李鳳巍，裴悅宏，張曉楓，王智，陳海濤，徐宸，冉茂，孫現(xiàn)超

1.西南大學(xué) 植物保護學(xué)院，重慶 400715；2.中國煙草總公司重慶市公司煙葉分公司，重慶 400020；3.中國煙草總公司重慶市公司石柱分公司，重慶 409100

煙草作為我國重要的經(jīng)濟作物,其產(chǎn)品質(zhì)量受到生物與非生物脅迫等多方面的影響[1-3]．煙草葉部病害往往是直接危害煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量最主要的因素之一,常見的煙草葉部真菌、病毒、細菌類病害主要有煙草赤星病[4]、煙草病毒病[5]、煙草野火病[6]和煙草角斑病[7]等,這些病害的發(fā)生往往會給煙草行業(yè)帶來不可估量的經(jīng)濟損失．隨著對幾種常見煙草葉部病害重視的加強以及研究的深入,已經(jīng)篩選出有效的防治手段及綜合防控措施[8-10],并且相關(guān)的病害發(fā)生預(yù)測模型[11-13]也基本建立起來．比如,袁守超[14]建立了煙草赤星病、野火病及角斑病等3種病害的預(yù)測模型,并推測出其發(fā)病規(guī)律與流行趨勢,進一步分析出防治指標．

煙草靶斑病自2005年在我國遼寧丹東地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)發(fā)生以來[15],在東北煙區(qū)大面積發(fā)病,隨后迅速擴散至全國各地．近5年來,云南[16]、湖南[17]、四川[18]、貴州[19]等多個西南地區(qū)的煙區(qū)均有報道煙草靶斑病的發(fā)生．煙草靶斑病發(fā)病時,煙草葉片形成不規(guī)則病斑,一般形成同心輪紋,壞死部分易脫落形成穿孔[20],通常在田間相對濕度較大時容易大規(guī)模發(fā)生[21-22],導(dǎo)致對其防治比較困難．目前對于煙草靶斑病比較有效的防治措施主要為化學(xué)防治,田亮等[23]通過比較不同藥劑對煙草靶斑病的防控效果,篩選出80%波爾多液+38%吡唑醚菌酯·啶酰菌胺對煙草靶斑病防治效果較好,且藥效持續(xù)時間長．吳元華[24]在11種化學(xué)殺菌劑和9種生物殺菌劑中篩選出咯菌腈和丁子香酚對煙草靶斑病菌抑制作用最強．同時,最近也有研究表明0.3%四霉素對煙草靶斑病菌的抑制效果較好,其抑制中濃度EC50達到0.04 mg/L[25]．在生物防治方面,目前對于煙草靶斑病的防治方法報道較少,莽春霞[26]、尹秀娟等[27]篩選出一種對煙草靶斑病菌具有抑制作用的生防菌灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus),其抑菌圈直徑為14 mm,抑菌率達到90.88%．近幾年,也有研究發(fā)現(xiàn)鏈霉菌KX852460 (Streptomycesstrain)[28]、貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)[29]等生防菌對煙草靶斑病病原菌(Rhizoctoniasolani)具有顯著的拮抗作用．但是,目前國內(nèi)外對于煙草靶斑病還沒有有效的防治方法,也沒有建立相關(guān)預(yù)測模型和形成完整的綠色防控體系．因此,十分有必要建立更快、更準確及時的煙草靶斑病檢測體系,從而更有效地防治煙草靶斑病的發(fā)生,也更利于貫徹“預(yù)防為主,綠色防控”的方針．

實時熒光定量PCR(Real time fluorescence quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-qPCR)相比于普通PCR具有更高的靈敏性及特異性的特點[30],基于這些優(yōu)點,近年來,越來越多應(yīng)用RT-qPCR技術(shù)體系快速檢測植物病原菌的報道[31]．例如,劉美等[32]建立SYBR Green Ⅰ染料的實時熒光定量PCR技術(shù)用于檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒．謝中玉等[33]根據(jù)鏈格孢屬ITS基因序列差異位點,設(shè)計特異性引物,并構(gòu)建了基于SYBR Green Ⅰ煙草赤星病菌實時熒光定量PCR快速定量檢測方法．目前,已有研究報道了基于Taqman探針的實時熒光定量PCR體系用于檢測煙草靶斑病菌[34],但該方法存在檢測成本較高,不適用于煙草田間大規(guī)模病害發(fā)生的檢測等缺點．而基于SYBR Green Ⅰ的實時熒光定量PCR技術(shù)成本相對較低,并且可以實現(xiàn)更快、更精確的定量．因此,本研究針對煙草靶斑病菌建立SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR檢測體系,并確定了煙草靶斑病最低發(fā)病菌量,對煙草靶斑病的快速檢測、提前防治以及降低經(jīng)濟損失具有重要意義,為田間煙草靶斑病的有效檢測和及時防治提供有效依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

供試病原菌：煙草靶斑病病原菌(RhizoctoniasolaniAG-3)YC-9由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)吳元華教授饋贈,煙草赤星病病原菌(Alternariaalternata)PZh4和煙草棒孢霉葉斑病病原菌(Corynesporacassiicola) 3-2由西南大學(xué)植物保護學(xué)院植物免疫與病害生態(tài)防控研究室保存．

1.1.2 試劑與引物

十六烷基三甲基溴化銨(2×CTAB),V(酚)∶V(氯仿)∶V(異戊醇)=25∶24∶1;異丙醇、實時熒光定量SYBRPrime qPCR購自重慶葆光生物技術(shù)有限公司;Zero Background pTOPO-Blunt Simple Cloning Kit和DN45-FastBeat土壤基因組DNA提取試劑盒(珠磨法)購自北京艾德萊生物科技有限公司;2×Taq Master Mix(Cat.No.∶E005-01)購自蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司;DNA回收試劑盒Universal DNA Purification Kit和質(zhì)粒DNA提取試劑盒購自北京擎科生物科技有限公司;引物合成和測序均由北京擎科生物科技有限公司完成．

1.1.3 儀器

Q5000超微量核酸蛋白測定儀(美國QUAWELL公司);RePure-A基因擴增儀(杭州柏恒科技有限公司);CFX ConnectTM熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(百樂科技有限公司);DYY-12型電泳儀(北京六一儀器廠);凝膠電泳成像儀(基因有限公司)．

1.2 方法

1.2.1 樣品DNA提取

供試菌株及煙草葉片總DNA的提?。翰捎肅TAB法提取供試菌株及煙草葉片總DNA,根據(jù)韋學(xué)鋒等[35]的方法稍做改動．①取0.1 g葉片樣品在液氮中快速研磨成粉狀,加入1 mL 65 ℃預(yù)熱好的CTAB置于65 ℃水浴裂解45～60 min,每10 min混勻一次,于4 ℃條件下12 000 r/min離心15 min;②吸取上清液700～800 μL,在上清液中加入等體積的酚∶氯仿∶異丙醇(25∶24∶1)混合液充分顛倒混勻后于4 ℃條件下12 000 r/min離心10～15 min,重復(fù)操作兩次．③取上清液500～600 μL,加入等體積的-20 ℃預(yù)冷的異丙醇,于-20 ℃放置2 h左右;④于4 ℃條件下12 000 r/min離心15 min,棄上清,將剩余液體吸干,管底的沉淀物用75%的乙醇充分洗滌兩次后棄上清,放置3～5 min待乙醇揮發(fā)后,加入60 μL ddH2O溶解沉淀．提取的DNA用Q5000超微量核酸蛋白測定儀檢測DNA濃度,并置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?/p>

土壤樣品DNA的提取：采用DN45-FastBeat土壤基因組DNA提取試劑盒(珠磨法)提取土壤樣品DNA,提取過程嚴格按照試劑盒說明書(http：//aidlab.cn/up_product/big/2018-2-13-98845451.pdf)操作．

1.2.2 特異性引物設(shè)計

利用DNAMAN Version 9軟件對供試菌株R.solaniAG-3的DNA測序結(jié)果與NCBI GenBank中的煙草赤星病菌(A.alternata)和煙草棒孢霉葉斑病菌(C.cassiicola)的rDNA-ITS基因序列進行比對,根據(jù)3種病原菌不同的ITS序列差異,利用Primer3web version 4.1.0(https：//bioinfo.ut.ee/primer3/)設(shè)計引物共3對,其中獲得一對具有特異性的引物RSW1-F(5′-TGTGAACTTGTGAGACAGTTGGGG-3′)和RSW2-R(5′-CAAGGAATACCAAGGAGCGCAAG-3′)．

1.2.3 普通PCR引物特異性檢測及靈敏度檢測

將提取的供試菌株R.solaniAG-3的DNA經(jīng)超微量核酸蛋白測定儀檢測濃度,并按10倍梯度用ddH2O依次稀釋為100,10,1,10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6ng/μL,使用特異引物RSW1F/RSW2R進行常規(guī)PCR擴增,50 μL常規(guī)PCR體系按推薦的反應(yīng)體系進行(https：//www.novoprotein.com.cn/group1/M00/00/04/rBKQbGLszNiAI1DyAARWBqaNWR4981.pdf),以雙蒸水作為陰性對照,測定特異引物靈敏度．

1.2.4 PCR擴增產(chǎn)物的克隆和序列測定

以1.2.1中提的煙草靶斑病菌基因組DNA為模板,用設(shè)計的煙草靶斑病菌特異性引物RSW1F/RSW2R進行常規(guī)PCR擴增,得到276 bp左右的PCR產(chǎn)物．將PCR產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳后膠回收,將回收片段連接到pTOPO-Blunt Simple載體上,并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中,挑取陽性菌落37 ℃過夜培養(yǎng),菌檢后將含有目的DNA片段的菌液送至北京擎科生物科技有限公司進行測序．

1.2.5 標準曲線的建立

提取含有目的DNA片段的大腸桿菌標準質(zhì)粒,以10倍梯度稀釋后的標準質(zhì)粒作為擴增模板,采用SYBR qPCR Master Mix推薦的反應(yīng)體系(http：//cloud.bgbiotech.com/#s/78DlXioQ)進行RT-qPCR擴增．以拷貝數(shù)的對數(shù)(lgCt)為橫坐標,循環(huán)閾值(Ct)為縱坐標制作標準曲線．根據(jù)標準曲線所得數(shù)據(jù)分析拷貝數(shù)與Ct值之間的關(guān)系,并建立數(shù)學(xué)模型,檢驗相關(guān)性．

1.2.6 重慶龔灘煙區(qū)土壤及發(fā)病煙株葉片中靶斑病菌RT-qPCR檢測

重慶龔灘地區(qū)土壤采樣：對重慶龔灘煙區(qū)土壤樣品進行取樣,每個地區(qū)設(shè)置3個取樣點．3個取樣點分散在不同的地塊上并各取3個處理,每個處理取煙草根基周邊土壤．

發(fā)病煙株葉片采樣：龔灘煙區(qū)每個地區(qū)設(shè)置3個取樣點．3個取樣點分散在不同的地塊上并各取3個處理,采集田間發(fā)病煙株中下部葉．

RT-qPCR檢測：按照1.2.1的方法提取煙草葉片樣品總DNA并進行熒光定量PCR檢測,反應(yīng)體系與1.2.5相同．

1.2.7 利用RT-qPCR體系檢測煙草靶斑病最低發(fā)病菌量

圖1 煙草靶斑病菌菌餅接種示意圖

靶斑病菌接種：采用菌餅接種法(圖1)．試驗采用K326煙草葉片進行接種,用針均勻刺傷煙草葉片,造成傷口,然后將活化15 d左右的直徑為1 cm2的靶斑菌菌餅接種在煙草葉片上,以同等大小的水瓊脂培養(yǎng)基接種健康煙草葉片為對照,設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù),接種后密封放置于室溫26 ℃觀察．從0 h開始每間隔24 h取一次樣,取兩個接種菌餅之間的葉片樣品0.1 g,同時觀察接種處發(fā)病情況并拍照記錄．RT-qPCR檢測方法同1.2.6．

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 26統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,采用Duncan’s新復(fù)極差法進行差異顯著性檢驗．使用Microsoft excel 2016軟件進行標準曲線繪制．

2 結(jié)果與分析

2.1 普通PCR引物特異性和靈敏度的檢測

通過普通PCR技術(shù)檢測引物的特異性．PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示,引物RSW1F/RSW2R可以檢測出煙草靶斑病菌,并且煙草棒孢霉葉斑病菌、煙草赤星病菌沒有擴增出條帶,說明該引物特異性較好．測序結(jié)果表明該引物可以擴增出大小為276 bp的特異性條帶(圖2)．擴增序列：TGTGAACTTGTGAGACAGTTGGGGAATTTATTTGTTATTTTTTGTAATAAAATAATAATAAGTCATTGAACCCTTCTGTCTACTCAACTTATATAAACTCAATTTATTTTAAATGAATGTAATGGATGTAACACATCTCATACTAAGTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCTTG．進一步對不同濃度的煙草靶斑病菌R.solaniAG-3的DNA進行普通PCR擴增,電泳結(jié)果顯示,該引物最低能夠檢測到濃度為1×10-1ng/μL的靶斑病病原菌DNA(圖3)．

M：DL 2000 DNA marker;1～3：靶斑病菌DNA;赤星病菌DNA;棒孢霉葉斑病菌DNA;N：陰性對照(ddH2O)．圖2 煙草靶斑病菌引物特異性檢測結(jié)果

M：DL 2000 DNA marker;1～8：標準質(zhì)粒濃度分別為1×102 ng/μL-1,1×10 ng/μL,1×1 ng/μL,1×10-1 ng/μL,1×10-2 ng/μL,1×10-3 ng/μL,1×10-4 ng/μL和1×10-5 ng/μL;N：陰性對照(ddH2O)．圖3 靶斑病特異性引物RSW1F/RSW2R靈敏度檢測結(jié)果

2.2 RT-qPCR標準曲線的建立

將1.2.5中所得標準質(zhì)粒按10倍梯度稀釋為6個濃度,每個梯度設(shè)置8個重復(fù)進行實時熒光定量PCR擴增,計算每個梯度的Ct均值,繪制標準曲線．結(jié)果顯示,實時熒光定量PCR能夠檢測到濃度最低為1×10-3ng/μL的標準質(zhì)粒,為常規(guī)PCR靈敏度的100倍(圖4a)．此外,溶解曲線圖可以看出熔解曲線呈單一熔解峰,并且熔點溫度趨于一致,約為82.1 ℃,表明擴增產(chǎn)物比較單一,引物的特異性較好并且無明顯的引物二聚體生成(圖4b)．由擴增曲線可以看出計算得到標準曲線y=-3.557 4x+27.74,相關(guān)系數(shù)R2為0.995 4(圖4c),由擴增效率計算公式(E=10-1/k-1)計算出擴增效率E約為91.03%,趨近于1,表明所得標準曲線符合要求．

圖4 引物RSW1F/RSW2R的實時熒光定量PCR檢測結(jié)果

圖5 K326葉片接種煙草靶斑病菌菌餅不同時間靶斑病菌含量檢測

2.3 RT-qPCR體系檢測煙草靶斑病最低發(fā)病菌量的檢測

通過實時熒光定量PCR檢測接種煙草靶斑病菌菌餅24 h,48 h,72 h,96 h和120 h后兩個接種菌餅之間葉片樣品的靶斑病菌含量,實時熒光定量結(jié)果顯示接種后5個不同時間點的Ct值分別為20.76,20.65,20.34,17.61,15.33,對照健康葉片無Ct值,將各處理Ct值代入標準曲線計算靶斑病菌的相對含量,得出其煙草靶斑病菌含量分別為9.16 pg/μL,9.84 pg/μL,12.03 pg/μL,70.40 pg/μL和307.97 pg/μL．由圖5可以看出,24～72 h含菌量變化較小,沒有顯著性差異,接種處無明顯病斑出現(xiàn)．而第96 h與第24～72 h相比,靶斑病菌含量顯著上升,并且伴隨著較大病斑的出現(xiàn)．說明在72 h時,即Ct值為20.34,靶斑病菌含量為12.03 pg/μL時,達到煙草靶斑病的最低發(fā)病菌量．

2.4 重慶龔灘煙區(qū)土壤和發(fā)病煙株葉片中靶斑病菌含量檢測分析

使用設(shè)計的特異性引物對重慶龔灘煙區(qū)土壤樣品DNA以及5～7月發(fā)病煙株的葉片樣品DNA進行RT-qPCR檢測其靶斑病菌含量．實時熒光定量結(jié)果顯示,5月15日、5月30日、6月15日龔灘煙區(qū)土壤RT-qPCR的擴增Ct值分別為25.14,24.12和23.91,代入2.2所得標準曲線計算出其煙草靶斑病菌含量分別為0.54 pg/μL,1.04 pg/μL和1.19 pg/μL(圖6)．本研究發(fā)現(xiàn)重慶龔灘煙區(qū)土壤中的靶斑病菌含量隨時間推移升高,一定程度上可以推測該地區(qū)的靶斑病菌可能通過土壤傳播到煙株上,但具體證據(jù)需進一步的試驗驗證,但可說明需加強對該地區(qū)土壤的消毒殺菌,以降低土壤中煙草靶斑病菌含量．5月15日雜草以及6月15日、6月30日、7月30日龔灘煙區(qū)發(fā)病煙株葉片RT-qPCR的擴增Ct值分別為23.95,19.11,17.40和22.29,其煙草靶斑病菌含量分別為1.16 pg/μL,26.66 pg/μL,80.65 pg/μL和3.40 pg/μL(圖6b)．根據(jù)2.2中的標準曲線,計算得出各時期龔灘煙區(qū)土壤樣品、發(fā)病葉片樣品中靶斑病菌含量,發(fā)現(xiàn)雜草中煙草靶斑病菌的含量較高,說明應(yīng)當及時清除煙田周邊雜草,以阻斷煙草靶斑病菌從煙田周邊雜草傳入煙葉的可能．同時,結(jié)合2.3中已知的煙草靶斑病最低發(fā)病菌量的Ct值(20.34),龔灘煙區(qū)煙葉6月15日的煙草靶斑病菌含量接近臨界發(fā)病菌Ct值,說明應(yīng)該在此之前對煙草靶斑病進行預(yù)防,以避免其進一步侵染為害其他煙株導(dǎo)致病害流行．此外,由圖6可以看出,5～6月,龔灘煙區(qū)土壤和病葉中靶斑病菌含量顯著上升．但到7月底發(fā)病葉片中含菌量顯著下降,可能是由2022年重慶7月持續(xù)高溫(>40 ℃)引起,表明高溫對靶斑病菌生長有一定影響．

小寫字母不同表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)．圖6 重慶龔灘煙區(qū)土壤樣品和發(fā)病煙株葉片樣品中靶斑病菌含量檢測結(jié)果

3 討論

煙草靶斑病自在我國首次發(fā)現(xiàn)以來,其擴散速度十分迅速,同時具有再侵染頻繁、危害性大等特點[15],一旦發(fā)病便帶來巨大的經(jīng)濟損失．對于煙草靶斑病的有效防治仍然主要采取化學(xué)防治的手段,然而,煙草靶斑病在田間的發(fā)病癥狀與煙草赤星病、煙草棒孢霉葉斑病等常見煙草葉部病害的發(fā)病癥狀極為相似,尤其是與煙草赤星病常常難以區(qū)分[36],而該3種煙草病害常用的有效藥劑以及最佳防治時期不同,無法準確區(qū)分該3種病害往往會導(dǎo)致在化學(xué)藥劑的針對性選擇上以及準確把握藥劑使用時期等方面造成困難．同時,在西南地區(qū)常發(fā)的煙草葉部病害主要有煙草赤星病、煙草棒孢霉葉斑病以及煙草靶斑病,尤其是近幾年煙草靶斑病在西南多個地區(qū)暴發(fā)[37-39]．因此,開發(fā)一種針對煙草靶斑病的特異性定量引物用于區(qū)分此3種癥狀相似的病害以及田間煙草靶斑病的快速準確檢測十分重要,一旦發(fā)病便可以對癥下藥,選取有效的藥劑以及在有效的防治時期進行防治．而對于煙草其他真菌病害,如煙草黑脛病、煙草灰霉病等,在癥狀上可以與煙草靶斑病有明顯的區(qū)分,對于藥劑選擇以及防治時期上沒有造成困難．因此,本研究針對煙草靶斑病以及與其癥狀相似的兩種常見的煙草葉部病害設(shè)計了一對特異性引物RSW1F/RSW2R,結(jié)果表明該引物能夠特異性檢測煙草靶斑病菌R.solaniAG-3,能夠有效區(qū)分其與另外兩種癥狀相似的煙草真菌病害,從而可以對發(fā)病初期的煙草病害有針對性的進行化學(xué)防治．然而,R.solani目前國內(nèi)外已經(jīng)報道的有14個融合群(AG1-13和AGBI)[19]．根據(jù)地理位置不同,煙草靶斑病的致病病原菌R.solani存在不同的菌絲融合群．目前在我國已鑒定出的煙草靶斑病病原菌主要為R.solaniAG-3融合群,主要分布于湖南[17]、湖北[38]以及貴州[39]等地區(qū),但也有少數(shù)地區(qū)如廣西、貴州等地區(qū)檢測出R.solaniAG-2、R.solaniAG-4[40]以及R.solaniAG-6[41]等融合群．因此,對于重慶龔灘地區(qū)的煙草靶斑病病原菌是否存在除R.solaniAG-3以外的融合群還需要進一步探究．

同時,煙草靶斑病菌R.solani是一種土傳真菌病害[42-43],其侵染范圍廣泛[44-46],可以侵染煙草、番茄、玉米和黃瓜等．本研究在重慶龔灘地區(qū)5～6月土壤樣品及雜草中檢測出靶斑病菌,說明在該地區(qū)靶斑病初侵染來源主要存在于土壤和雜草中．Budge等[47]的研究表明表面淺層土壤更容易比深層土壤中檢測出R.solani,因此,可以通過深翻耕等農(nóng)藝措施來預(yù)防其侵染煙株地上部分．此外,在重慶龔灘地區(qū)5月中旬-6月中旬土壤中靶斑病菌含量逐漸增高．趙艷琴等[48]測定了遼寧丹東地區(qū)一年中土壤中靶斑病菌的動態(tài)變化數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)在一年中該地區(qū)土壤靶斑病菌含量于6月28日達到最高值,本研究結(jié)果與其基本一致,表明5～6月為靶斑病菌在田間適宜生長的時期．另外,田間5～6月葉片靶斑病菌含量變化趨勢與土壤中變化趨勢基本一致．同時,葉片中6月中旬的Ct值較為接近最低發(fā)病菌量的Ct值,提示我們可以在此之前采集田間樣品檢測煙草靶斑病菌含量,在其達到最低發(fā)病菌量之前采取措施防止靶斑病的進一步流行．因此,在該地區(qū)靶斑病的最佳防治時期為5月15日至6月15日．另一方面,7月煙草葉片中靶斑病菌含量顯著降低,說明降雨、溫度、濕度等環(huán)境因素對該菌的生長有較大的影響．

綜上所述,對于煙草靶斑病的防控可以根據(jù)建立的實時熒光定量PCR檢測體系檢測田間煙草靶斑病菌含量,并在達到最低發(fā)病菌量之前及時利用藥劑進行有效控制防治．此外,聶曉等[49]根據(jù)新疆澤普縣2012-2019年內(nèi)的小麥白粉病發(fā)病情況進行調(diào)查統(tǒng)計和數(shù)據(jù)分析后,將往年病害發(fā)生情況與病害發(fā)生流行的關(guān)鍵氣象因子相結(jié)合,利用多元回歸分析法建立了小麥白粉病的病害預(yù)測模型．因此,對于煙草靶斑病的預(yù)防,還可以在將田間氣候預(yù)測與GIS技術(shù)等相結(jié)合從而建立預(yù)測模型等方面繼續(xù)深入探索,做到精準把控田間施藥,以預(yù)防煙草靶斑病的發(fā)生與流行．

4 結(jié)論

本研究設(shè)計了一對能夠特異性檢測煙草靶斑病菌的引物RSW1F/RSW2R,該引物能夠有效區(qū)分煙草靶斑病菌、煙草赤星病菌、煙草棒孢霉葉斑病菌等重慶煙區(qū)常見煙草病害,同時建立了煙草靶斑病菌的實時熒光定量體系,計算出煙草靶斑病的最低發(fā)病菌量為12.03 pg/μL,并且將已建立檢測體系運用到重慶龔灘煙區(qū)靶斑病的檢測,發(fā)現(xiàn)該煙區(qū)的土壤和雜草可能為煙草靶斑病菌的來源,同時確定了5月15日至6月15日為該地區(qū)預(yù)防煙草靶斑病的最佳時期,為煙草靶斑病的預(yù)報預(yù)警及科學(xué)用藥提供依據(jù)．