白路遙，楊雪飛，魯春華*，沈月毛

（1.山東大學藥學院天然產物生物學教育部重點實驗室，山東 濟南 250012；2.中國科學院昆明植物研究所植物資源與生物技術研究室，云南 昆明 650201）

流蘇子[Coptosapelta diffusa （Champ.ex Benth.）Steenis]是茜草科流蘇子屬植物，主要分布于中國長江流域及其以南各地和日本的溫帶地區(qū)[1]。《中華本草》記載其根為藥用部位。將其根部加水煮沸后清洗，或直接將根研末調涂患處可治療皮炎、濕疹瘙癢、蕁麻疹、風濕痹痛、瘡疥等皮膚病。作為一種傳統(tǒng)中草藥，其化學成分和藥理活性研究較少。目前，從該植物中已報道的化學成分共約50 個[2-4]，包括蒽醌、萘醌、香豆素和萜類等。本課題組前期已從其地上部分分離得到結構新穎的環(huán)烯醚萜苷和愈創(chuàng)木烯型倍半萜等化合物[3]。

為進一步挖掘流蘇子中的化學成分，本實驗對其根部的化學成分進行系統(tǒng)分離，共鑒定了12 個化合物（圖1），包括6 個萘醌lapachol（1）、hydroxyhydrolapachol（2）、dehydro-α-lapachone（3）、α-lapachone（4）、rhinacantin A（5）和β-lapachone（6），2 個蒽醌2-carbomethoxyanthraquinone （7） 和7-hydroxy-2-methylanthraquinone（8），1 個香豆素isoscopoletin（9），1 個環(huán)烯醚萜alyxialactone（10），1 個芳香化合物（3S）-3-（hydroxymethyl）-3H-isobenzofuran-1-one（11）和1 個木脂素（7’S，8S，8’R）-4，4’-dihydroxy-3，3’，5，5’-tetramethoxy-7，9-epoxylignan-9’-ol-7-one（12）。通過紙片擴散法篩選了化合物1～12 的抗菌活性，并利用微量稀釋法進行了最小抑制濃度測定。此外，采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）對主要成分拉帕醇（lapachol，1）進行了含量測定。

圖1 化合物1～12 的化學結構

1 儀器與材料

Bruker Avance 400 MHz 型核磁共振儀（德國Bruker 公司）；分析型高效液相色譜儀Thermo Scientific UltiMate 3000 （Hypersil GOLDTM，5 μm，250 mm ×4.6 mm）；旋轉蒸發(fā)儀R-100 （BUCHI Labortechnik AG）；柱色譜硅膠（200～300 目，青島海洋化工廠）；硅膠薄層層析板（煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司）；葡聚糖凝膠（25～100 μm，GE Healthcare Bio-Sciences AB）；氘代試劑（上海新鉑化學有限公司）；石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇（分析純，天津恒興化學制造有限公司）。酵母提取物（OXOID），胰蛋白胨（OXOID），氯化鈉（國藥基團化學試劑有限公司）。

流蘇子根于2020 年10 月采集于廣西防城港市上思縣南屏鄉(xiāng)汪樂村向十萬大山森林公園方向平龍山木材檢查站（北緯21°51′47.37″，東經107°53′0.85″，509 米處）。由中國科學院昆明植物研究所楊雪飛、楊錦超鑒定為流蘇子 [Coptosapelta diffusa（Champ.ex Benth.）Steenis]，標本號為yangxf0209，收藏于中國科學院昆明植物研究所標本館?？咕鷮嶒炈貌≡甘揪航瘘S色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC25923）、恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis MC2155）、變形桿菌（Proteusbacillus vulgaris CPCC160013）和白色念珠菌（Candida albicans 5314）菌株均保存于山東大學天然產物化學生物學教育部重點實驗室。

2 提取與分離

新鮮流蘇子根剪成小段，自然風干稱重（600.0 g）。用95 %乙醇浸泡1 周，超聲輔助提取30 min，共提取3 次，合并乙醇提取液，40℃減壓濃縮得提取物浸膏（40.0 g）。該提取物首先經正相硅膠柱層析（250.0 g），石油醚-乙酸乙酯（100 ∶1～10 ∶1，v/v）梯度洗脫，根據(jù)TLC 檢測（紫外和磷鉬酸顯色） 結果分為25 個組分（Fr.A～Y）。

Fr.J（2.5 g）經正相硅膠柱層析（80.0 g），石油醚-乙酸乙酯（200 ∶1～100 ∶1） 梯度洗脫，得到化合物1（2.2 g）。Fr.K（104.9 mg）經正相硅膠柱層析（10.0 g），石油醚-乙酸乙酯（200 ∶1～100 ∶1）梯度洗脫，得到組分Fr.K1～K3。Fr.K1（36.8 mg）經Sephadex LH-20 凝膠柱層析，二氯甲烷-甲醇（1 ∶3）洗脫，得到化合物3（10.2 mg）。Fr.K2（60.1 mg）經Sephadex LH-20 凝膠柱層析，二氯甲烷-甲醇（1 ∶3）洗脫，得化合物7（4.9 mg）。Fr.L（88.1 mg）經葡聚糖凝膠柱層析，二氯甲烷-甲醇（1 ∶3）洗脫，得化合物4（5.1 mg）。Fr.Q（25.8 mg）經葡聚糖凝膠柱層析，MeOH 洗脫，得化合物8（1.7 mg）。Fr.R 經Sephadex LH-20 柱層析，甲醇洗脫，得到7 個組分（Fr.R1～R7）。Fr.R2（11.7 mg）經正相硅膠柱層析（2.5 g），石油醚-乙酸乙酯（30 ∶1）等度洗脫，得到化合物6（2.2 mg）。Fr.U（900.0 mg）經Sephadex LH-20 柱層析，MeOH 洗脫，得到19 個組分（Fr.U1～U19）。Fr.U8（270.0 mg）經Sephadex LH-20 柱層析，甲醇洗脫合并后又經正相硅膠柱層析（2.0 g），二氯甲烷-甲醇（500 ∶1） 等度洗脫，得到化合物2（12.6 mg）、5（2.5 mg）和11（3.4 mg）。Fr.U13（31.5 mg）經正相硅膠柱層析（2.0 g），二氯甲烷-甲醇（200 ∶1）等度洗脫，得到化合物9（9.9 mg）。Fr.W（0.6 g）經正相硅膠柱層析（12.0 g），石油醚-乙酸乙酯（15 ∶1～1 ∶2）梯度洗脫，得到Fr.W1～W6。Fr.W2（106.5 mg）經Sephadex LH-20 柱層析，甲醇洗脫，得到化合物12（2.2 mg）。Fr.W4（120.0 mg）經Sephadex LH-20 柱層析，甲醇洗脫后又經正相硅膠柱層析（1.5 g），二氯甲烷-甲醇（100 ∶1～50 ∶1）梯度洗脫，得到化合物10（7.8 mg）。

3 結構鑒定

化合物1：黃色片狀結晶，C15H14O3。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：8.11（1H，dd，J=7.7，1.4 Hz，H-8），8.09（1H，dd，J=7.7，1.4 Hz，H-5），7.74 （1H，td，J=7.7，1.4 Hz，H-7），7.67（1H，td，J=7.7，1.4 Hz，H-6），7.30（1H，s，OH），5.21（1H，m，H-12），3.31（2H，d，J=7.3 Hz，H-11），1.79 （3H，s，CH3-14），1.68 （3H，s，CH3-15）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：184.5（C-1），181.7（C-4），152.7（C-3），134.8（C-7），133.8（C-13），133.0（C-9），132.8（C-6），129.5（C-10），126.8（C-8），126.1（C-5），123.5（C-2），119.7（C-12），25.7（C-15），22.6（C-11），17.9（C-14）。以上數(shù)據(jù)與文獻[5]對比，鑒定化合物為拉帕醇lapachol。

化合物2：黃色粉末，C15H16O4。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：8.12（1H，dd，J=7.6，1.5 Hz，H-5），8.08（1H，dd，J=7.6，1.4 Hz，H-8），7.76 （1H，td，J=7.6，1.4 Hz，H-6），7.69（1H，td，J=7.6，1.5 Hz，H-7），2.71（2H，t，J=6.6 Hz，H-11），1.70（2H，t，J=6.6 Hz，H-12），1.31（6H，s，CH3-14，CH3-15）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：184.8（C-4），181.3（C-1），153.0（C-2），134.9（C-6），133.0（C-7），129.5（C-9），132.9（C-10），126.8（C-5），126.2（C-8），124.7（C-3），71.0（C-13），41.6（C-12），29.1（C-14，15），18.3（C-11）。以上數(shù)據(jù)與文獻[6]對比，鑒定化合物為hydroxyhydrolapachol。

化合物3：黃色粉末，C15H12O3。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：8.10 （2H，dd，J=7.0，1.7 Hz，H-5，8），7.71 （1H，td，J =7.0，1.7 Hz，H-6），7.68 （1H，td，J =7.0，1.7 Hz，H-7），6.66（1H，d，J=10.0 Hz，H-11），5.73（1H，d，J=10.0 Hz，H-12），1.56 （6H，s，CH3-14，15）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：181.9（C-1），179.9（C-4），152.5（C-3），134.0（C-6），133.2（C-7），131.6（C-10），131.5（C-9），130.9（C-12），126.3（C-5），126.3（C-8），117.9（C-2），115.5（C-11），80.5（C-13），28.4（C-14，15）。以上數(shù)據(jù)與文獻[7]對比，鑒定化合物為dehydro-α-lapachone。

化合物4：黃色粉末，C15H14O3。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：8.09（1H，dd，J=6.6，1.8 Hz，H-8），8.07（1H，dd，J=7.4，1.7 Hz，H-5），7.68（1H，m，H-7），7.66（1H，m，H-6），2.63（2H，t，J=6.6 Hz，C-11），1.82（2H，t，J=6.6 Hz，C-12），1.44（6H，s，CH3-14，15）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：184.4（C-1），180.1（C-4），154.7（C-3），133.8（C-7），132.8（C-6），132.0（C-9），131.2（C-10），126.4（C-5），126.0（C-8），120.2（C-2），78.2（C-13），31.4（C-12），26.5（C-14，15），16.8（C-11）。以上數(shù)據(jù)與文獻[8]對比，鑒定化合物為α-lapachone。

化合物5：黃色粉末，C15H14O4。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：8.04（1H，m，H-5），8.02（1H，m，H-8），7.63（1H，m，H-6），7.60（1H，m，H-7），3.82（1H，m，H-12），2.83（1H，m，H-12a），2.65（1H，m，H-12b），1.41（3H，s，CH3-14），1.35（3H，s，CH3-15）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：184.8（C-1），179.5（C-4），153.8（C-3），134.0（C-7），133.2（C-6），132.1（C-9），131.2（C-10），126.4（C-5），126.0（C-8），118.2（C-2），80.2（C-13），68.4（C-12），25.4（C-11），24.7（C-15），21.7（C-14）。以上數(shù)據(jù)與文獻[9]對比，鑒定化合物為rhinacantin A。

化合物6：黃色粉末，C15H14O3。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：7.91（1H，dd，J=7.7，1.4 Hz，H-8），7.76（1H，dd，J=7.7，1.3 Hz，H-5），7.63 （1H，td，J=7.7，1.4 Hz，H-6），7.48（1H，td，J=7.6，1.3Hz，H-7），2.44（2H，t，J=6.7 Hz，C-11），1.81（2H，t，J=6.6 Hz，C-12），1.40（6H，s，CH3-14，15）；13C NMR （100 MHz，CDCl3）δ：179.9（C-1），178.6（C-2），162.1（C-4），134.8（C-6），132.7（C-10），130.7（C-7），130.2（C-9），128.6（C-8），124.1（C-5），112.8（C-3），79.3（C-13），31.6（C-12），26.8（C-14，15），16.2（C-11）。以上數(shù)據(jù)與文獻[10]對比，鑒定化合物為β-lapachone。

化合物7：黃色粉末，C16H10O4。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：8.95（1H，d，J=1.7 Hz，H-1），8.41（1H，dd，J=8.1，1.7 Hz，H-3），8.39（1H，d，J=8.1 Hz，H-4），8.36（1H，m，H-8），8.35（1H，m，H-5），7.84（1H，m，H-6），7.83 （1H，m，H-7），4.02 （3H，s，OCH3）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：182.6（C-9），182.3（C-10），165.6（COO），136.1 （C-4a），135.2 （C-9a），134.6 （C-3），134.5 （C-6），134.4 （C-7），133.6 （C-2），133.5 （C-10a），133.4（C-8a），128.7（C-1），127.6（C-4），127.5（C-8），127.4（C-5），52.8（OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻[11]對比，鑒定化合物為2-carbomethoxyanthraquinone。

化合物8：黃色粉末，C15H10O3。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：11.05（1H，s，OH），8.09（1H，m，H-5），8.07（1H，m，H-4），7.97（1H，s，H-1），7.71（1H，d，J =8.0 Hz，H-3），7.50 （1H，d，J =2.6 Hz，H-8），7.24（1H，dd，J =8.6，2.6 Hz，H-6），2.50（3H，s，CH3）；13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：183.3（C-9），181.5（C-10），163.5（C-7），145.2（C-2），135.7（C-3），135.7（C-9a），133.5（C-8a），131.4（C-4a），130.2（C-4），127.3（C-1），127.3 （C-5），125.7 （C-10a），122.0 （C-6），112.7（C-8），21.8（CH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻[12]對比，鑒定化合物為7-hydroxy-2-methylanthraquinone。

化合物9：黃色粉末，C10H8O4。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：7.92（1H，d，J=9.4 Hz，H-4），7.22（1H，s，H-5），6.79（1H，s，H-8），6.22（1H，d，J=9.4 Hz，H-3），3.82（3H，s，OCH3）；13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：161.2（C-2），151.7（C-6），150.0（C-9），145.7（C-7），144.9（C-4），112.1（C-5），110.9（C-10），110.0（C-3），103.2（C-8），56.4（OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻[13]對比，鑒定化合物為isoscopoletin。

化合物10：白色粉末，C10H16O4。1H NMR（400 MHz，CD3OD）δ：4.39（1H，m，H-1a），4.11（1H，m，H-7），4.08 （1H，m，H-1b），3.80 （1H，m，H-11a），3.70（1H，m，H-11b），2.56（1H，m，H-4），2.55（1H，m，H-5），2.22（1H，m，H-9），2.16（1H，m，H-6a），1.77（1H，m，H-8），1.62（1H，m，H-6b），1.05（3H，d，J =6.8 Hz，CH3-10）；13C NMR （100 MHz，CD3OD）δ：176.0 （C-3），76.0（C-7），69.5（C-1），59.3（C-11），46.3（C-4），42.6（C-9），42.2（C-8），40.7（C-6），35.4（C-5），12.2（C-10）。以上數(shù)據(jù)與文獻[14]對比，鑒定化合物為alyxialactone。

化合物11：黃色粉末，C9H8O3。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：7.86（1H，d，J=7.6 Hz，H-4），7.63（1H，m，H-5），7.50（1H，t，J=7.6 Hz，H-6），7.45（1H，d，J=7.6 Hz，H-7），5.50 （1H，m，H-3），4.07 （1H，dd，J =8.4，3.4 Hz，H-10a），3.86（1H，dd，J=12.5，5.6 Hz，H-10b）；13C NMR （100 MHz，CDCl3）δ：170.4 （C-1），146.6（C-9），134.3（C-5），129.6（C-6），126.5（C-8），125.9（C-4），122.1（C-7），81.7（C-3），64.0（C-10）。以上數(shù)據(jù)與文獻[15]對比，鑒定化合物為（3S）-3-（hydroxymethyl）-3H-isobenzofuran-1-one。

化合物12：白色粉末，C22H26O9。1H NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.40 （2H，s，H-2，H-6），6.72（2H，s，H-2’，H-6’），4.64 （1H，m，H-7’），4.27 （1H，m，H-8），4.22（1H，m，H-9a），4.19（1H，m，H-9b），3.92（6H，s，H-3’a，H-5’a），3.86 （6H，s，H-3a，H-5a），3.67（2H，m，H-9），2.64 （1H，m，H-8’）；13C NMR（100 MHz，CD3OD）δ：198.9（C-7），147.8（C-3），147.8（C-3’），147.7（C-5），147.7（C-5’），141.3（C-4），141.3（C-4’），131.5 （C-1’），127.3 （C-1），106.3 （C-2），106.3（C-6），103.8（C-2’），103.8（C-6’），84.0（C-7’），70.2（C-9），59.9（C-9’），55.5（3’a，5’a-OCH3），55.3（3a，5a-OCH3），53.4（C-8’）。以上數(shù)據(jù)與文獻[16]對比，鑒定化合物為（7’S，8S，8’R）-4，4’-dihydroxy-3，3’，5，5’-tetramethoxy-7’，9-epoxylignan-9’-ol-7-one。

4 抗菌活性篩選

4.1 紙片擴散法測抗菌活性 利用紙片擴散法[17]測定化合物1～12 的抗菌活性。從-80 ℃冰箱中取出保存于20%甘油管中的各指示菌，解凍后在LB 平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)10～12 h。挑取單克隆菌株分別接種于1 mL 的LB 液體培養(yǎng)基中，置于220 rpm，37 ℃搖床中培養(yǎng)過夜。取LB 液體培養(yǎng)基將菌液稀釋100倍，混勻后倒入滅菌的LB 平板中，凝固后待用。用鑷子將直徑6 mm 的圓形濾紙片夾起，加入2 μL 的化合物溶液（各化合物分別用甲醇溶解，濃度為20 μg/μL），揮干溶劑后放置于含指示菌的LB 平板上，倒置于37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h 后觀察并記錄抑菌圈的有無及大小，結果見表1。

表1 抗菌結果（抑菌圈直徑大小單位：mm；N：無抑菌圈）

4.2 最小抑菌濃度（MIC）測定 采用微量肉湯稀釋法[18]測定上述有抑菌活性化合物的MIC。將菌液用無菌的液體LB 培養(yǎng)基稀釋104倍。首先，在96 孔板中加入100 μL 的LB 液體培養(yǎng)基，采用對倍稀釋法加入藥物，每個孔加入菌液100 μL，重復3 次。藥物終濃度分別為128、64、32、16、8、4、2 和1 μg/mL。陰性對照：僅加LB 液體培養(yǎng)基和菌液；陽性對照：加入卡那霉素，藥物濃度分別為128、64、32、16、8、4、2 和1 μg/mL。37 ℃培養(yǎng)16～24 h，沒有可見菌生長的最低濃度即為MIC 值。結果見表2。

表2 化合物對4 種病原菌的MIC（μg/mL）

5 拉帕醇（lapachol，1）的含量測定

5.1 色譜條件 流動相由0.5‰甲酸水溶液（A）和乙腈（B）組成，流速為1 mL/min，50% B（0～30 min）等度洗脫。柱溫30 ℃，進樣量20 μL，檢測波長254 nm。

5.2 溶液的制備 對照品溶液：精密稱取lapachol 3.500 mg，置入具塞的5 mL 容量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度定容，搖晃均勻，制成濃度為0.7 mg/mL 的溶液。

供試品溶液：精密稱取3.306 0 g 流蘇子干燥根，用95%乙醇浸泡1 周，超聲輔助提取30 min，共提取3 次。合并提取液，40℃減壓濃縮得到184 mg 乙醇提取物，甲醇溶解，置入具塞的10 mL 容量瓶中，定容至刻度，搖晃均勻，通過0.22 μm 微孔濾膜過濾后，取濾液100 μL 稀釋至1 mL 為供試品溶液。

5.3 線性關系的考察 將對照品溶液用甲醇稀釋成一系列不同濃度的對照品溶液（700、350、175、87.5、43.75 和21.875 mg/L）進行測定。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸。測定一系列不同濃度的對照品溶液的峰面積，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，計算得到lapachol 的線性回歸方程：y=1.7239x+8.9959，其中x 為濃度，y 為峰面積，回歸系數(shù)r=0.9999 （圖2）。表明lapachol 在21.875～700 mg/L 范圍內與峰面積呈現(xiàn)較好的線性關系。

圖2 lapachol 的標準曲線

5.4 樣品的含量測定 按外標法，測得lapachol 的峰面積為211.9190，計算出流蘇子根中l(wèi)apachol 的含量為3.56 g/kg（干重）。

6 結果與討論

本研究對流蘇子根的化學成分進行了系統(tǒng)分離，共鑒定了12 個化合物的結構，其中4～6 和10～12 為首次從該植物中分離得到。采用紙片擴散法和微量稀釋法進行了抗菌活性篩選，結果表明：1～4 對恥垢分枝桿菌表現(xiàn)出較好的抗菌活性，其MIC 值為8～32 μg/mL；化合物6 對金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和變形桿菌表現(xiàn)出較好的抗菌活性，其MIC 分別為8、8和16 μg/mL。通過HPLC 定量分析測定主要成分lapachol 在根（干重）中的含量為3.56 g/kg，表明流蘇子可以作為拉帕醇的資源植物。Lapachol 是一種天然存在的1，4-萘醌類成分，具有抗腫瘤[19]、抗寄生蟲[20]、抗瘧疾[21]、抗菌[22]等多種藥理活性。該研究結果為流蘇子根抗菌消炎的民間藥用價值提供了科學依據(jù)，并為其深入研究與開發(fā)利用提供了科學依據(jù)。