弓 強 黃浩楹 陳樂樂 柴 智 樊慧杰

（山西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山西 晉中 030619）

百合科植物知母（Anemarrhena asphodeloidesBge.）主要分布于山西、河北及山東等地，是多年生草本植物，春、秋二季采挖，以干燥根莖入藥。中藥材知母的藥用歷史有2000年之久，歷代本草古籍均有記載。知母味甘、苦，性寒，有清熱瀉火、滋陰潤燥之功效，是常用的清熱瀉火類中藥［1］。現(xiàn)代藥理研究認(rèn)為知母具有解熱［2，3］、降血糖［4］、改善認(rèn)知缺陷［5］、抗炎和免疫調(diào)節(jié)［6］等方面的作用。

石竹科植物石竹（Dianthus chinensisL.）主要分布于河北、河南、遼寧及江蘇等地，是多年生草本植物，夏、秋二季花果期采割，以干燥地上部分入藥稱為瞿麥（Dianthus superbusLinn.）。瞿麥最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為中品，藥用歷史悠久。瞿麥味苦，性寒，歸心、小腸經(jīng)，屬于利水滲濕類中藥，有利尿通淋、活血通經(jīng)之功效，臨床用于熱淋、血淋、石淋和小便不通等方面的治療［7］。現(xiàn)代藥理研究認(rèn)為，瞿麥具有抗腫瘤［8，9］和潛在治療吉蘭-巴雷綜合征［10］的作用。

目前，知母和石竹均未有深入到基因組學(xué)的研究，而基因組學(xué)研究的首要前提是測定基因組大小?；蚪M大小是指生物單倍體細(xì)胞的DNA含量（又稱C值）。本實驗欲采用流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry，F(xiàn)CM）測定知母和石竹的基因組大小，為基因組學(xué)研究提供重要數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料知母和石竹是待測植物，采自山西中醫(yī)藥大學(xué)校園中草藥種植基地；蒙古黃芪是測定的內(nèi)標(biāo)植物，采自山西中醫(yī)藥大學(xué)校園中草藥種植基地。將三種植株的幼嫩葉片作為細(xì)胞核的提取材料。

1.2 實驗儀器、試劑和耗材流式細(xì)胞儀BD Accuri C6 PLUS 購自美國BD 公司。試劑Triton X-100（批號D220BA0041）、 四 鹽 酸 精 胺（ 批 號512BA0029）、Na2EDTA（批號D328BA0007）購自BBI生命科學(xué)有限公司。試 劑NaCl （批 號D710BA0034）、KCl （批 號D316BA0025）購自生工生物工程上海股份有限公司。β-巰基乙醇（批號D124BA0001）購自美國Sigma-Aldrich 股份有限公司。碘化丙啶（PI）（批號326C042 8）、核糖核酸酶A（RNase）（批號20170607）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）（批號0922S0714）、400 目尼龍篩網(wǎng)（批號20161111）購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.3 FCM測定知母和石竹基因組大小的方法

1.3.1 制備裂解液LB01裂解液LB01：15 mmol/L Tris，2 mmol/L Na2EDTA，0.5 mmol/L 四鹽酸精胺，80 mmol/L KCl，20 mmol/L NaCl，0.1%Triton X-100，15 mmol/L β-巰基乙醇；調(diào)pH至7.5。

1.3.2 制備細(xì)胞核濾液分別采集知母、石竹、蒙古黃芪、知母和蒙古黃芪等質(zhì)量混合、石竹和蒙古黃芪等質(zhì)量混合的幼嫩葉片，每份20 mg。蒸餾水清洗葉片，濾紙吸凈表面水分。置葉片于玻璃培養(yǎng)皿中，加入預(yù)冷LB01解離液1 mL。鋒利刀片迅速垂直切碎葉片，混勻，冰上靜置培養(yǎng)皿5 min。尼龍篩網(wǎng)過濾，收獲細(xì)胞核濾液［11］，依次加入1 mg/L 的RNase 20 μL、1 mg/L 的PI 20 μL，置于4 ℃冰箱染色5 min。

1.3.3 FCM 檢測輕搖流式管分散細(xì)胞核，上流式細(xì)胞儀檢測，低速抽取5000 個PI 染色的細(xì)胞核。選用波長488 nm 的藍(lán)光激發(fā)熒光PI，藻紅蛋白（PE）通道收集熒光強度的數(shù)據(jù)和圖像。變異系數(shù)（Coefficient of variation，CV）＜5%，表明數(shù)據(jù)可信［12］。數(shù)據(jù)和圖像用流式細(xì)胞儀軟件分析，將數(shù)據(jù)代入基因組大小的計算公式，待測植物基因組大小=待測植物熒光強度的均值/內(nèi)標(biāo)蒙古黃芪熒光強度的均值×內(nèi)標(biāo)蒙古黃芪基因組大小（蒙古黃芪基因組大小為1.46 Gb）［13，14］。

2 結(jié)果與分析

知母、石竹、蒙古黃芪分別用FCM 檢測，單獨檢測結(jié)果見圖1。據(jù)此可見知母和石竹的出峰位置均與蒙古黃芪的出峰位置不同，可以保證蒙古黃芪作為測定內(nèi)標(biāo)時，實驗的可行性與結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖1 單獨樣品的FCM檢測結(jié)果

知母和內(nèi)標(biāo)蒙古黃芪混合樣品的FCM 檢測結(jié)果見圖2 和表1。據(jù)此可見散點圖中有兩團(tuán)集中的粒子團(tuán)，峰圖中兩峰獨立、峰形佳，知母和蒙古黃芪的CV 均小于5%，各數(shù)據(jù)可信，進(jìn)而可知知母的熒光強度均值為287 888.33，蒙古黃芪的熒光強度均值為167 845.33，將各均值代入計算公式中，得到知母的基因組大小為2.50 Gb。

表1 知母基因組大小的測定結(jié)果

圖2 知母和內(nèi)標(biāo)蒙古黃芪混合樣品的FCM檢測結(jié)果

石竹和內(nèi)標(biāo)蒙古黃芪混合樣品的FCM檢測結(jié)果見圖3和表2。據(jù)此可見散點圖中有兩團(tuán)界限清晰的粒子團(tuán)，峰圖中兩峰不重疊、峰形佳，石竹和蒙古黃芪的CV都小于5%，各數(shù)據(jù)可信，進(jìn)而可知石竹的熒光強度均值為101 071.33，蒙古黃芪的熒光強度均值為159 980.67，將各均值代入計算公式中，得到石竹的基因組大小為0.92 Gb。

表2 石竹基因組大小的測定結(jié)果

圖3 石竹和內(nèi)標(biāo)蒙古黃芪混合樣品的FCM檢測結(jié)果

3 討論

FCM 是測定植物基因組大小的首選方法，在測定時需要選用一個已知基因組大小的植物作為標(biāo)準(zhǔn)品。具體應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品測定基因組大小的方法有兩種：一種為外標(biāo)法；另一種為內(nèi)標(biāo)法。外標(biāo)法是分別單獨上機測定待測物和標(biāo)準(zhǔn)品的熒光強度，內(nèi)標(biāo)法是待測物中加入標(biāo)準(zhǔn)品以混合樣品上機檢測熒光強度。雖然外標(biāo)法較為簡便，但是一般采用內(nèi)標(biāo)法測定待測物的基因組大小，因為內(nèi)標(biāo)法可以保證混合之后的操作過程和環(huán)境一樣，能在相同的條件下測定待測物，減少了實驗誤差，結(jié)果更為準(zhǔn)確［15］。但是內(nèi)標(biāo)法需要注意篩選合適的內(nèi)標(biāo)，以避免待測物的峰位和內(nèi)標(biāo)的峰位出現(xiàn)重疊現(xiàn)象。

前期預(yù)實驗中，選用大豆Williams 82 為知母和石竹基因組大小測定的共同內(nèi)標(biāo)，研究發(fā)現(xiàn)石竹的峰位與大豆Williams 82 的熒光峰位出現(xiàn)重疊，區(qū)分度不佳，初步推測石竹的基因組大小與大豆Williams 82的1.11 Gb的數(shù)值接近。蒙古黃芪已在前期的實驗中測定出其基因組大小為1.46 Gb［14］，并且由于本實驗室蒙古黃芪的數(shù)量充足、細(xì)胞核提取方便，所以選定蒙古黃芪作為知母和石竹基因組大小測定的共同內(nèi)標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)標(biāo)蒙古黃芪有效避免了與待測物知母和石竹熒光信號的重疊，知母 的CV 值 為4.82%～4.98%，石 竹 的CV 值 為3.96%～4.49%，蒙古黃芪的CV值亦未超過5%，故蒙古黃芪適合作為知母和石竹的內(nèi)標(biāo)植物，保證基因組大小測定的可行性和準(zhǔn)確性。進(jìn)而測定出知母的基因組大小為2.50 Gb；石竹的基因組大小為0.92 Gb。知母、石竹與內(nèi)標(biāo)蒙古黃芪，三者基因組大小的關(guān)系是：石竹＜蒙古黃芪＜知母?；蚪M大小在很大程度上是恒定不變的，是生物的一個基本特征?；蚪M大小是物種基因組測序中的一項重要的研究內(nèi)容。本研究不僅可以為其他植物基因組大小的測定提供借鑒；而且可以促進(jìn)知母和石竹的基因組資源開發(fā)，有助于深入認(rèn)識知母和石竹。