峰在300～500 bp，上機測序后通過組裝的方式將小片段拼接成較長的序列[12]。測序序列長度直方圖示例見圖2。

圖2 測序序列長度直方圖

生物信息學分析主要是對測序產(chǎn)生原始數(shù)據(jù)進行處理和分析，包括數(shù)據(jù)質(zhì)控、微生物物種檢測等過程。IM 檢測可選擇具有商業(yè)化自動分析的系統(tǒng)，實驗室也可選擇與國際同步的算法和軟件，搭建實驗室個性化分析流程。微生物檢測數(shù)據(jù)庫包含細菌、真菌、病毒和寄生蟲基因組序列信息，其中支原體、衣原體、螺旋體和立克次體視情況可獨立也可并入細菌類別中。公共數(shù)據(jù)庫需驗證后方可使用。構(gòu)建微生物數(shù)據(jù)庫應(yīng)優(yōu)先選擇全長參考基因組及測序質(zhì)量高、樣本來源、臨床信息完整序列。流程中所用各種試劑也可能存在微生物個體或核酸，應(yīng)建立試劑背景微生物序列數(shù)據(jù)庫[13]。針對OTU 聚類分析有較多升級方法，UCHIME嵌合體檢測算法整合了UPARSE 算法和UCHIME算法，相較于此前聚類方法有較大進步。生成OTU除聚類方法，還有降噪方法，對16S 等擴增子測序結(jié)果的確認逐漸從UPARSE 算法轉(zhuǎn)向DADA2 算法，采用DADA2 算法進行聚類獲得ASV 表格，針對ASV表格可以展開豐富的分析流程。不同樣本對應(yīng)的reads 數(shù)量差距較大，為避免因樣本測序數(shù)據(jù)大小不同造成分析偏差，在樣品達到足夠測序深度情況下，對每個樣品進行隨機抽平處理。物種累積曲線用于描述隨著抽樣量加大而物種增加的情況，是調(diào)查物種組成和預(yù)測物種豐度的有效工具。

物種豐度分析是根據(jù)物種注釋結(jié)果，在不同等級對各樣品做物種profiling 相應(yīng)的柱狀圖，可以直觀查看各樣品在不同分類等級上相對豐度較高的物種及其比例。Heatmap 是一種以顏色梯度表示數(shù)據(jù)矩陣中數(shù)值大小，并根據(jù)物種豐度或樣品相似性進行聚類的圖形展示方式。聚類加上樣品的處理或取樣環(huán)境等分組信息，可幫助直觀地處理相同或相似環(huán)境樣品的聚類情況，并直接反應(yīng)樣品群落組成的相似性和差異性。此項分析內(nèi)容可分別在不同分類水平進行Heatmap聚類分析。物種累積曲線示例見圖3，橫坐標表示樣品的數(shù)量，縱坐標表示OTUs 的數(shù)量；由該曲線圖可以判斷抽樣量是否充分，在抽樣量充分的前提下，運用物種累積曲線還可以對物種豐度進行預(yù)測。

圖3 物種累積曲線

Alpha 多樣性是對單個樣品中物種多樣性和物種豐度的分析，使用相關(guān)軟件計算樣品的alpha 多樣性指數(shù)值，并作出相應(yīng)稀釋曲線，樣本間物種豐度分布差異程度可通過統(tǒng)計學中的距離進行量化分析，使用統(tǒng)計算法計算兩樣本間距離，獲得距離矩陣，可用于后續(xù)beta 多樣性分析和可視化統(tǒng)計分析。樣品測序深度alpha 多樣性稀疏曲線圖示例見圖4，橫坐標表示抽取的reads 數(shù)，縱坐標表示相應(yīng)的alpha 多樣性指數(shù)值，圖中一種顏色代表一組樣品，測序條數(shù)不能覆蓋樣品時，曲線上升；測序條數(shù)增加到覆蓋樣品中的大部分微生物時，曲線呈平緩趨勢。

圖4 樣品測序深度alpha 多樣性稀疏曲線圖

3 腫瘤治療相關(guān)IM 損傷

IM 可在防御感染中發(fā)揮作用，化療會造成機體微生物組的破壞，增加微生物侵入性感染風險，恢復(fù)IM 組成是降低該風險的潛在策略。IM 可致定植抗性，通過共生細菌產(chǎn)生的細菌素/抗菌肽及其他蛋白質(zhì)對細菌細胞壁的攻擊等途徑殺死致病菌和其他競爭微生物。IM 改變在腫瘤治療中的影響越來越受到重視。胃腸道反應(yīng)是實體瘤及血液腫瘤患者化療后的常見臨床表現(xiàn)，增加患者治療風險，影響療效及預(yù)后?；熀笙腊Y狀包括惡心、嘔吐、厭食，嚴重的口腔及腸道黏膜炎、腹痛、腹瀉、便秘，常與化學藥物劑量及毒性密切相關(guān)；患者高齡、免疫功能低下、中性粒細胞減少及骨髓抑制，尤其合并特殊致病微生物感染的復(fù)雜臨床情況下，開展消化道IM 檢測、指標監(jiān)測及對抗生素應(yīng)用的影響尤其重要。需針對化療后口腔及胃腸道癥狀、消化系統(tǒng)并發(fā)癥的主要治療策略做出不同強度的推薦，包括大多數(shù)非感染性和感染性并發(fā)癥的治療以及相應(yīng)的護理措施，結(jié)合IM 檢測、中醫(yī)藥、FMT 的應(yīng)用等，可為腫瘤與微生態(tài)領(lǐng)域的深入研究提供依據(jù)[14-15]。

3.1 化療所致IM 損傷相關(guān)的嘔吐及黏膜炎

化療所致惡心嘔吐是治療中的主要不良反應(yīng)，預(yù)先判斷化療藥物可能導(dǎo)致的嘔吐對患者整體治療具重要意義。化療藥物方案使用前需多學科整合診治（MDT to HIM）討論決定，詳細閱讀化療藥物說明書，接受常規(guī)劑量化療患者約40% 會出現(xiàn)口腔黏膜炎。造血干細胞移植者，接受預(yù)處理患者黏膜炎發(fā)生率可達80%～95%。化療藥物、劑量、給藥途徑、頻率及患者耐受性等多種因素均可能與黏膜炎相關(guān)，如有繼發(fā)性或定植微生物感染，黏膜炎時間可能延長。黏膜炎發(fā)生的病理機制包含一系列階段：啟動-放化療通過直接作用損傷DNA，促炎癥細胞因子的產(chǎn)生；上調(diào)-啟動階段的損傷激活NF-κB 途徑；反饋環(huán)路放大信號傳導(dǎo)。此3 個階段發(fā)生于臨床上顯著的黏膜炎出現(xiàn)之前，隨后是潰瘍和炎癥及愈合，時間為10～14 天[16-17]。

3.2 化療所致IM 損傷相關(guān)的持續(xù)性腹瀉

化療相關(guān)性腹瀉（chemotherapy-related diarrhea，CRD）是腫瘤患者治療后常見癥狀，嚴重影響日常生活質(zhì)量。重度CRD 常需住院治療，甚至可能因脫水和感染而危及生命。腹瀉最常見于使用化療藥物（如氟尿嘧啶和卡培他濱）、某些分子靶向藥（如索拉非尼、舒尼替尼）以及免疫檢查點抑制劑（如伊匹木單抗、納武利尤單抗和帕博利珠單抗）。應(yīng)針對CRD 并發(fā)癥和病因：若存在重度（3 級或4 級）腹瀉，持續(xù)性輕至中度（1 級或2 級）腹瀉，或腹瀉伴中性粒細胞減少、發(fā)熱或大便帶血，需血液和大便培養(yǎng)、艱難梭菌產(chǎn)毒菌株檢查；血性腹瀉需糞便培養(yǎng)及檢測腸出血型大腸埃希菌、志賀毒素；對有發(fā)熱、腹膜刺激征或血性腹瀉者，應(yīng)做腹部和盆腔CT 掃描，并請外科醫(yī)生會診。絕大多數(shù)患者無需內(nèi)鏡檢查，對難治性患者和慢性腹瀉（即整個化療周期持續(xù)存在腹瀉）或血性腹瀉患者應(yīng)考慮內(nèi)鏡檢查?；熎陂g腹瀉需鑒別其他病因，包括脂肪或膽汁酸吸收不良、乳糖不耐受、小腸細菌過度生長及感染性原因[18-20]。

治療推薦：預(yù)防初始非藥物措施包括避免可能加重腹瀉的食物，攝入半流質(zhì)膳食及口服補液，避免含乳糖的食物，停用導(dǎo)致腹瀉的藥物如大便軟化劑、瀉藥。推薦CRD 的初始治療為洛哌丁胺，輕至中度無并發(fā)癥的CRD，建議初始劑量為4 mg，之后2 mg/4 h；重度腹瀉患者可使用大劑量洛哌丁胺（最初4 mg，之后每2 mg/2 h）。洛哌丁胺治療無效的CRD 患者推薦奧曲肽，初治劑量為1 次100 μg 或150 μg，3 次/d，皮下注射。對有發(fā)熱、中性粒細胞減少、低血壓、腹膜刺激征或血性腹瀉的患者，應(yīng)給予靜脈用抗生素。洛哌丁胺和大劑量奧曲肽治療后腹瀉仍未停止建議行上消化道內(nèi)鏡或膠囊胃鏡檢查，可選擇小腸膠囊內(nèi)鏡檢查，觀察整個小腸黏膜包括出血、惡性腫瘤和黏膜損傷等情況，并行病理組織活檢以評估是否存在巨細胞病毒或CDI。重度CRD 患者在無腹瀉48 h 且無需使用止瀉藥48 h 后，才能恢復(fù)相同化療方案。所有在先前治療周期中出現(xiàn)2 級或更重腹瀉者，應(yīng)減少化療劑量。鑒于腸道腹瀉與IM 對腫瘤化療過程的影響，建議在開展化療及造血干細胞移植前、后檢測IM 變化。

4 造血干細胞移植相關(guān)IM 損傷

隨著異基因造血干細胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）的廣泛開展和新型免疫抑制劑的使用，病原微生物感染、抗生素耐藥對移植工作造成了極大的不良影響。IM 對宿主具多種作用，如影響宿主免疫系統(tǒng)發(fā)育，影響食物消化、必需氨基酸、次生代謝產(chǎn)物、短鏈脂肪酸和維生素的合成，調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)等。造血干細胞移植（HSCT）過程中，由于預(yù)防和治療性抗生素、腸道炎癥和飲食變化，IM 多樣性顯著降低，可引起疼痛、惡心嘔吐和腹瀉?；颊逪SCT 后主要導(dǎo)致消化道癥狀腹瀉的原因較多，包括消化道黏膜炎、重度血細胞減少相關(guān)感染、GVHD 等。HSCT 過程中，預(yù)處理及使用預(yù)防性抗生素，機體原有腸道菌群構(gòu)成發(fā)生改變，共生菌減少、菌群多樣性減少，造成微生態(tài)失衡或菌群易位。隨著宏基因組學、轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學、代謝組學等組學技術(shù)飛速發(fā)展，腸道菌群已被證實在腸道穩(wěn)態(tài)和免疫調(diào)節(jié)中起至關(guān)重要作用，是接受allo-HSCT 患者臨床結(jié)局的預(yù)測指標[21-23]。

4.1 移植前預(yù)處理引起IM 失調(diào)

移植前預(yù)處理包括大劑量化療方案（如白消安/環(huán)磷酰胺方案）以及帶有全身照射的方案（如環(huán)磷酰胺/全身照射方案）易損傷腸黏膜上皮細胞，使腸黏膜屏障功能受損。大劑量化放療抑制機體細胞免疫及體液免疫功能，導(dǎo)致免疫調(diào)控異常，通過促進細菌轉(zhuǎn)位和全身炎癥反應(yīng)，增加患者感染風險，改變腸道菌群組成從而發(fā)生菌群失調(diào)，腸道菌群易穿透受損腸黏膜，引起異常免疫反應(yīng)，活化T 淋巴細胞，促進炎癥介質(zhì)釋放，造成胃腸黏膜屏障受損，從而損傷胃腸道等靶器官[24-25]。預(yù)處理化療過程中，化療藥物和預(yù)防性抗生素的使用，使腸道菌群的多樣性和穩(wěn)定性遭到破壞，造成腸道原有菌群失衡或菌群易位，甚至出現(xiàn)細菌腸道支配。腸道菌群中占支配地位的細菌包括短鏈脂肪酸的產(chǎn)生菌（如芽孢桿菌、布魯氏菌等）和專門發(fā)酵寡糖的菌種（如雙歧桿菌等）。臨床上，腸道內(nèi)各種微生物群的定植或易位常先于感染發(fā)生，是引起菌血癥和膿毒血癥常見原因之一[26]。

4.2 抗生素應(yīng)用與移植后CDI

系統(tǒng)性使用廣譜抗生素常用于allo-HSCT 中治療感染性并發(fā)癥，早期使用抗生素治療可能會抑制腸道菌群中保護性梭菌，但在停止抗生素治療后能迅速恢復(fù)微生物群多樣性。allo-HSCT 中出現(xiàn)中性粒細胞缺乏伴發(fā)熱時接受抗厭氧菌抗生素（如哌拉西林他唑巴坦或碳青霉烯）與僅接受極少量抗生素患者之間的GVHD 發(fā)生率及死亡率均增加，使用抗厭氧菌抗生素會致腸道菌群多樣性水平降低，尤其雙歧桿菌和梭狀芽胞桿菌豐度降低。接受allo-HSCT 患者中常見感染病原體是革蘭陰性菌（腸桿菌科）和革蘭陽性菌（葡萄球菌屬），識別和監(jiān)測患者中此類病原體有助于合理選擇抗生素。艱難梭菌是一種常見腸道感染病原體，約1/3 移植患者發(fā)生CDI 是由于廣譜抗生素的使用影響了腸道固有菌群，尤其是對梭狀芽孢桿菌的抑制。在allo-HSCT 時預(yù)防性和治療性使用抗生素會影響腸道菌群多樣性，進而增加耐藥菌感染風險[27]。CDI是allo-HSCT 后非常見并發(fā)癥之一，CDI 除可引起局部炎癥反應(yīng)，是發(fā)生GVHD 的啟動因素。這是因為CDI 可促使腸黏膜釋放細胞因子和促進內(nèi)毒素轉(zhuǎn)運、主要組織相容性復(fù)合體表達和免疫共刺激分子上調(diào)，從而激活移植物中供者T 淋巴細胞釋放更多炎性因子，形成細胞因子風暴，誘使GVHD 發(fā)生。因此，CDI患者，即使病情輕微也應(yīng)積極處理，防止GVHD 發(fā)生而使病情復(fù)雜化?？煽紤]使用益生菌糾正IM 失衡以預(yù)防CDI[28]。

5 IM 技術(shù)在allo-HSCT 中應(yīng)用

腸道菌群失衡可導(dǎo)致allo-HSCT 患者合并感染、疾病復(fù)發(fā)、GVHD 并可能延遲免疫重建，縮短總體生存期。allo-HSCT 過程中的各個環(huán)節(jié)及因素均可能影響到腸道菌群的多樣性。改善allo-HSCT 后腸道菌群的策略主要包括調(diào)整抗生素、使用益生菌或益生元、FMT 等[29-30]。

5.1 益生菌使用

allo-HSCT 后使用抗生素殺滅致病菌同時會造成人體正常微生物群傷害，導(dǎo)致微生物物種和菌株多樣性喪失，且不同抗生素對微生物群造成的影響不同，其中廣譜抗生素影響最大，會引起微生物群多樣性的長期匱乏，應(yīng)盡量選擇窄譜抗生素，同時減少抗生素的使用時間，以保護allo-HSCT 后腸道環(huán)境。益生菌策略包括直接注入胃腸道內(nèi)一種或多種有益微生物菌株，可通過經(jīng)結(jié)腸鏡或保留灌腸實施。益生元是難消化化合物，通常是低聚糖，在影響共生細菌代謝方面具優(yōu)勢。益生元可口服或給予胃內(nèi)營養(yǎng)補充。應(yīng)用益生元可能減輕allo-HSCT 患者的黏膜損傷并緩解GVHD。患者可在移植前的腸道準備開始至移植造血重建后口服益生元混合物，可能會減輕胃腸道黏膜的損傷，降低急性GVHD 等級和發(fā)生率，同時降低皮膚急性GVHD累積發(fā)生率。通過益生元攝入可保留產(chǎn)生丁酸鹽的細菌種群，維持腸道菌群多樣性。

5.2 急性胃腸道GVHD 診治

GVHD 指由異基因供者細胞與受者組織發(fā)生反應(yīng)導(dǎo)致的臨床綜合征，經(jīng)典急性GVHD 一般指發(fā)生在移植后100 天以內(nèi)，且主要表現(xiàn)為皮膚、胃腸道和肝臟等器官的炎性反應(yīng)。胃腸道是急性GVHD 常見的靶器官，上消化道和下消化道均可累及，上消化道急性GVHD 主要表現(xiàn)為厭食消瘦、惡心嘔吐，下消化道急性GVHD 表現(xiàn)為水樣腹瀉、腹痛、便血和腸梗阻，下消化道急性GVHD 與移植后非復(fù)發(fā)相關(guān)死亡密切相關(guān)。一線治療為糖皮質(zhì)激素，最常用甲潑尼龍，起始劑量1～2 mg/kg/d，控制后緩慢減少糖皮質(zhì)激素用量，一般每5～7 天減量甲潑尼龍10～20 mg/d，4 周減至初始量的10%。若判斷為糖皮質(zhì)激素耐藥，需加用二線藥物，并減停糖皮質(zhì)激素，如判斷為糖皮質(zhì)激素依賴，二線藥物起效后減停糖皮質(zhì)激素。二線治療原則上在維持環(huán)孢素A 有效濃度基礎(chǔ)上加用二線藥物如抗白細胞介素2 受體單抗、蘆可替尼等，其他藥物和治療包括甲氨蝶呤、霉酚酸酯、他克莫司、西羅莫司、抗人胸腺淋巴細胞球蛋白、間充質(zhì)干細胞、FMT 等[31-32]。

6 FMT 技術(shù)

FMT 是重建IM 的有效方法，是指將健康人糞便中的功能菌群處理以后移植到患者腸道內(nèi)，重建新的腸道菌群，恢復(fù)腸道菌群的多樣性，實現(xiàn)腸道內(nèi)外疾病的治療[33]。其途徑包括經(jīng)口服糞菌膠囊，經(jīng)鼻胃管、鼻空腸管、胃十二指腸鏡、腸鏡及造瘺口給予糞菌懸液等，新的FMT 途徑經(jīng)內(nèi)鏡結(jié)腸植管通過普通腸鏡檢查至回盲部，沿活檢孔插入經(jīng)內(nèi)鏡結(jié)腸植管將糞菌懸液送入導(dǎo)管至回盲部，這種新的移植途徑相比于傳統(tǒng)的移植途徑，更加簡單經(jīng)濟，并且可以全結(jié)腸給藥，方便短期內(nèi)多次重復(fù)的治療[34]。FMT 制備和質(zhì)控流程見圖5。

圖5 FMT 制備和質(zhì)控流程圖

6.1 供體的篩選和管理

FMT 的安全性和有效性依賴于供體，作為FMT的生產(chǎn)原料，合適的供體篩選及管理程序至關(guān)重要，這樣才能保證供體生物安全性。在供體篩選及管理的過程中會涉及候選人/供體的隱私信息，需要對候選人進行知情同意、信息脫敏、篩選和對供體進行管理。供體篩選是一個非常嚴格的過程，包括問卷初篩、現(xiàn)場面試、全面體檢和醫(yī)學核查4 個階段，一般選擇青年供體，這樣才能使供體的功能狀態(tài)和身心健康得到保障。為了保證FMT 的安全性，供體的篩選需要有嚴格的標準，需要同時兼顧供體的健康狀況、依從性以及供體腸道菌群的多樣性和穩(wěn)定性[35]。供體的健康至關(guān)重要，需保證供體無感染性疾病或任何可能在FMT 中傳染給受體的病毒或致病菌。供體管理的流程包含供體健康管理、外出管理，捐贈管理、捐贈有效期管理、放行管理等。為了及時且持續(xù)地掌握供體的健康狀態(tài)，應(yīng)設(shè)置定期回訪健康管理機制。供體協(xié)調(diào)員應(yīng)每周定期和供體溝通確認，了解供體近1 周的身體健康狀況。向供體強調(diào)有任何身體不適都需要及時告知。對于處于非健康狀態(tài)的供體，需根據(jù)對應(yīng)情況和篩選標準，安排供體復(fù)檢或淘汰。

6.2 腸道菌群檢測

腸道菌群檢測的結(jié)果可用于指導(dǎo)FMT 的實施，F(xiàn)MT 效果往往是由疾病特點，供體和患者的生理狀態(tài)及菌群特點決定的。另外，即便被診斷為同一種疾病，不同患者可能具有不同的發(fā)病機制和特征。因此，根據(jù)疾病特點選擇菌群相匹配的供體與患者，有助于最大化提升FMT 的治療效果[36]。目前，普遍接受的腸道菌群檢測，是對糞便樣本中的腸道菌群進行DNA 檢測。對于供體腸道菌群的了解，需要采集供體的糞便樣本，提取DNA，進行16S V4 區(qū)域測序和宏基因組測序，分析每個候選人腸道菌群結(jié)構(gòu)、多樣性、代謝途徑等信息。16S rRNA 檢測成本較低，需要的DNA 含量較少，且分析流程較為簡單，但是能夠從數(shù)據(jù)中獲取的信息也比較有限，其僅能深入到細菌的屬水平，無法檢測菌種水平以及細菌以外的微生物；無基因功能信息，僅能基于算法模型和公共數(shù)據(jù)庫對菌的功能進行粗略的預(yù)測。宏基因組測序成本較高，所需DNA 含量略多，分析流程復(fù)雜且對計算資源要求較高，但是能夠從樣本中獲取豐富的信息。

6.3 供受體配型

FMT 通過對患者的腸道微生態(tài)重建以達到對疾病的治療和改善。由于其成分復(fù)雜且高度依賴于供體捐贈的樣本，F(xiàn)MT 在各個適應(yīng)證里的作用機制和實現(xiàn)的效果并不相同。提升FMT 的治療效果，可以從供體以及患者兩個方面切入，尋求兩者的最佳組配?？梢愿鶕?jù)疾病特有的IM 特點以及菌-宿主的作用模式來挑選有效供體的菌或代謝物的指標[37]，或構(gòu)建預(yù)測模型尋找匹配最優(yōu)的供體和患者，構(gòu)建包含多個維度的微生物特征（如alpha 多樣性、群落距離、有益菌、有害菌、有益代謝通路以及有害代謝通路）在內(nèi)的預(yù)測模型[38]，供受體配型的方法開發(fā)，研究FMT 所應(yīng)用的疾病特點，同時還應(yīng)考慮，該疾病是因為某些病原菌感染導(dǎo)致的，還是因為腸屏障受損引發(fā)，或是體內(nèi)的免疫、代謝或神經(jīng)遞質(zhì)失衡引起的；是否具有細分的疾病亞型，這些亞型是否對應(yīng)不同的FMT 干預(yù)效果。另外，可以針對相關(guān)適應(yīng)證中的關(guān)鍵菌或功能進行研究，如關(guān)鍵菌是參與短鏈脂肪酸的生成，改善腸屏障，還是調(diào)控糖脂代謝、線粒體功能，或作用于特定的免疫細胞；也需注意相關(guān)適應(yīng)證是否有菌的產(chǎn)物或營養(yǎng)物質(zhì)代謝相關(guān)的基因功能指標。研究供體的腸道菌群特點，從供體的基礎(chǔ)指標（年齡、性別、BMI、飲食特點等）和菌的特征及菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性等角度優(yōu)選最有可能產(chǎn)生效果的供體；不斷累積臨床數(shù)據(jù)，并根據(jù)治療結(jié)果不斷迭代受體和供體選擇方法。供體和受體特定菌種不同菌株的相容性以及供體特定菌株的定植也可納入考察并指導(dǎo)對受體和供體的選擇[39-40]。

中國抗癌協(xié)會腫瘤與微生態(tài)專業(yè)委員會指南編委會主任委員：

譚曉華 深圳市第三人民醫(yī)院

副主任委員：

王 強 武漢科技大學醫(yī)學院

于 君 香港中文大學醫(yī)學院

張發(fā)明 南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院

任 軍 復(fù)旦大學附屬浦東醫(yī)院

郭 智 華中科技大學協(xié)和深圳醫(yī)院

委員（以姓氏拼音排序）：

安江宏 深圳市第三人民醫(yī)院

陳 豐 華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢中心醫(yī)院

陳 鵬 解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心

鄧麗娟 北京大學腫瘤醫(yī)院

鄧啟文 華中科技大學協(xié)和深圳醫(yī)院

付 廣 武漢科技大學附屬普仁醫(yī)院

黃自明 湖北省婦幼保健院

黃慧強 中山大學附屬腫瘤醫(yī)院

胡偉國 武漢大學人民醫(yī)院

李小安 綿陽市中心醫(yī)院

李志銘 中山大學附屬腫瘤醫(yī)院

梁 婧 山東第一醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院

劉 智 華中科技大學生命科學與技術(shù)學院

劉 哲 天津大學醫(yī)學部

孟景曄 深圳市第三人民醫(yī)院

皮國良 湖北省腫瘤醫(yī)院

喬明強 山西大學生命科學學院

祁小飛 蘇州大學附屬第一醫(yī)院

任 驊 中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院

邵 亮 武漢大學中南醫(yī)院

沈鶴霄 華中科技大學生命科學與技術(shù)學院

舒 榕 湖北省第三人民醫(yī)院

孫志強 南方醫(yī)科大學深圳醫(yī)院

唐菲菲 北京大學人民醫(yī)院

王 華 中山大學附屬腫瘤醫(yī)院

王 亮 首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院

王 鈞 香港大學深圳醫(yī)院

吳清明 武漢科技大學醫(yī)學院

吳 為 廣東省公共衛(wèi)生研究院

解 奇 山東第一醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院

夏忠軍 中山大學附屬腫瘤醫(yī)院

許曉軍 中山大學附屬第七醫(yī)院

楊文燕 山東第一醫(yī)科大學

殷 茜 華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院

張利玲 華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院

張幸鼎 中山大學醫(yī)學院

張 鈺 南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院

朱寶利 中國科學院微生物研究所

朱艷麗 新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院

周 浩 華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院

周 輝 湖南省腫瘤醫(yī)院

執(zhí)筆人：

郭 智 華中科技大學協(xié)和深圳醫(yī)院

王 鈞 香港大學深圳醫(yī)院

王 強 武漢科技大學醫(yī)學院

本文無影響其科學性與可信度的經(jīng)濟利益沖突。