谷明西, 王常成, 田豐德, 郝瑞胡, 安 寧, 郭 林

(1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院 內(nèi)科,深圳 518000; 2.大連理工大學(xué) 醫(yī)學(xué)部,大連 116081; 3.大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院 膝關(guān)節(jié)與骨腫瘤科,大連 116001)

關(guān)節(jié)軟骨主要由嵌有軟骨細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix,ECM)組成,具有承載和緩沖作用,覆蓋和保護(hù)骨骼免受數(shù)倍于身體質(zhì)量的承重力的影響[1]。與大多數(shù)其他組織不同,軟骨組織結(jié)構(gòu)特殊,由于缺乏血管化和神經(jīng)支配,軟骨細(xì)胞少、增殖能力低,導(dǎo)致軟骨損傷后的自我修復(fù)能力差,當(dāng)損傷從軟骨表層延伸到軟骨下骨時(shí),即發(fā)生全層軟骨缺損(Full-Thickness Cartilage Defect,FTAC)[2]。組織工程(Tissue Engineering,TE)是一種結(jié)合了工程學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的跨學(xué)科方法,旨在恢復(fù)、改善和維持組織功能[3],已成為軟骨組織再生和重建最常用的方法之一。種子細(xì)胞、支架材料及生長(zhǎng)因子是制約軟骨組織工程的三個(gè)關(guān)鍵性制約因素,其中作為組織形成模板的支架材料在TE中起著最重要的作用[4]。

絲素蛋白(Silk Fibroin,SF)是一種具有出色機(jī)械性能、生物降解性、生物相容性和生物可吸收性的天然蛋白質(zhì)[5]。殼聚糖(Chitosan,CS)是唯一帶正電荷的天然多糖,與ECM中發(fā)現(xiàn)的葡糖胺聚糖(Glycosaminoglycan,GAGs)相似,不僅能夠與帶負(fù)電的GAG發(fā)生靜電相互作用,而且還能促進(jìn)軟骨特異性蛋白表達(dá)[6]。明膠(Gelatin,Gel)是膠原蛋白的水解產(chǎn)物,具有高度的親水性和出色的生物相容性,這有助于支架中的營(yíng)養(yǎng)輸送和細(xì)胞黏附[7]。羥基磷灰石(Hydroxyapatite,Hap)是天然骨骼的礦物質(zhì)成分,具有骨傳導(dǎo)特性、骨誘導(dǎo)特性、骨結(jié)合能力和原位降解緩慢等優(yōu)勢(shì),已成功應(yīng)用于臨床骨修復(fù)[8]。然而由單一成分制成的支架在水和生理?xiàng)l件下的穩(wěn)定性差,因此,可以將兩種或多種聚合物混合以獲得新材料[9-10]。

本研究為了構(gòu)建理想的組織工程支架,充分恢復(fù)關(guān)節(jié)軟骨的原始成分、結(jié)構(gòu)、力學(xué)和生物功能,以明膠、殼聚糖、絲素蛋白和羥基磷灰石為基礎(chǔ)材料,通過(guò)真空冷凍干燥和化學(xué)交聯(lián)開(kāi)發(fā)一種能夠滿足骨軟骨ECM和成骨成軟骨雙向分化要求的三維多孔支架,探索其用于修復(fù)軟骨缺損的可行性。

1 方 法

1.1 材 料

蠶繭(西北養(yǎng)蠶工業(yè)基地);甲苯胺藍(lán)染色液、透析袋(北京索萊寶科技有限公司);脫乙酰度≥95%的殼聚糖、明膠、溴化鋰、N-羥基琥珀酰亞胺、碳酰二亞酸鹽(上海麥克林生化科技有限公司);DMEM/F12培養(yǎng)基(?？寺yclone生物科技公司);澳洲胎牛血清(美國(guó)賽默飛公司Gibco胎牛血清);CCK-8細(xì)胞增殖試劑盒、活死細(xì)胞染色試劑盒(Abbkine亞科因生物技術(shù)有限公司);碳酸氫鈉(國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)有限公司),II型膠原酶(百普賽斯Bioshap生物科技公司)

1.2 主要實(shí)驗(yàn)溶液的配制

1.2.1 殼聚糖溶液

稱取3 g殼聚糖(脫乙酰度≥95%)粉末溶解于100 mL 1%醋酸溶液中,磁力攪拌4 h直至完全溶解,然后過(guò)濾溶液以除去雜質(zhì)。

1.2.2 明膠溶液

稱取3 g生物明膠溶解于50 ℃ 100 mL超純水中,水浴加熱并持續(xù)攪拌至完全溶解。

1.2.3 絲素蛋白溶液

1) 脫膠:挑選優(yōu)質(zhì)干凈的蠶繭,將切好的繭塊加入沸騰的0.5% Na2CO3溶液中,煮沸60 min,然后用蒸餾水浸泡洗滌10 min,重復(fù)2～3次后烘干。2) 溶解:按照1︰6的比例將脫膠蠶絲在60 ℃條件下溶解于9.3 mol/L LiBr溶液中。3) 過(guò)濾離心:冷卻至室溫,使用不銹鋼過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾去除較大顆粒雜質(zhì),以9 000 r/min速度離心10 min。4) 透析:將離心后的絲素蛋白溶液轉(zhuǎn)移至截留相對(duì)分子質(zhì)量12 000±2 000的透析袋中,超純水持續(xù)透析3 d,直至透析袋內(nèi)水位不再變化。5) 濃縮:將含絲素蛋白溶液的透析袋放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的聚乙二醇溶液中進(jìn)行濃縮12 h,保存于4 ℃冰箱中備用。

1.3 SF-CS-Gel-nHap支架的制備

將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的SF溶液、CS溶液、Gel溶液分別以1︰1︰1體積比混合均勻,調(diào)整Hap的量,根據(jù)Hap在混合溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的不同,SF-CS-Gel-nHap復(fù)合溶液分為5組(Hap-1%、Hap-2%、Hap-3%、Hap-4%、Hap-5%),磁力攪拌60 min混合均勻,然后以每孔1 mL轉(zhuǎn)移至48孔板內(nèi)。在-20 ℃預(yù)凍過(guò)夜,放入-80 ℃冰箱中繼續(xù)冷凍24 h,然后真空冷凍干燥48 h,經(jīng)第一次塑形得到規(guī)則、圓柱狀的冷凍干燥支架。冷凍干燥后每孔中加入2 mL交聯(lián)劑,交聯(lián)劑各成分分別為碳化二亞胺鹽50 mmol/L和N-羥基琥珀酰亞胺25 mmol/L。在4 ℃條件下充分交聯(lián)過(guò)夜,然后用75%乙醇和去離子水清洗數(shù)次,加入75%乙醇溶液浸泡24 h,1 mol/L NaOH溶液浸泡中和6 h,去離子水洗凈。再次放于-20 ℃冷凍過(guò)夜,-80 ℃冷凍24 h后行真空干燥48 h,進(jìn)行第二次塑形。干燥完成后,將支架收集密封,置于4 ℃冰箱,保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 物理性能表征

1.4.1 大體外觀

將不同類型的3D支架從48孔板中取出進(jìn)行拍照觀察。

1.4.2 掃描電鏡觀察

使用手術(shù)刀片將每個(gè)支架樣品切成合適厚度,常規(guī)涂覆金膜后,通過(guò)Regulus 8100掃描電子顯微鏡(日本日立公司)對(duì)支架的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和形貌進(jìn)行分析;采用ImageJ圖像可視化軟件對(duì)樣品進(jìn)行孔徑分析,平均孔徑是通過(guò)測(cè)量在樣品中心部分至少隨機(jī)選擇的20個(gè)孔的最大和最小直徑來(lái)獲得。

1.4.3 X射線衍射(XRD)分析

將支架研磨成粉末,使用D8 advance全自動(dòng)X射線衍射儀(美國(guó)布魯克海文儀器公司)對(duì)粉末樣品進(jìn)行表征,X射線衍射儀在35 kV和10 mA的條件下用Cukα輻射(λ=1.542)記錄樣品的衍射圖,掃描2θ角范圍為5°～60°,掃描速率為5°/min。

1.4.4 溶脹率

用常規(guī)重量法測(cè)定各組支架的吸水溶脹率。將冷凍干燥后的支架后稱重記為M1,然后浸泡于PBS緩沖液(pH 7.4)中24 h后,取出樣品,用紗布吸去支架表面多余的水分,稱重記為M2。每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次。吸水溶脹率S計(jì)算如下式所示:

(1)

1.4.5 孔隙率

采用比重瓶法測(cè)定各組復(fù)合支架的孔隙率。用手術(shù)刀片將各支架切成統(tǒng)一大小的樣品,以無(wú)水乙醇為液體介質(zhì),稱量充滿無(wú)水乙醇的比重瓶,質(zhì)量記為M1,將干重M0的支架浸入無(wú)水乙醇中,真空脫泡30 min,直至支架完全被無(wú)水乙醇所飽和,加入乙醇直至比重瓶充滿相同刻度,再次稱重,記為M2。取出充盈乙醇的樣品,稱量剩余的液體與比重瓶質(zhì)量,記為M3。支架孔隙率ε計(jì)算如下式所示:

(2)

1.4.6 生物降解率

支架的體外酶降解實(shí)驗(yàn)根據(jù)支架在含酶的磷酸鹽緩沖液中孵育后的殘留量百分比來(lái)評(píng)價(jià)支架的降解行為。真空干燥后的支架質(zhì)量記錄為M1,然后用含10 mg/mL溶菌酶的PBS緩沖液(pH 7.4)37 ℃浸泡4周。在規(guī)定的時(shí)間間隔(7、14、21、28 d)取出樣品,真空干燥24 h,稱重記為Mt。生物降解率δ計(jì)算如下式所示:

(3)

1.4.7 機(jī)械性能

使用ETM系列通用萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)(深圳萬(wàn)測(cè)試驗(yàn)設(shè)備有限公司)進(jìn)行壓縮機(jī)械測(cè)試。在每次測(cè)試之前測(cè)量樣品大小,支架樣品為直徑約10 mm、高15～18 mm的圓柱體,水平頭速度設(shè)定為2 mm/min,當(dāng)壓縮位移達(dá)到10 mm時(shí)停止加壓。然后繪制應(yīng)力-應(yīng)變曲線以評(píng)估支架的機(jī)械性,應(yīng)力-應(yīng)變曲線初始線性階段的斜率為彈性模量,每組3個(gè)平行樣。

1.5 生物性能表征

1.5.1 軟骨細(xì)胞的提取和鑒定

本研究經(jīng)大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審查批件2021073-1),并獲得所有研究對(duì)象的知情同意。納入2021年11月因骨關(guān)節(jié)炎行全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的患者1例(年齡52歲,職業(yè)木工)。收集膝關(guān)節(jié)置換術(shù)中切除的股骨髁軟骨,無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)移至在超凈工作臺(tái),使用含無(wú)菌PBS緩沖液連續(xù)漂洗2～3次,分離出光滑透亮的透明軟骨組織薄片,切成2 mm大小的組織塊,之后使用5倍體積的0.2% Ⅱ型膠原酶消化過(guò)夜(37 ℃和5% CO2恒溫培養(yǎng)箱)。消化結(jié)束后使用100 μm細(xì)胞濾器過(guò)濾,然后終止消化,將獲得的細(xì)胞懸液在室溫下以1 500 r/min的速度離心5 min,收集細(xì)胞沉淀,重懸后接種到T 25 cm2培養(yǎng)瓶,在37 ℃和5% CO2的細(xì)胞孵箱中培養(yǎng),24 h后更換一次培養(yǎng)液以去除未貼壁的細(xì)胞。此后每3 d換液一次,建立原代培養(yǎng),當(dāng)貼壁細(xì)胞達(dá)到90%匯合時(shí),用無(wú)菌PBS緩沖液洗滌后使用胰蛋白酶(含EDTA)進(jìn)行消化處理并將細(xì)胞以1︰2的傳代比例重新接種以進(jìn)行傳代培養(yǎng),直到細(xì)胞達(dá)到第2代,使用甲苯胺藍(lán)染色對(duì)軟骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

1.5.2 支架接種前的處理

將支架樣品切成直徑10 mm、厚度1～2 mm的薄片,在紫外光下用75%酒精消毒過(guò)夜,然后用無(wú)菌PBS緩沖液徹底沖洗3次。在細(xì)胞培養(yǎng)之前,通過(guò)在37 ℃的培養(yǎng)箱中浸入DMEM中2 h將支架預(yù)潤(rùn)濕。

1.5.3 黏附率

取傳代培養(yǎng)至第2代的軟骨細(xì)胞懸液,將含有105個(gè)/mL細(xì)胞(A0)的細(xì)胞懸液100 μL接種在預(yù)先潤(rùn)濕的支架上,然后添加培養(yǎng)基至300 μL,并在接種2、4、6 h后測(cè)量黏附率。從孔中取出支架,用細(xì)胞計(jì)數(shù)板(A1)計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù),去除所有培養(yǎng)基溶液后,消化并計(jì)算黏附在孔壁上的細(xì)胞(A2)。細(xì)胞黏附率θ計(jì)算如下式所示:

(4)

每組進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn),得到平均黏附率。

1.5.4 增殖率

使用CCK-8法檢測(cè)支架上軟骨細(xì)胞的增殖,將軟骨細(xì)胞接種在支架上(每個(gè)支架104個(gè)細(xì)胞),48孔板每孔添加培養(yǎng)基至300 μL。每3天更換一次培養(yǎng)基,經(jīng)過(guò)1、4、7、10 d培養(yǎng)后,30 μL CCK-8的反應(yīng)溶液加入到每個(gè)孔中,并在37 ℃溫育4 h。然后將100 μL含有CCK-8反應(yīng)液的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,使用Biotek 800TS酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司)在450 nm處讀取吸光度,繪制生長(zhǎng)曲線,所有實(shí)驗(yàn)一式三份進(jìn)行。

1.5.5 活死細(xì)胞染色

細(xì)胞接種3 d后使用Live/Dead試劑盒進(jìn)行染色,觀察細(xì)胞在支架樣品上的分布。該試劑盒分別用碘化丙啶和Calcein AM對(duì)死細(xì)胞、活細(xì)胞進(jìn)行染色,并在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min后,使用TXM-500C熒光顯微鏡(上海天省光學(xué)儀器有限公司)觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

多組樣本間的比較使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行ANOVA單因素方差分析,然后進(jìn)行Tukey’s檢驗(yàn),以確定組間測(cè)量數(shù)據(jù)的差異。獨(dú)立樣本數(shù)據(jù)的比較使用t檢驗(yàn),重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)使用球形檢驗(yàn),認(rèn)為p<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。置信度記號(hào)標(biāo)為:*表示p<0.05,** 表示p<0.01,*** 表示p<0.001)。

2 結(jié)果和分析

2.1 物理性能

2.1.1 大體外觀

5組SF-CS-Gel-nHap多孔支架均為直徑10 mm左右的白色圓柱體,隨著支架內(nèi)Hap質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,支架底部可見(jiàn)少量沉積的羥基磷灰石,質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高沉積越多,如圖1所示。

圖1 SF-CS-Gel-nHap多孔支架大體外觀

2.1.2 掃描電鏡觀察

各組支架掃描電鏡圖像如圖2所示。由圖2可見(jiàn),Hap-1%支架、Hap-2%支架、Hap-3%支架、Hap-4%支架具有多孔結(jié)構(gòu),Hap-1%支架的平均孔徑最大,為(225.14±53.63) μm;Hap-2%支架、Hap-3%支架、Hap-4%支架的孔徑分別為(212.89±62.22) μm、(171.30±31.87) μm、(169.73±26.19) μm;Hap-5%支架的平均孔徑最小,為(136.11±20.46) μm。當(dāng)支架內(nèi)Hap的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1%～4%變化時(shí),支架能保持高度多孔的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和良好的孔間聯(lián)通性,隨著Hap在支架中質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,多孔材料的孔徑有所減小,支架的聯(lián)通性下降;當(dāng)Hap的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到5%及以上時(shí),可以明顯看到過(guò)量的羥基磷灰石沉積在多孔支架的孔壁上,逐漸堵塞支架的孔道。合適的微觀結(jié)構(gòu)和孔徑,能夠提供遷移細(xì)胞、運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝物、信號(hào)分子和細(xì)胞廢物[11-12]。

圖2 SF-CS-Gel-nHap多孔支架電鏡圖像

2.1.3 XRD晶型分析

通過(guò)XRD對(duì)SF-CS-Gel-nHap多孔支架的晶型結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析,SF-CS-Gel-nHap支架的XRD圖譜如圖3所示。由圖3可見(jiàn),2θ在25.7°、32.2°、33.0°、34.3°、40.3°、46.6°和49.6°附近能觀察到羥基磷灰石的特征峰。對(duì)比低質(zhì)量分?jǐn)?shù)和高質(zhì)量分?jǐn)?shù)Hap的復(fù)合支架材料的XRD圖譜,還可以觀察到羥基磷灰石少量水解和新的磷酸鈣化合物生成。這是因?yàn)楸宜崛芙鈿ぞ厶菫槿芤禾峁┝怂嵝原h(huán)境,微酸條件下部分羥基磷灰石發(fā)生水解,從而形成新的磷酸鈣化合物(2θ=28.4°和29.1°),有研究指出磷酸鈣化合物的存在不會(huì)干擾支架的生物活性或生物相容性[10,13]。

圖3 SF-CS-Gel-nHap支架XRD圖譜

2.1.4 元素分析

電鏡掃描和XRD晶型分析證實(shí),在多孔復(fù)合材料表面沉積層中存在結(jié)晶簇聚集體,如圖2(f)所示。為了確保添加的Hap顆粒確實(shí)存在于復(fù)合材料中,本研究對(duì)SF-CS-Gel-nHap多孔支架進(jìn)行了元素分析。X射線能譜分析儀(Energy Dispersive Analysis of X-rays,EDAX)元素檢測(cè)的結(jié)果表明,結(jié)晶簇的主要元素是Ca和P,如圖4所示。檢測(cè)到的結(jié)晶簇聚集體內(nèi)的Ca/P比值約為1.74,其值與化學(xué)計(jì)量羥基磷灰石中的Ca/P比值1.67接近[14-15],據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道穩(wěn)定的Hap相對(duì)應(yīng)的Ca/P比值在1.3～1.8[16],表明Hap在支架基質(zhì)內(nèi)能夠穩(wěn)定存在。

圖4 SF-CS-Gel-nHap多孔支架元素分析

2.1.5 吸水溶脹率

支架的保水性能對(duì)組織工程有重要意義,吸水溶脹率影響細(xì)胞的遷移、增殖和分化,也影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸和機(jī)械性能[17]。SF-CS-Gel-nHap多孔支架的吸水溶脹率如圖5所示,5組支架吸水溶脹率之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。Hap-1%支架和Hap-2%支架的吸水溶脹率最高,分別為1 466%±179%和1 286%±114%;Hap-5%支架的吸水膨脹率最低,為771%±89%。隨著SF-CS-Gel-nHap復(fù)合支架內(nèi)羥基磷灰石質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,支架的吸水溶脹率明顯降低,即使是Hap-5%支架的平均溶脹率依然大于700%。

圖5 SF-CS-Gel-nHap多孔支架溶脹率比較

2.1.6 孔隙率

多孔復(fù)合支架的營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸能力除了受材料本身親水性能的影響外,還與支架的孔隙率、孔徑大小及孔道聯(lián)通性密切相關(guān)[17-18]。因此孔隙率也是組織工程支架的重要特征之一。SF-CS-Gel-nHap復(fù)合支架的孔隙率如圖6所示,5組支架孔隙率之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。SF-CS-Gel-1%Hap支架的孔隙率最高,約為87.25%±2.28%。Hap-2%的支架和Hap-3%的支架具有相似的孔隙率,分別為76.52%±2.31%和72.27%±2.28%。Hap-5%支架的孔隙率最低,只有49.41%±5.92%,多孔支架的孔隙率隨著支架內(nèi)部Hap質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而明顯降低。分析認(rèn)為,這是隨著復(fù)合支架內(nèi)羥基磷灰石質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,過(guò)量的羥磷灰石會(huì)沉積在多孔支架的孔壁內(nèi),堵塞孔徑,使多孔支架結(jié)構(gòu)通道的聯(lián)通性降低,從而導(dǎo)致支架的孔隙率下降?？紫堵蚀笥?0%的多孔支架被認(rèn)為是細(xì)胞生存的良好空間和維持細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸通道[18],高度多孔的結(jié)構(gòu)可以提供足夠的營(yíng)養(yǎng)和氣體交換,以及足夠的空間供細(xì)胞增殖和附著[19-20]。摻雜低質(zhì)量分?jǐn)?shù)Hap的SF-CS-Gel-nHap的多孔支架,不僅可以提供高度多孔的結(jié)構(gòu),為細(xì)胞的黏附、遷移和生長(zhǎng)提供了很大的表面積,還能兼顧保持Hap的生物活性和促成骨作用,也許更適合骨軟骨缺損的修復(fù)。

圖6 SF-CS-Gel-nHap多孔支架孔隙率比較

2.1.7 生物降解率

本研究使用溶菌酶對(duì)SF-CS-Gel-nHap多孔支架進(jìn)行了體外降解實(shí)驗(yàn),如圖7所示,5組支架生物降解率之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。Hap-1%支架降解率最高41.8%±2.47%,Hap-5%支架的降解率最低24.89%±1.16%,支架生物降解率隨著羥基磷灰石質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而降低。這一結(jié)果與軟骨下骨層多孔支架孔隙率結(jié)果一致,這可能是因?yàn)榈唾|(zhì)量分?jǐn)?shù)Hap的復(fù)合支架具有較高的孔隙率,多孔結(jié)構(gòu)提供了較大的比表面積,導(dǎo)致溶菌酶更容易滲透進(jìn)支架內(nèi)部與殼聚糖、明膠等有機(jī)材料發(fā)生反應(yīng);另一個(gè)可能的原因是羥基磷灰石是天然骨骼的礦物質(zhì)成分,本身具有優(yōu)良的結(jié)合能力和原位降解緩慢等優(yōu)勢(shì)[14-15],因此適當(dāng)添加Hap可以改善多孔復(fù)合支架降解速度快的缺點(diǎn),從而使多孔支架的生物降解速度與組織的再生重建相匹配。

圖7 SF-CS-Gel-nHap多孔支架的生物降解率(p<0.05)

2.1.8 機(jī)械性能

機(jī)械強(qiáng)度也是評(píng)估軟骨修復(fù)生物材料性能的最關(guān)鍵因素之一,SF-CS-Gel-nHap支架的應(yīng)力-應(yīng)變曲線如圖8所示。這次實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較多孔支架的彈性模量(線性應(yīng)力-應(yīng)變部分的斜率)和20%形變量的抗壓強(qiáng)度評(píng)價(jià)多孔支架的力學(xué)性能,SF-CS-Gel-1%Hap支架的抗壓強(qiáng)度最低(14.44 kPa),SF-CS-Gel-5%Hap支架的抗壓強(qiáng)度最高(40.28 kPa),SF-CS-Gel-nHap多孔支架抗壓強(qiáng)度隨Hap的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而增大,高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Hap的有助于提高支架的抗壓強(qiáng)度。然而SF-CS-Gel-nHap支架的彈性模量變化與抗壓強(qiáng)度變化并不完全一致,此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SF-CS-Gel-1%Hap支架的彈性模量最低,Hap質(zhì)量分?jǐn)?shù)在2%～5%的多孔支架擁有相似的彈性模量,并不隨Hap質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而發(fā)生明顯改變。支架的機(jī)械性能影響細(xì)胞的增殖和分化,在較硬結(jié)構(gòu)上生長(zhǎng)的細(xì)胞比在較軟基質(zhì)上的細(xì)胞增殖更快,遷移更慢[20]。因此用于軟骨修復(fù)的支架需要足夠堅(jiān)固、有彈性和堅(jiān)韌,以容納種子細(xì)胞或從宿主組織遷移的細(xì)胞,同時(shí)具有足夠的容量以抵抗反復(fù)的動(dòng)態(tài)沖擊而不會(huì)倒塌或壓碎[21-22]。

圖8 SF-CS-Gel-nHap多孔支架的應(yīng)力-應(yīng)變曲線

2.2 生物性能

理想組織工程支架需要具備多種能力,如高度水合的三維結(jié)構(gòu)和高含水量、合適的孔徑和孔隙率、材料交換能力、良好的生物降解性和優(yōu)越的機(jī)械性能,并能提供合適的微環(huán)境和高效的生物相容性和高強(qiáng)度[22]。綜合本研究的物理性能檢測(cè)結(jié)果,SF-CS-Gel-2%Hap支架更符合全層軟骨缺損修復(fù)的要求。該支架具有(212.89±62.22) μm大小的孔徑結(jié)構(gòu)、76.52%±2.31%的孔隙率、良好的吸水溶脹率1 286%±114%及37.09%±1.41%生物降解速率與良好的機(jī)械性能。因此將SF-CS-Gel-2%Hap支架與骨關(guān)節(jié)炎患者的軟骨細(xì)胞共培養(yǎng),以進(jìn)一步檢測(cè)支架材料的生物性能。

2.2.1 軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定

原代軟骨細(xì)胞形態(tài)大多為梭形和多角形,細(xì)胞在貼壁2 d后開(kāi)始較好地附著在細(xì)胞培養(yǎng)瓶表面并開(kāi)始增殖,并在7～9 d后達(dá)到90%的匯合狀態(tài)。傳代細(xì)胞表現(xiàn)出相似的形態(tài),絕大數(shù)細(xì)胞表現(xiàn)為多角形,表面多樹(shù)突狀突起,隨著培養(yǎng)時(shí)間增加,樹(shù)突狀突起伸展為細(xì)長(zhǎng)觸絲,如圖9所示。使用甲苯胺藍(lán)對(duì)提取的原代細(xì)胞進(jìn)行染色,細(xì)胞核被染成紫藍(lán)色,胞核偏向一側(cè),未見(jiàn)肥大樣細(xì)胞,符合軟骨細(xì)胞的特征,如圖9(c)所示。

圖9 軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

2.2.2 黏附率

理想的生物支架可以改善細(xì)胞黏附、細(xì)胞分化和與周圍天然組織的整合[10]。本研究比較了SF-CS-Gel-2%Hap支架在接種細(xì)胞2、4、6 h后的黏附率,如圖10所示。由圖10可見(jiàn),軟骨細(xì)胞能與支架良好黏附,細(xì)胞種板后6 h內(nèi)可成功黏附于支架網(wǎng)狀纖維上,表明SF-CS-Gel-2%Hap支架很好地保持材料優(yōu)良的生物活性。

圖10 細(xì)胞黏附率

2.2.3 增殖率

本研究使用CCK-8法檢測(cè)軟骨細(xì)胞在SF-CS-Gel-2%Hap支架的增殖表達(dá),如圖11所示。由圖11可見(jiàn),單純軟骨細(xì)胞組增殖曲線呈S形,而仿生支架共培養(yǎng)組軟骨細(xì)胞在連續(xù)共培養(yǎng)10 d后,生長(zhǎng)增殖曲線仍然呈明顯上升趨勢(shì),保持有良好的細(xì)胞活力,未觀察到明顯的接觸抑制效應(yīng)。這主要是因?yàn)檐浌羌?xì)胞在普通培養(yǎng)皿表面貼壁生長(zhǎng),細(xì)胞增殖存在明顯的接觸抑制效應(yīng),但是三維立體培養(yǎng)可以避免這種效應(yīng)。結(jié)果表明,本研究制備的SF-CS-Gel-2%Hap多孔支架具有良好細(xì)胞相容性,能夠?yàn)榉N子細(xì)胞提供良好的生長(zhǎng)微環(huán)境,三維立體培養(yǎng)比二維平面擴(kuò)展生長(zhǎng)具有更大的增殖效率。

圖11 細(xì)胞增殖率

2.2.4 活死染色

為了直觀地觀察細(xì)胞在支架上的狀態(tài)和活性,共培養(yǎng)一段時(shí)間后使用Live/Dead試劑盒進(jìn)行染色,然后通過(guò)熒光顯微鏡觀察(10×10倍),如圖12所示,綠色代表活細(xì)胞,而紅色代表死細(xì)胞。由圖12可見(jiàn),SF-CS-Gel支架上的大部分細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光,少見(jiàn)死細(xì)胞,支架上細(xì)胞表現(xiàn)出高存活率和低細(xì)胞毒性,表明本研究所制備的多孔支架具有良好的生物相容性。

圖12 活/死細(xì)胞染色

3 結(jié) 論

基于明膠、殼聚糖、絲素蛋白和納米羥基磷灰石制備的SF-CS-Gel-nHap三維多孔復(fù)合支架不僅可以模擬天然骨軟骨的ECM,而且具有良好的生物相容性,能夠?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞附著、增殖和立體生長(zhǎng)提供良好的網(wǎng)狀骨架,從而為全層軟骨缺損的治療提供新的選擇。

《絲綢》官網(wǎng)下載

中國(guó)知網(wǎng)下載