劉磊琦, 陳鏡澤, 傅武勝,3,4*, 唐翠英

(1.福建醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,福建 福州 350122; 2.福建省人獸共患病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建省疾病預(yù)防控制中心,福建 福州 350012; 3.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,福建 福州 350122; 4.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,福建 福州 350002)

世界上有14 000多種大型野生真菌[1],其中5 000余種為有毒蘑菇;我國(guó)野生真菌有3 800多種,其中480多種為有毒蘑菇[2]。蘑菇富含多糖且脂肪含量低,是世界衛(wèi)生組織(WHO)和聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)推薦的“超級(jí)食品”[3],但可食用蘑菇和有毒蘑菇外形上極易混淆,我國(guó)野生蘑菇中毒事件頻發(fā),多年來(lái)毒蘑菇一直是引起我國(guó)食源性中毒死亡的主要致病因子[4]。根據(jù)結(jié)構(gòu)和中毒機(jī)理,蘑菇毒素可分為鵝膏肽類、毒蠅堿、色胺類、異惡唑衍生物、鹿花菌素、鬼傘素及奧來(lái)毒素7類[5],已確定的毒性較強(qiáng)及比較常見(jiàn)的蘑菇毒素主要有鵝膏肽類及色胺類等。其中鵝膏肽類包括鵝膏毒肽(amatoxins)和鬼筆毒肽(phallotoxins)等,色胺類包含脫磷裸蓋菇素(psilocin)和蟾蜍色胺(bufotenine)等,都是常見(jiàn)的神經(jīng)精神型蘑菇毒素[6-8],脫磷裸蓋菇素于1958年從墨西哥裸蓋菇(Psilocybemexicana)[9]中分離得到,分布在花斑褶傘菇(PanaeolusretirugisFr.Gill.)等150多種蘑菇中,是國(guó)家管制的精神類藥品[10]和致幻劑[11,12],易被用作毒品,食用后會(huì)出現(xiàn)視幻覺(jué)、狂笑、過(guò)度興奮等[13]。蟾蜍色胺是蛤蟆菌(Amanitamuscaria)中的主要致幻成分,能引起色彩幻覺(jué),在美國(guó)、英國(guó)和澳大利亞被歸為違禁物質(zhì)[14],在人體內(nèi)不易被分解,即使排泄后仍有致幻作用。

關(guān)于鵝膏毒肽和鬼筆毒肽的研究已有不少報(bào)道,檢測(cè)方法也較為成熟[15-22],國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管總局發(fā)布了食品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法BJS 202008[23],該法采用親水親脂固相萃取柱(HLB)結(jié)合LC-MS/MS測(cè)定蘑菇中6種鵝膏肽類毒素,具體為α-鵝膏毒肽(α-AMA)、β-鵝膏毒肽(β-AMA)、γ-鵝膏毒肽(γ-AMA)、羧基二羥鬼筆毒肽(PCD)、羧基三羥鬼筆毒肽(PSC)、二羥鬼筆毒肽(PHD),6種鵝膏肽類的檢出限(LOD)、定量限(LOQ)分別為10、30 μg/kg。關(guān)于色胺類毒素檢測(cè)的研究報(bào)道較少,Martin等[14]采用混合型陽(yáng)離子交換柱(MCX)結(jié)合LC-MS/MS建立了生物樣品(血清、血漿和尿液)中脫磷裸蓋菇素、蟾蜍色胺的測(cè)定方法,LOD為0.1～0.2 μg/L; Bambauer等[12]建立了聚合型強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱(Strata X-Drug B)結(jié)合液相色譜-高分辨質(zhì)譜法(LC-HRMS)檢測(cè)尿液中鵝膏肽類(α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽)、色胺類毒素(脫磷裸蓋菇素、蟾蜍色胺)和神經(jīng)精神型蘑菇毒素(鵝膏蕈氨酸、毒蠅母、毒蠅堿)的方法,鵝膏毒肽、色胺類的LOD分別為1、5 μg/L。徐小民等[24]建立了蘑菇中5種鵝膏肽類和4種神經(jīng)精神型蘑菇毒素(鵝膏蕈氨酸、毒蠅母、毒蠅堿和裸蓋菇素)的測(cè)定方法,樣品經(jīng)提取、稀釋后用LC-MS/MS測(cè)定,LOD較高,為6～15 mg/kg,該方法適合野生菌中蘑菇毒素的檢測(cè)。

色胺類蘑菇毒素在酸性條件下容易形成陽(yáng)離子化合物,鵝膏肽類毒素易被反相保留,故主要選取具有陽(yáng)離子交換和非極性雙重作用的固相萃取柱作為凈化填料,本研究通過(guò)強(qiáng)陽(yáng)離子固相萃取凈化技術(shù)結(jié)合HPLC-MS/MS,建立了同時(shí)測(cè)定蘑菇中5種鵝膏肽類和2種色胺類毒素的檢測(cè)技術(shù),獲得了更低的檢出限,這將為蘑菇中毒事件的快速診斷和及時(shí)治療提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

LCMS-8060 NX液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(日本島津公司);冷凍高速離心機(jī)(3H24R1,長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司);漩渦混合器(美國(guó)Scientific Industries公司); KQ-500DE型和KQ3200DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器公司); EFAA-DC24氮吹儀(上海安譜公司); RE801旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本Yamato公司)。SCX SPE柱(強(qiáng)陽(yáng)離子交換型,60 mg/3 mL,美國(guó)Agilent公司)。

乙酸銨和甲酸(FA)(色譜純,CNW公司)、甲酸(優(yōu)級(jí)純,德國(guó)DUKSAN公司)、氨水(優(yōu)級(jí)純,國(guó)藥集團(tuán),純度25%～28%)、乙腈(色譜純,美國(guó)ThermoFisher公司)、甲醇(色譜純,德國(guó)Merck公司)、抗壞血酸(CP,天津光復(fù)精細(xì)化工研究所,純度≥99.7%)。α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、羧基二羥鬼筆毒肽和二羥鬼筆毒肽,均來(lái)自美國(guó)ENZO公司,純度均≥90%;蟾蜍色胺(天津阿爾塔公司)和脫磷裸蓋菇素(加拿大TRC公司),純度均≥95%。同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液脫磷裸蓋菇素-D10(100.0 mg/L)、蟾蜍色胺-D4(100.2 mg/L)均購(gòu)自加拿大TRC公司;香菇干粉由購(gòu)自當(dāng)?shù)爻械孽r香菇樣品烘干后粉碎而得。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

毒素混合標(biāo)準(zhǔn)使用液:稱取7種蘑菇毒素標(biāo)準(zhǔn)品粉末,分別用甲醇溶解后定容于10 mL容量瓶中,得到質(zhì)量濃度均為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液;準(zhǔn)確移取1.00 mL 7種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用甲醇定容,配制成10.0 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液;再準(zhǔn)確移取1.00 mL混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液,用甲醇稀釋、定容,配制成1.00 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。

內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)使用液:取適量2種內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,用甲醇配制成1.00 mg/L。

1.3 樣品前處理

稱取0.2 g(精確至1 mg)蘑菇干粉于15 mL離心管中,準(zhǔn)確加入10 μL 1.00 mg/L內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)使用液,再加入5 mL 0.3%甲酸(優(yōu)級(jí)純)甲醇溶液,渦旋混勻,在30 ℃下超聲提取15 min,以9 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min,再重復(fù)提取一次,合并提取液,添加10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)抗壞血酸溶液50 μL后,提取液于40 ℃下減壓蒸餾至近干,用2 mL 0.3%甲酸水溶液(含0.05%抗壞血酸)洗滌雞心瓶?jī)?nèi)壁。將溶液轉(zhuǎn)入用3 mL乙腈、0.3%甲酸水溶液活化平衡好的SCX柱中,分別用1 mL 0.3%甲酸水溶液、1 mL 0.1%甲酸水溶液淋洗,然后用2 mL氨水-甲醇(5∶95,v/v)洗脫,于40 ℃下氮吹至近干;準(zhǔn)確加入1.00 mL 0.05%抗壞血酸溶液復(fù)溶,混勻后,以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min,取上清液測(cè)定。

1.4 儀器條件

液相色譜條件 HSS T3柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm,美國(guó)Waters公司);柱溫:40 ℃;流動(dòng)相A:5 mmoL/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸(色譜純));流動(dòng)相B:乙腈;梯度洗脫程序:0～3.0 min,5%B; 3.0～5.0 min,5%B～40%B; 5.0～6.0 min,40%B～95%B; 6.0～7.0 min,95%B; 7.0～7.5 min,95%B～5%B; 7.5～10.0 min,5%B。流速:0.3 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL。

質(zhì)譜條件 電噴霧離子源正離子模式監(jiān)測(cè)(ESI+);霧化氣、干燥氣和加熱氣分別為氮?dú)?、氮?dú)夂涂諝?流量分別為3.0、10和15 L/min;碰撞氣:氬氣;脫溶劑管、接口和加熱塊溫度分別為250、400和400 ℃; 7種蘑菇毒素及其內(nèi)標(biāo)的監(jiān)測(cè)離子對(duì)及質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 7種蘑菇毒素、同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)及保留時(shí)間

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,采用Excel整理數(shù)據(jù),SPSS 25.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。各指標(biāo)數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn),兩組間比較采用雙側(cè)檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α設(shè)定為0.05,當(dāng)p<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)數(shù)據(jù)滿足方差齊性,進(jìn)行t檢驗(yàn);數(shù)據(jù)不滿足方差齊性時(shí),進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

5種鵝膏肽類毒素均含有羥基、氨基和羰基等易于電離并產(chǎn)生正離子的官能團(tuán),因此可用ESI+或ESI-的一種模式測(cè)定。優(yōu)化過(guò)程中,7種毒素在ESI+模式下的信號(hào)均高于ESI-,[M+H]+的信號(hào)響應(yīng)均高于[M+Na]+。采用MRM模式采集,通過(guò)Q3全掃描確認(rèn)各個(gè)毒素的準(zhǔn)分子離子[M+H]+,各毒素化學(xué)結(jié)構(gòu)與二級(jí)質(zhì)譜碎裂途徑見(jiàn)圖1。

圖1 7種蘑菇毒素的結(jié)構(gòu)及質(zhì)譜碎裂解析

對(duì)各個(gè)毒素二級(jí)碎裂離子進(jìn)行掃描優(yōu)化得到最佳碰撞能量及偏差電壓,每個(gè)毒素得到的離子對(duì)信息均能通過(guò)碎裂解析找到對(duì)應(yīng)的碎裂部位。比較在優(yōu)化后的儀器條件下不同基質(zhì)中毒素的響應(yīng),基質(zhì)干擾等問(wèn)題,確定了用于定量和定性的產(chǎn)物離子,見(jiàn)表1。

2.2 色譜條件優(yōu)化

在流動(dòng)相優(yōu)化過(guò)程中,對(duì)比了0.1%甲酸水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液-乙腈,發(fā)現(xiàn)乙腈作為有機(jī)相時(shí)毒素信號(hào)響應(yīng)及峰形普遍比用甲醇好。BJS 202008[23]采用甲酸銨溶液,其他文獻(xiàn)多采用乙酸銨溶液[25]或甲酸水溶液[24]作為水相對(duì)5種鵝膏肽類毒素進(jìn)行檢測(cè)。本研究以乙腈為有機(jī)相,比較了水相為水、0.1%甲酸水溶液、5 mmoL/L甲酸銨溶液、5 mmoL/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)時(shí)的效果,發(fā)現(xiàn)以5 mmoL/L乙酸銨(含0.1%甲酸)為流動(dòng)相水相時(shí),所有毒素的信號(hào)響應(yīng)和峰形的綜合效果最好,故選擇5 mmoL/L乙酸銨(含0.1%甲酸)-乙腈為最終流動(dòng)相。

蟾蜍色胺、脫磷裸蓋菇素互為同分異構(gòu)體,需要在色譜上分離開(kāi),為此比較了在相同條件下Shim-pack Scepter C18(100 mm×2.1 mm,1.9 μm,日本島津公司)、HSS T3、Shim-pack Velox HILIC(100 mm×2.1 mm,2.7 μm,日本島津公司)3種色譜柱的分離效果(見(jiàn)圖2)。結(jié)果表明,HILIC柱的分離效果較差,且峰形不理想,T3柱和C18柱較為理想,分離效果相當(dāng),T3柱對(duì)色胺類(脫磷裸蓋菇素和蟾蜍色胺)的保留效果略好,綜上,選擇T3柱。

圖2 3種色譜柱分離7種蘑菇毒素的MRM色譜圖的比較

2.3 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.3.1提取溶劑、pH及溫度的選擇

脫磷裸蓋菇素不穩(wěn)定,在光和空氣中會(huì)快速地分解,本研究在樣品前處理過(guò)程中,通過(guò)加入抗壞血酸來(lái)提高脫磷裸蓋菇素的穩(wěn)定性[14]。鵝膏肽類毒素均為多肽類化合物,BJS 202008[23]采用甲醇提取,其他文獻(xiàn)則多采用乙腈[26]、水[18]提取;脫磷裸蓋菇素和蟾蜍色胺均屬于小分子極性化合物,易溶于水。為實(shí)現(xiàn)蘑菇中7種蘑菇毒素的提取,對(duì)比了水、甲醇、乙腈、30%甲醇水溶液、30%乙腈水溶液的提取效果,結(jié)果見(jiàn)圖3a。甲醇對(duì)PHD的提取效果略低于30%甲醇水和30%乙腈水溶液,對(duì)其他鵝膏肽類毒素的提取效果均最佳,提取率略大于30%乙腈水溶液,鵝膏肽類毒素屬于相對(duì)分子質(zhì)量較大的極性化合物,相對(duì)于甲醇和水,極性更小的乙腈提取率明顯更低;對(duì)脫磷裸蓋菇素及蟾蜍色胺,乙腈和30%乙腈水溶液的提取效果最佳。綜上,選擇甲醇作為最佳的提取溶劑。

不同的鵝膏肽類毒素具有不同的水溶性,因此推測(cè)溶液pH對(duì)其提取效果有一定影響[17]。本研究對(duì)比了在不同pH (2、4、7、10、12)下甲醇溶液對(duì)目標(biāo)物的提取效果,以甲酸溶液及氨水調(diào)節(jié)提取液的pH值(0.3%甲酸甲醇對(duì)應(yīng)pH 2,0.1%甲酸甲醇對(duì)應(yīng)pH 4,0.01%甲酸甲醇對(duì)應(yīng)pH 7,氨水-甲醇(1∶200,v/v)對(duì)應(yīng)pH 10,氨水-甲醇(3∶200,v/v)對(duì)應(yīng)pH 12),結(jié)果見(jiàn)圖3b。隨著pH上升,所有毒素的提取效果均有不同程度的下降,pH為2,即0.3%甲酸甲醇作為提取溶液時(shí)所有毒素提取效果最佳。溶劑pH對(duì)脫磷裸蓋菇素提取的影響較大,對(duì)γ-鵝膏毒肽提取的影響較小。

鵝膏肽類毒素性質(zhì)穩(wěn)定,耐高溫、耐干燥和耐酸堿,普通烹調(diào)加工無(wú)法降低其毒性[16]?？疾炝嗽?0～60 ℃水浴下提取7種毒素時(shí)其提取效果的差異(見(jiàn)圖3c),脫磷裸蓋菇素在30～60 ℃范圍內(nèi),隨著溫度升高,其峰面積呈下降趨勢(shì)(p<0.05),這說(shuō)明脫磷裸蓋菇素不耐熱,其余6種毒素在不同溫度下提取時(shí)的峰面積基本一致,無(wú)顯著性差異(p>0.05);綜合考慮,確定提取溫度為30 ℃。另外試驗(yàn)了30 ℃下提取不同時(shí)間(5～30 min)對(duì)蘑菇毒素含量的影響(見(jiàn)圖3d),大多數(shù)毒素在15 min后峰面積基本不變,表明提取達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。

2.3.2固相萃取填料的比較

蘑菇中含有較多的多糖、氨基酸、多肽及有機(jī)酸等,基質(zhì)復(fù)雜,BJS 202008[23]以及其他文獻(xiàn)[16,25]多采用親水親脂平衡機(jī)制的HLB柱作為鵝膏肽類毒素測(cè)定的凈化柱,對(duì)于脫磷裸蓋菇素和蟾蜍色胺的測(cè)定,多采用離子交換型凈化柱[14]。因此本研究考察了4種不同類型固相萃取柱的效果,前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在提取液上樣后,脫磷裸蓋菇素未與HLB填料作用,隨溶液直接流出;考慮脫磷裸蓋菇素和蟾蜍色胺在酸性條件下可形成陽(yáng)離子,故比較了具有陽(yáng)離子交換和反相保留雙重作用的3種填料WCX(弱陽(yáng)離子交換型)、MCX、SCX,并用加標(biāo)水平為50 μg/kg的香菇干粉為基質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)SCX對(duì)7種毒素凈化的綜合效果最佳,結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 采用3種SPE填料凈化時(shí)7種蘑菇毒素的回收率(n=3)

2.3.3淋洗和洗脫條件的優(yōu)化

對(duì)SCX凈化柱的淋洗液進(jìn)一步優(yōu)化,比較方案1(依次用0.3%FA、0.1%FA各1 mL淋洗)和方案2(依次用0.3%FA、5%甲醇(含0.1%FA)各1 mL淋洗)的效果。方案1中7種毒素的回收率范圍為86%～126%,方案2的回收率為83%～130%,可見(jiàn)兩種淋洗條件下7種毒素的回收率無(wú)明顯差異。排除掉脫磷裸蓋菇素和蟾蜍色胺的內(nèi)標(biāo)校正作用后,脫磷裸蓋菇素受淋洗溶劑的影響大,采用方案2條件淋洗時(shí),其峰面積僅為方案1的39%(結(jié)果見(jiàn)圖5),故選擇方案1更適合。

圖5 兩種淋洗方式下脫磷裸蓋菇素和蟾蜍色胺的峰面積(n=3)

色胺類毒素用SPE凈化時(shí),文獻(xiàn)多采用氨水-甲醇洗脫[12,14],本文以氨水-甲醇(5∶95,v/v)洗脫,并對(duì)比洗脫體積(1～4 mL)的效果,結(jié)果見(jiàn)圖6。洗脫液為2 mL時(shí),5種鵝膏肽類毒素的回收率為71%～105%,色胺類毒素的回收率為78%～111%,效果最佳。洗脫液為4 mL時(shí),5種鵝膏肽類毒素的回收率降至56%～65%,這可能是由于隨著洗脫體積的增加,導(dǎo)致樣品中更多雜質(zhì)被洗脫出來(lái),基質(zhì)抑制效應(yīng)增加,用外標(biāo)法計(jì)算時(shí)其回收率較低;2種色胺類毒素的回收率為73%～113%,回收率無(wú)明顯差異,這可能因?yàn)閮?nèi)標(biāo)法校正后減弱了基質(zhì)干擾作用。

圖6 洗脫體積對(duì)7種蘑菇毒素回收率的影響(n=3)

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1線性范圍、檢出限及定量限

按 1.3 節(jié)處理得到空白基質(zhì)溶液,取 7 種蘑菇毒素混合標(biāo)準(zhǔn)使用液適量和10 μL 1.00 mg/L 內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)使用液用空白基質(zhì)溶液稀釋,配制成基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。鵝膏毒肽、鬼筆毒肽的定量采用基質(zhì)匹配外標(biāo)法,以毒素的質(zhì)量濃度(x,μg/L)和峰面積(y)擬合線性回歸方程;脫磷裸蓋菇素和蟾蜍色胺的定量采用同位素內(nèi)標(biāo)法,以毒素的質(zhì)量濃度(x,μg/L)與峰面積比值(Y)擬合線性回歸方程,結(jié)果見(jiàn)表2。鵝膏毒肽、鬼筆毒肽(0.5～500 μg/L)、脫磷裸蓋菇素(0.1～60 μg/L)、蟾蜍色胺(0.1～60 μg/L)在線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)(r2)均≥0.997,滿足測(cè)定要求。取空白香菇干粉進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),以離子對(duì)的信噪比≥3和≥10時(shí)的含量分別作為L(zhǎng)OD和LOQ,7種毒素的結(jié)果見(jiàn)表2。蟾蜍色胺、脫磷裸蓋菇素、鵝膏肽類毒素的LOD分別為2.0、5.0、10 μg/kg,LOQ分別為5.0、10和20 μg/kg。BJS 202008[23]中稱樣量(干粉)為0.4 g時(shí),5種鵝膏肽類的LOD均為10 μg/kg,LOQ均為30 μg/kg。本研究的稱樣量為0.2 g,5種鵝膏肽類的檢出限與食品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法相當(dāng),定量限低于該方法,證明本研究方法的靈敏度較高,需要的樣品量更少。此外,新建立的方法還能額外檢測(cè)野生菌中的色胺類毒素(脫磷裸蓋菇素、蟾蜍色胺)。

表2 蘑菇干粉中7種毒素的線性關(guān)系、檢出限和定量限

2.4.2準(zhǔn)確度與精密度

以不含目標(biāo)毒素的香菇干粉進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn),加標(biāo)水平為5～100 μg/kg時(shí),7種毒素的平均回收率為71.8%～117%,RSD為1.73%～9.92%(n=6)(見(jiàn)表3)。根據(jù)GB/T 27417-2017[27],當(dāng)目標(biāo)物的含量≤0.1 mg/kg時(shí),回收率允許范圍為60%～120%,且重復(fù)測(cè)定的RSD≤15%,這說(shuō)明本方法的重復(fù)性和準(zhǔn)確度均理想,滿足實(shí)際樣品的分析要求。

表3 3個(gè)加標(biāo)水平下香菇干粉中7種蘑菇毒素的加標(biāo)回收率及其RSD(n=6)

2.5 野生蘑菇中7種蘑菇毒素分布的調(diào)查研究

2021年福建省首次開(kāi)展了野生蘑菇的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè),由全省9個(gè)設(shè)區(qū)市采集59份野生蘑菇,本實(shí)驗(yàn)室采用核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(rDNA-ITS)分子條形碼技術(shù)[28]進(jìn)行了種屬鑒定(經(jīng)中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所楊祝良教授團(tuán)隊(duì)核實(shí)),并采用本方法測(cè)定了野生蘑菇樣品中的7種蘑菇毒素。結(jié)果顯示,在2份樣品中檢出了蘑菇毒素,編號(hào)為L(zhǎng)Y21615的樣品采自龍巖市,經(jīng)鑒別為擬灰花紋鵝膏(A.fuligineoides),從中檢出α-AMA、β-AMA、PHD鵝膏肽類毒素,其含量分別為607、377、69.0 mg/kg;編號(hào)為PT21097的樣品采自莆田市,經(jīng)鑒別為口蘑科(Tricholomataceae)蘑菇,從中檢出脫磷裸蓋菇素,含量為12.6 mg/kg,未檢出其他6種蘑菇毒素。這兩個(gè)野外環(huán)境下的蘑菇樣品分別見(jiàn)圖7a和圖7c,其干粉提取物的MRM色譜圖(各稀釋10 000、1 000倍后測(cè)定)分別見(jiàn)圖7b和圖7d。采用BJS 202008[23]方法和本方法對(duì)擬灰花紋鵝膏干粉中鵝膏肽類毒素含量進(jìn)行對(duì)比(結(jié)果見(jiàn)圖8),二者測(cè)定的鵝膏肽毒素含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05),再次證明了本方法的可靠性。

圖7 陽(yáng)性野生蘑菇及其含有的蘑菇毒素的MRM色譜圖

圖8 本方法與BJS 202008法檢測(cè)擬灰花紋鵝膏干粉中鵝膏毒素含量的比較(n=3)

3 結(jié)論

采用強(qiáng)陽(yáng)離子交換SPE凈化柱減少了蘑菇基質(zhì)對(duì)毒素質(zhì)譜測(cè)定的干擾,通過(guò)優(yōu)化前處理?xiàng)l件,建立了蘑菇中5種鵝膏肽類和2種色胺類毒素的LC-MS/MS檢測(cè)技術(shù)。經(jīng)方法驗(yàn)證并與已有標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)比,結(jié)果表明所建立方法結(jié)果可靠,重復(fù)性好,靈敏度較高,可對(duì)蘑菇樣品中5種鵝膏肽類和2種色胺類蘑菇毒素進(jìn)行簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的分析。