許萬濤 秦 欣 陳海敏 駱其君

（寧波大學海洋學院，浙江 寧波 315211）

γ射線是一種波長短于X射線的電離輻射線，不帶有電荷，屬于中性射線，其產(chǎn)生的電離可以直接或間接改變DNA的結構［1］。輻射誘變增加了突變的頻率，能夠縮短育種周期［2］，在短時間內(nèi)培育出農(nóng)作物新品種，是植物品種改良的重要途徑［3-5］。藻類學者已利用該誘變源培育出了壇紫菜申福1 號和申福2 號等品種［6-8］?？锩返龋?］用60Co-γ射線誘變壇紫菜和條斑紫菜，發(fā)現(xiàn)紫菜的形態(tài)、色素產(chǎn)生了特殊變異。此外，前人研究發(fā)現(xiàn)，牡蠣殼、扇貝殼、文蛤殼［10］和雞蛋殼［11］均可作為紫菜種苗培養(yǎng)的基質(zhì)。扇貝殼作為被廣泛應用的紫菜育苗培養(yǎng)基質(zhì)之一，適合紫菜的絲狀體生長且容易獲得［12］。當前對紫菜育苗培養(yǎng)技術的研究主要聚集于培養(yǎng)環(huán)境條件，如光照強度、光周期與培養(yǎng)水溫等［13-15］，以及黃斑?。?6-17］等病害防治方面，對絲狀體培育介質(zhì)性能的系統(tǒng)性研究較少。而輻射誘變后的自由絲狀體生長不穩(wěn)定，需要探究適宜的培養(yǎng)條件來穩(wěn)定藻絲的存活及突變體的性狀。

因此，本研究將60Co-γ 射線輻射誘變得到的壇紫菜（Neoporphyra haitanensis）自由絲狀體接種到扇貝殼上，比較在海水和扇貝殼上的突變率，篩選突變體；以輻射誘變得到的粉色、綠色突變體為試驗對象，選取扇貝殼、瓊脂培養(yǎng)基等基質(zhì)，設置4 個溫度梯度（14、17、20、23 ℃），測定絲狀體在不同培養(yǎng)條件下的生長結果，探究突變株的適宜生長溫度和培養(yǎng)介質(zhì)，以期為突變體的培養(yǎng)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

壇紫菜浙東1 號自由絲狀體來自浙江省海洋生物技術重點實驗室。

1.2 儀器與設備

Eclipse Ti 倒置熒光顯微鏡，SMZ 18 解剖鏡，尼康儀器（上海）有限公司；GXZ型智能光照培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 突變率的檢測 將經(jīng)60Co-γ射線輻射處理2 d后的壇紫菜絲狀體接種于扇貝殼上，培養(yǎng)21 d后，發(fā)現(xiàn)在貝殼上長成不同顏色的藻落，在13.5 倍解剖鏡下檢查40 個視野下的突變藻落數(shù)，對突變率進行統(tǒng)計，突變率=（變異藻落數(shù)/視野下檢查到的藻落數(shù)）×1 000‰。將經(jīng)輻射誘變后的自由絲狀體進行培養(yǎng)，篩選出與對照組具有明顯差異的絲狀體，并在不同溫度和基質(zhì)下對突變體的生長參數(shù)進行檢測。

1.3.2 初始藻落密度的檢測 稱取60Co-γ 射線輻射處理后的0（對照組）、50、125、400、1 000、1 600 Gy輻射組藻球各0.02 g，用吸水紙吸干，置于200 mL滅菌海水中打碎至藻絲長度為100～300 μm，將扇貝殼洗刷水煮消毒后鋪滿直徑為8.5 cm 的培養(yǎng)皿，用吸管將藻絲混勻取45 mL 置于培養(yǎng)皿中暗處理2 d，后轉移至培養(yǎng)條件為溫度20 ℃、光照強度18 μmol·photons·m-2·s-1、光周期為光照14 h/黑暗10 h 的光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)液為滅菌海水加入Ⅲ號營養(yǎng)母液（990 nmol·L-1KNO3，57 nmol·L-1K2HPO4，9 nmol·L-1FeSO4·7H2O，54 nmol·L-1Na2EDTA，1 nmol·L-1MnSO4·H2O）以促進絲狀體生長。24 d 后，在解剖鏡下計數(shù)統(tǒng)計每個扇貝殼5 個視野（10 mm×10 mm）內(nèi)的平均藻落數(shù)。待藻絲生長至布滿整個扇貝殼后再轉移到光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為：溫度28 ℃，光照強度15 μmol·photons·m-2·s-1，光周期為光照8 h/黑暗16 h，培養(yǎng)液為滅菌海水加入磷酸氫二鉀，滅菌海水與磷酸氫二鉀體積比為1 000∶1，以促使孢子囊枝的形成，顯微觀察誘變后的絲狀體形態(tài)。

1.3.3 絲狀體輻射誘變后的篩選和培養(yǎng) 將扇貝殼表面的泥沙清洗干凈，放至2%～3%的稀鹽酸溶液中浸泡12 h，清水沖洗至pH 值呈中性，烘干備用；配置2%的瓊脂培養(yǎng)基備用；準備鹽度為25 的滅菌海水。將自由絲狀體打碎至100～300 μm 的小段，接種到扇貝殼、2%瓊脂培養(yǎng)基、無菌海水3 種基質(zhì)上。扇貝殼打碎平鋪至培養(yǎng)皿中，加入滅菌海水30 mL，瓊脂培養(yǎng)基和滅菌海水也倒置在同樣大小的培養(yǎng)皿中，共設置3 組平行，培養(yǎng)條件為光照強度18 μmol·photons·m-2·s-1，光周期為光照12 h/黑暗12 h，培養(yǎng)時間為15 d，設置4 個溫度梯度，分別為14、17、20、23 ℃。將粉色和綠色突變體，分別接種在扇貝殼、瓊脂培養(yǎng)基和海水上，15 d后分別測量藻絲細胞的寬度、長度和分枝數(shù)量。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理分析 數(shù)據(jù)采用Excel 2007 進行處理，用SPSS 20.0 進行相關性分析，Origin 2018 進行繪圖，P＜0.05為統(tǒng)計顯著。

2 結果與分析

2.1 絲狀體輻射誘變后的突變率

結果表明，絲狀體在不同劑量60Co-γ 射線輻射下會出現(xiàn)一些突變體，如不同顏色、色素嵌合體、生長與對照組存在明顯差異的絲狀體。在相同輻射劑量下，絲狀體的突變率在不同培養(yǎng)基質(zhì)中有明顯差異，均表現(xiàn)為扇貝殼基質(zhì)高于海水基質(zhì)。在海水基質(zhì)中，隨著輻射劑量的增加，在輻射劑量低于1 000 Gy時，突變率呈升高趨勢（表1），輻射劑量1 000 Gy 時突變率最高（0.243‰），輻射劑量高于1 000 Gy 時，突變率顯著降低（P＜0.05）。在貝殼基質(zhì)中，輻射劑量低于1 000 Gy時，絲狀體突變率隨著輻射劑量增強顯著提高，并在輻射劑量為1 000 Gy時具有最高突變率（0.382‰），出現(xiàn)了更為豐富的突變表型。

表1 絲狀體輻射誘變后接種于不同基質(zhì)中21 d后的突變率Table 1 Mutation rates after conchocelis radiation mutagenesis inoculated in different matrix for 21 days/‰

2.2 絲狀體輻射誘變處理的初始藻落密度

試驗結果表明，自由絲狀體經(jīng)γ 射線誘變后仍具有鉆殼和萌發(fā)生長的能力，由圖1 可知，對照組（0 Gy）貝殼絲狀體的顏色最淺，隨著60Co-γ輻射劑量的增加，貝殼絲狀體的藻落密度整體呈現(xiàn)上升的趨勢，其中，輻射組（1 000 Gy）貝殼絲狀體顏色最深。由圖2可知，輻射組的自由絲狀體初始藻落密度均極顯著高于對照組（P＜0.01），與對照組相比，50 Gy 輻射組的初始藻落密度為2 948個·cm-2，1 600 Gy輻射組的初始藻落密度最高（3 593 個·cm-2）。上述結果表明，經(jīng)60Co-γ 射線處理過的絲狀體更容易鉆進貝殼，可能適用于貝殼絲狀體的采苗。

圖1 輻射誘變處理后的絲狀體鉆殼情況Fig.1 Drilling of conchocelis after radiation mutagenesis treatment

圖2 不同輻射劑量處理對自由絲狀體所形成的初始藻落密度的影響Fig.2 Effect of different irradiation dose treatments on the density of initial conchocelis colony

2.3 絲狀體突變體在不同溫度下的顯微結構及生長

如圖3 所示，隨著培養(yǎng)溫度的升高，藻絲生長逐漸加快。結合表2 可知，對照組藻絲在不同溫度下接種于扇貝殼培養(yǎng)15 d的生長發(fā)育情況如下：14 ℃下，藻絲鉆入貝殼內(nèi)部，主分枝在2 條左右，長度為45.21 μm；在17 和20 ℃下分枝數(shù)量、長度和寬度都有所增加，在23 ℃下，藻絲在貝殼內(nèi)部呈輻射生長，主分枝數(shù)量明顯增加，長度和分枝數(shù)量分別是14 ℃下的4.56和3.90倍，藻絲有少量單側分枝，絲狀體繼續(xù)生長，寬度逐漸增加至10.24 μm，形成較多的盤狀體，向四周輻射生長。粉色突變體藻絲在不同溫度下接種于扇貝殼培養(yǎng)15 d的生長發(fā)育如下：14和17 ℃下，藻絲鉆入基質(zhì)內(nèi)生長，長度、寬度及分枝數(shù)量相近，生長狀況無明顯差異；20 ℃下，藻絲的長度大幅度增長，為144.63 μm，相比對照組增加了14.34%，分枝數(shù)量增多；23 ℃下，藻絲的生長加快，向外生長類似自由絲狀體，分枝數(shù)量為10 個，比對照組極顯著增加了28.21%（P＜0.01），分枝的頂端細胞體積變大，呈紡錘形或其他不規(guī)則形狀。綠色突變體藻絲在不同溫度下接種于扇貝殼培養(yǎng)15 d的生長發(fā)育情況如下：14 ℃下，視野中僅定位到個別單根藻絲，17和20 ℃下，發(fā)現(xiàn)藻絲的長度無明顯增加，可見個別分枝；20 ℃下，藻絲顏色加深，說明藻絲已穩(wěn)定生長于基質(zhì)上，色素含量有所回升，分枝清晰可見；23 ℃下，藻絲的分枝顏色加深，藻絲明顯增粗，寬度為11.26 μm，比同溫度下對照組增加了9.96%。

圖3 貝殼絲狀體在不同溫度下的顯微圖Fig.3 Micrographs of the shell-borne conchocelis grown at different temperature

表2 不同溫度對貝殼絲狀體生長發(fā)育的影響Table 2 Effect of different temperatures on the growth and development of the shell-borne conchocelis

2.4 絲狀體突變體在不同基質(zhì)上的顯微結構及生長

由圖4 可以看出，絲狀體突變體接種于不同基質(zhì)上，在23 ℃下培養(yǎng)14 d 生長發(fā)育有所差異。由表3 可知，綠色突變體在瓊脂培養(yǎng)基中生長較為緩慢，長度與對照組相比無明顯差異，分枝數(shù)量少于對照組，僅為1.31 個；在海水中藻絲顏色與對照組一致，顏色變淺，主枝長度為101.46 μm，與對照組相比無明顯增長；在扇貝殼中藻絲顏色加深，長度和分枝數(shù)量顯著低于對照組，寬度與對照組相比差異不顯著。粉色突變體在瓊脂培養(yǎng)基中長度和分枝數(shù)量增加，顏色正常；在海水中色素呈彌散狀，主枝長度增加；在扇貝殼中主枝和側枝呈散開狀向周圍生長，分枝數(shù)量極顯著高于對照組，為10個。

圖4 自由絲狀體生長于不同介質(zhì)下的顯微圖Fig.4 Micrographs of free-living conchocelis cultured in different matrix

3 討論

近20 年，使用γ 射線處理觀賞植物種子的報道中，多數(shù)使用的劑量范圍為0～500 Gy［18-19］。宋佳寶等［20］研究發(fā)現(xiàn)，輻射劑量超過50 Gy 會抑制丁香花的生長。在壇紫菜絲狀體的研究中，陳昌生等［21］發(fā)現(xiàn)，不同60Co-γ 射線輻射劑量對絲狀體存活率影響不同，同時經(jīng)γ射線輻射后的壇紫菜自由絲狀體容易出現(xiàn)色素突變。嚴興洪等［22］發(fā)現(xiàn)輻射劑量500 Gy 是誘導條斑紫菜葉狀體色素突變的最合適的劑量。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)60Co-γ 射線輻射后的自由絲狀體，仍具有鉆入扇貝殼的能力，不同誘變梯度的絲狀體接種在扇貝殼上培養(yǎng)21 d 的密度均高于對照組，表明輻射刺激了絲狀體的生長，促使自由絲狀體固著在扇貝殼基質(zhì)上。在壇紫菜絲狀體的輻射誘變過程中，輻射劑量為1 000 Gy時突變率最高，扇貝殼上出現(xiàn)了不同顏色的藻落，發(fā)生了豐富的顏色突變，這與王素娟等［23］和陳昌生等［21］研究得到γ射線處理的條斑紫菜自由絲狀體附著貝殼上后發(fā)生不同顏色變異的結果相符。同時，本研究中相同輻射劑量下絲狀體在海水基質(zhì)中的突變率均低于扇貝殼基質(zhì)，推測是由于扇貝殼基質(zhì)更有利于自由絲狀體的生長，并穩(wěn)定和放大了突變型絲狀體的突變特性。

由于自由絲狀體采苗［24］、單孢子采苗［25］、紫菜葉狀體細胞酶法采苗［26］等無培養(yǎng)基質(zhì)采苗量達不到生產(chǎn)實踐要求，目前已被市場淘汰，當前紫菜種苗產(chǎn)業(yè)大多依然沿用基質(zhì)培養(yǎng)技術進行種苗培育，絲狀體雖然在不同基質(zhì)上的生長發(fā)育情況不一，但每種基質(zhì)有其自身的優(yōu)缺點。天然的貝殼由碳酸鈣和蛋白質(zhì)構成［27］，貝殼絲狀體具有特殊的生長方式，浮游狀態(tài)的果孢子遇貝殼基質(zhì)后會萌發(fā)形成絲狀體后鉆入貝殼生長［28］，硅藻、藍藻等雜藻不具備鉆入貝殼的能力，因此生產(chǎn)實踐中，通過簡單清洗貝殼表面即可去除大部分雜藻、純化、大規(guī)模培養(yǎng)貝殼絲狀體，而在海水中篩選擴繁自由絲狀體則容易受到雜藻的污染［29］。扇貝殼為采苗常用的純天然材料，主要成分為碳酸鈣、幾丁質(zhì)及蛋白質(zhì)；瓊脂固體培養(yǎng)基是在海水培養(yǎng)液中加入凝固劑瓊脂而制成的，主要是提供固體支撐面，便于絲狀體地鉆入，絲狀體在兩種固態(tài)基質(zhì)中的生長及發(fā)育水平有差異，可能與培養(yǎng)基質(zhì)的結構和有機成分等因素有關。扇貝殼的內(nèi)層由文石晶體組成［30］，扇貝殼內(nèi)層的方解石晶體具有16°～28°的傾斜角度，乳突層的晶體取向是隨機的，這些天然生物基質(zhì)中均含有1%～5%的有機成分［31］，區(qū)別于瓊脂培養(yǎng)基中的單一營養(yǎng)成分。絲狀體在瓊脂培養(yǎng)基上的生長發(fā)育水平劣于在貝殼上，說明絲狀體的生長能力可能與基質(zhì)的有機成分有關，瓊脂的硬度可能會影響絲狀體的鉆入能力，厚度可能會直接影響后期殼孢子放散水平，說明絲狀體的生長能力還可能與瓊脂的硬度和厚度有關，有必要進一步開展不同濃度和厚度的瓊脂培養(yǎng)基對自由絲狀體的影響試驗。

本研究中，粉色突變體和綠色突變體的顯微結構和生長形狀存在明顯差異。粉色突變體分枝的頂端細胞體積變大，呈紡錘形或其他不規(guī)則形狀。在相同溫度下，粉色突變體的長度、寬度和分枝數(shù)量均高于對照組，其中，23 ℃條件下寬度和分枝數(shù)量均最高。同時，相對于對照組，粉色突變體在各種培養(yǎng)基質(zhì)中生長狀態(tài)更好。裘葉帆等［32］研究發(fā)現(xiàn)，紅色突變體的葉狀體生長快于野生壇紫菜；綠色突變體能穩(wěn)定生長于基質(zhì)上，分枝清晰可見，藻絲寬度略高于對照組。60Co-γ射線輻射會影響植物體內(nèi)葉綠素含量，導致不同程度上影響植物的光合作用［33-34］，綜上，推測是由于紅色突變體和綠色突變體之間存在生長差異。

4 結論

本研究對壇紫菜自由絲狀體進行60Co-γ 輻射，發(fā)現(xiàn)射線促進了絲狀體的鉆殼能力，輻射后的絲狀體在貝殼上表現(xiàn)出了豐富的突變特性，1 000 Gy 處理組的貝殼絲狀體突變率最高，為0.382‰，高于自由絲狀體階段的突變率。對篩選到的粉色和綠色突變體進行適宜基質(zhì)和溫度探究，發(fā)現(xiàn)兩種突變體在23 ℃的培養(yǎng)溫度和貝殼培養(yǎng)基質(zhì)下，生長發(fā)育水平達到最佳，且粉色突變體的生長性能優(yōu)于對照組，說明粉色突變體可能具有良好的培育潛力。綠色突變體在海水、瓊脂培養(yǎng)基、貝殼上的生長優(yōu)勢均低于對照組，但其鉆殼能力相對弱于對照組，下一步可開展更多的基質(zhì)篩選試驗。