韓耀輝，田浩浩，石林凡，任中陽(yáng)，翁武銀

（集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院，廈門市海洋功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建省海洋功能食品工程技術(shù)研究中心，福建廈門 361021）

膠原是由三條α肽鏈通過(guò)-COOH 和-NH2基團(tuán)之間的共價(jià)鍵、氫鍵和范德華力結(jié)合而成的天然蛋白，約占動(dòng)物體總蛋白的30%，具有親水性、生物相容性、低免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，是生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的理想材料[1-3]。海洋動(dòng)物源膠原蛋白具有高得率、低免疫原性和低炎癥性[4]。羅非魚（Oreochromis niloticus）是世界上第二大養(yǎng)殖魚類[5]。2021 年羅非魚全國(guó)年產(chǎn)量約達(dá)166 萬(wàn)噸[6]。在羅非魚片等產(chǎn)品生產(chǎn)加工過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生魚鱗、魚皮等大量富含膠原蛋白的副產(chǎn)物，它們卻沒(méi)有全部得到高值化利用[7-9]。因此，利用羅非魚魚皮、魚鱗提取膠原，不僅可以提高羅非魚的利用率和附加值，還可以減少環(huán)境污染。

酸的種類、濃度、液/固比、溫度和時(shí)間等因素對(duì)膠原提取率有很大影響[1,4,10]。Bhuimbar 等[7]研究了酸的種類對(duì)水母膠原提取率的影響，結(jié)果表明乳酸對(duì)膠原的提取率最高，其次是甲酸、酒石酸（tartaric acid，TA）、乙酸（acetic acid，AA）和檸檬酸（citric acid，CA）等。Skierka 等[11]研究了AA、TA、乳酸和鹽酸等酸種類對(duì)鱈魚皮膠原提取率的影響，結(jié)果顯示AA 和乳酸對(duì)魚皮膠原的提取率高于其他酸。這些結(jié)果表明，酸的種類對(duì)魚皮膠原的提取具有一定的影響，但關(guān)于有機(jī)酸種類對(duì)羅非魚皮膠原提取和性質(zhì)的影響卻未見(jiàn)報(bào)道。AA、TA、CA 分別為一元、二元、三元羧酸，通過(guò)研究它們對(duì)羅非魚膠原的提取和理化性質(zhì)的影響，將為有機(jī)酸種類對(duì)魚類膠原的提取機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。

因此，本研究利用AA、TA 和CA 提取羅非魚皮酸溶性膠原（acid-soluble collagen，ASC），通過(guò)ASC 的提取率測(cè)定、紫外光譜分析、圓二色光譜（CD）分析、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析、傅里葉變換紅外光譜（FTIR）分析、熱穩(wěn)定性測(cè)定和成纖維能力分析，探究有機(jī)酸種類對(duì)提取膠原理化性質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷凍羅非魚皮 寧德市夏威食品有限公司提供；TA、AA、CA 分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

UV-8000A 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；CD 光譜儀 英國(guó)Applied Photophysics公司；Aglient 1200 高效液相色譜儀 美國(guó)Aglient公司；Tensor 27 ATR-FTIR 光譜儀 德國(guó)Bruker 光譜儀器公司；Q2000 差示掃描量熱（DSC）儀 美國(guó)TA 儀器有限公司；TA-XT Plus 質(zhì)構(gòu)儀 英國(guó)Stable Micro System 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 羅非魚皮ASC 的提取 羅非魚皮ASC 的提取根據(jù)Shi 等[12]報(bào)道的方法，提取過(guò)程在4 ℃下完成。將解凍的魚皮放在0.1 mol/L NaOH 溶液（w/v，1:10）中浸泡36 h，然后用蒸餾水沖洗至中性。將漂洗好的魚皮以1:10 比例依次浸入10%（v/v）正丁醇和25%（v/v）乙醇，浸泡24 h 后用蒸餾水沖洗。漂洗好的魚皮以1:30（w/v）的比例分別放在0.5 mol/L AA、TA 和CA 中浸泡萃取48 h，萃取液用NaCl 鹽析后再通過(guò)透析、凍干得到純化的AA-ASC、TAASC 和CA-ASC。膠原的提取率通過(guò)如下公式進(jìn)行計(jì)算[13]：

式中：m 表示凍干膠原的質(zhì)量，g；M 表示干魚皮的質(zhì)量，g。

1.2.2 ASC 理化性質(zhì)測(cè)定

1.2.2.1 紫外吸收光譜 膠原紫外吸收光譜參考Meng 等[14]報(bào)道的方法進(jìn)行測(cè)定。稱取適量?jī)龈傻哪z原溶于10 mmol/L HCl（pH3.0）溶液中得到終濃度為0.2 mg/mL 的膠原溶液。以10 mmol/L HCl 溶液作為空白對(duì)照，利用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在190～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.2.2.2 CD 分析 膠原CD 光譜參考寇慧芝等[15]報(bào)道的方法進(jìn)行測(cè)定。稱取適量?jī)龈傻哪z原溶于10 mmol/L HCl 溶液中得到0.1 mg/mL 的膠原溶液，在25 ℃下利用CD 光譜儀在260～190 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，掃描速度為1 nm/min。

1.2.2.3 氨基酸組成分析 膠原溶解在含有0.1%苯酚的6 mol/L HCl 溶液后，放在110 ℃下消化水解22 h。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在60 ℃反復(fù)旋蒸去除鹽酸，再用0.02 mol/L HCl 溶解，過(guò)0.22 μm 水系膜后，用OPA/FMOC 進(jìn)行衍生，利用高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定氨基酸組成。

1.2.2.4 SDS-PAGE 分析 將凍干的膠原溶解在8 mol/L 尿素-2% SDS-20 mmol/L Tris-HCl（pH8.8）溶液后，采用4%濃縮凝膠和6%分離凝膠在8 mA電流下進(jìn)行SDS-PAGE 分析。然后按照馮玲玲等[16]的方法對(duì)凝膠進(jìn)行染色和脫色，利用凝膠成像儀拍照保存。

1.2.2.5 FTIR 分析 參照鄭清瑤等[17]報(bào)道的方法，利用衰減全反射-FTIR 光譜儀在室溫下對(duì)膠原進(jìn)行測(cè)定。取適量?jī)龈傻哪z原樣品放置在單反射鍺晶體池上，在4000～1000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，并在32 次掃描中以4 cm-1的分辨率采集信號(hào)。

1.2.2.6 膠原熱穩(wěn)定性測(cè)定 參考Liu 等[18]報(bào)道的方法，利用DSC 測(cè)定膠原蛋白的熱穩(wěn)定性，并通過(guò)設(shè)備配套軟件計(jì)算玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tm）和熱變性焓值（ΔH）。將凍干的膠原以1:40（w:v）比例溶于10 mmol/L HCl 溶液后，準(zhǔn)確稱取5 mg 左右樣品于鋁坩堝中，以空的坩堝作對(duì)照。掃描溫度范圍為10～50 ℃，升溫速率為5 ℃/min。

1.2.2.7 成纖維能力測(cè)定 膠原成纖維度的測(cè)定根據(jù)Meng 等[14]等報(bào)道的方法并稍作修改。參考Tang等[19]報(bào)道的方法，將膠原溶于10 mmol/L HCl 溶液中得到0.5 mg/mL 的膠原溶液。利用緩沖液在4 ℃對(duì)膠原溶液透析12 h，期間每3 h 更換一次透析液[19]。將透析好的膠原溶液置于25 ℃下孵育30 min 后，通過(guò)15000×g、20 ℃下離心20 min 后，利用Lowry 法測(cè)定上清液的蛋白含量。膠原成纖維度定義為離心后上清液中膠原質(zhì)量減少的百分比，按如下公式進(jìn)行計(jì)算：

式中：Y 是膠原的成纖維度，%；C0是膠原的初始濃度，mg/mL；C 是離心后上清的蛋白濃度，mg/mL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)處理軟件為Excel 16，圖形繪制軟件為Origin 2019，采用SPSS 18.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），并通過(guò)Duncan 多重比較進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同有機(jī)酸對(duì)羅非魚皮酸溶性膠原提取效果

圖1 顯示了羅非魚皮AA-ASC、TA-ASC 和CAASC 的提取率。由圖可知，AA-ASC 和TA-ASC 的提取率分別為15.87%和17.69%，顯著低于CA-ASC的提取率28.63%（P<0.05），均高于報(bào)道的羅非魚皮AA-ASC 提取率（11.70%）[20]。三種有機(jī)酸下的膠原提取率不同可能是因?yàn)锳A、TA、CA 分別為一元、二元、三元羧酸，在相同摩爾濃度下CA 中的多個(gè)羧基不斷解離[21]，與膠原的肽鏈競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合[22]，促進(jìn)膠原溶脹溶解。另一方面，浸提溶液的pH 通過(guò)調(diào)節(jié)電荷密度影響膠原的靜電相互作用和結(jié)構(gòu)[1]，pH 太低會(huì)引起膠原在提取過(guò)程中發(fā)生變性[23]，進(jìn)而影響膠原在魚皮中的溶解度和提取率。在相同摩爾濃度下TA 的pH 最低，可能由于魚皮膠原在提取過(guò)程中發(fā)生部分變性，結(jié)果導(dǎo)致TA-ASC 的提取率接近AAASC。

圖1 羅非魚皮酸溶性膠原提取率Fig.1 Yields of ASCs extracted from tilapia skin

2.2 不同有機(jī)酸對(duì)羅非魚皮酸溶性膠原紫外吸收的影響

AA-ASC、TA-ASC、CA-ASC 分別在223、221、219 nm 出現(xiàn)最大吸收峰（圖2），這歸因于膠原三螺旋肽鏈的-C=O、-COOH 和-CONH2等生色基團(tuán)的n→π*躍遷[24]。通常，膠原蛋白中酪氨酸和苯丙氨酸等芳香族生色氨基酸含量很少，在280 nm 處無(wú)明顯吸收峰[25]。因此，AA-ASC、TA-ASC、CA-ASC 在280 nm 處的吸收峰均不明顯，表明提取的膠原中雜蛋白含量少，純度高。這類似于報(bào)道的暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白的研究結(jié)果[25]。

圖2 羅非魚皮酸溶性膠原紫外吸收光譜Fig.2 UV spectra of ASCs extracted from tilapia skin

2.3 不同有機(jī)酸對(duì)羅非魚皮酸溶性膠原三螺旋結(jié)構(gòu)的影響

通常，天然膠原蛋白的CD 光譜有一個(gè)正吸收峰（220 nm）和一個(gè)負(fù)吸收峰（195～198 nm），分別來(lái)自蛋白多肽鏈的n→π*電躍遷和π→π*磁躍遷[26-27]。羅非魚皮AA-ASC、TA-ASC、CA-ASC 的最大正吸收峰和最大負(fù)吸收峰分別在220 和197 nm 左右（圖3），圖譜與橫坐標(biāo)軸的交叉點(diǎn)分別在213、216和213 nm，具有典型的三螺旋結(jié)構(gòu)[28]。在相同濃度（0.1 mg/L）下，AA-ASC、TA-ASC、CA-ASC 的CD光譜強(qiáng)度依次減弱，表明不同有機(jī)酸提取的膠原二級(jí)結(jié)構(gòu)存在差異[29]。CD 光譜中正負(fù)峰強(qiáng)度絕對(duì)值的比值（Rpn）用來(lái)反映膠原分子的三螺旋程度。非變性膠原的Rpn 值一般為0.12，當(dāng)膠原發(fā)生部分變性時(shí)，Rpn 值降低，圖譜與橫坐標(biāo)軸的交叉點(diǎn)紅移，膠原的三螺旋構(gòu)象含量降低[23,30]。AA-ASC、TA-ASC、CA-ASC 的Rpn 值分別為0.12、0.05、0.11，而且TAASC 的圖譜與橫坐標(biāo)軸的交叉點(diǎn)相對(duì)AA-ASC 和CA-ASC 發(fā)生了紅移（圖3）。這些結(jié)果表明AAASC 和CA-ASC 的完整性較好、三螺旋構(gòu)象含量較高，而TA-ASC 發(fā)生了部分變性。酸的解離常數(shù)（Ka）越高、pH 越低，膠原的溶脹性能就越強(qiáng)，但是有機(jī)酸會(huì)破壞膠原三螺旋結(jié)構(gòu)的酰胺鍵、端肽的不穩(wěn)定交聯(lián)以及分子內(nèi)/間的非共價(jià)鍵[31]。極低pH 的破壞作用可能會(huì)增強(qiáng)，從而導(dǎo)致膠原在提取過(guò)程中發(fā)生變性[22,31]。本實(shí)驗(yàn)中AA（Ka=1.7×10-5）、TA（Ka1=1.0×10-3，Ka2=4.6×10-5）和CA（Ka1=7.4×10-4，Ka2=1.7×10-5，Ka3=4.0×10-7）分別為一元、二元和三元羧酸，一級(jí)解離常數(shù)（Ka1）大小為：TA>CA>AA。TA-ASC 變性可能是因?yàn)門A 的Ka1值最大、酸性最強(qiáng)。

圖3 羅非魚皮酸溶性膠原CD 光譜（a）和Rpn 值（b）Fig.3 CD spectrum (a) and Rpn ratio (b) of ASCs extracted from tilapia skin

2.4 不同有機(jī)酸對(duì)羅非魚皮酸溶性膠原氨基酸組成的影響

羅非魚皮AA-ASC、TA-ASC、CA-ASC 的氨基酸組成測(cè)定結(jié)果如表1 所示。由表可知，AA-ASC、TA-ASC、CA-ASC 均富含甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、脯氨酸（Pro）和羥脯氨酸（Hyp）等膠原蛋白的特征氨基酸，同時(shí)組氨酸（His）、酪氨酸（Tyr）和賴氨酸（Lys）3 種非膠原特征氨基酸均未檢出，表明AAASC、TA-ASC、CA-ASC 均為高純度膠原。Gly 的含量最高，約占總氨基酸殘基的三分之一，這是因?yàn)槌薈-端的前10 個(gè)氨基酸殘基和N-端的后14 個(gè)氨基酸殘基，膠原三螺旋區(qū)域的肽段均以Gly-XY 的重復(fù)序列進(jìn)行分布[32]。AA-ASC、TA-ASC、CAASC 的Hyp 含量逐漸減少，表明膠原含量依次降低，可能也會(huì)影響膠原的熱穩(wěn)定性。

表1 羅非魚皮酸溶性膠原氨基酸組成（殘基數(shù)量/1000 個(gè)氨基酸殘基）Table 1 Amino acid compositions of ASCs extracted from tilapia skin (residues per 1000 total amino acid residues)

2.5 不同有機(jī)酸對(duì)羅非魚皮酸溶性膠原分子量的影響

羅非魚皮膠原的電泳圖譜如圖4 所示。由圖可知，AA-ASC、TA-ASC、CA-ASC 均由α（α1和α2）亞基、二聚體β亞基、三聚體γ亞基和少量高分子組分（HMWF）組成，三種膠原的α1和α2譜帶的強(qiáng)度比約為2:1。這些結(jié)果表明AA-ASC、TA-ASC、CA-ASC 均為典型的Ⅰ型膠原[33]。且膠原的亞基組成不受有機(jī)酸種類的影響。

圖4 羅非魚皮酸溶性膠原SDS-PAGE 圖Fig.4 SDS-PAGE patterns of ASCs extracted from tilapia skin

2.6 不同有機(jī)酸對(duì)羅非魚皮酸溶性膠原紅外光譜的影響

膠原的FTIR 光譜通過(guò)一組酰胺吸收區(qū)域進(jìn)行表征，這些由基團(tuán)振動(dòng)產(chǎn)生的酰胺帶提供了多肽鏈的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息[17]。羅非魚皮AA-ASC、TA-ASC、CA-ASC 的FTIR 光譜如圖5 所示。由圖可知，AAASC、TA-ASC、CA-ASC 的酰胺A 吸收峰分別在3293、3305、3300 cm-1。酰胺A 主要與N-H 基團(tuán)的伸縮振動(dòng)有關(guān)，當(dāng)N-H 基團(tuán)參與形成氫鍵時(shí)，酰胺A 峰向低波數(shù)移動(dòng)[17]。因此，AA-ASC 的N-H 基團(tuán)參與形成的氫鍵最多，其次是CA-ASC 和TA-ASC。AA-ASC、TA-ASC、CA-ASC 的酰胺Ⅰ分別在1629、1640、1633 cm-1，酰胺Ⅱ分別在1540、1546、1544 cm-1（圖5），意味著膠原中C=O 和C-N 參與維持膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵含量增加[17,34]。

圖5 羅非魚皮酸溶性膠原的紅外圖譜Fig.5 FTIR spectra of ASCs extracted from tilapia skin

2.7 不同有機(jī)酸對(duì)羅非魚皮酸溶性膠原熱穩(wěn)定性的影響

羅非魚皮AA-ASC、TA-ASC、CA-ASC 的DSC曲線如圖6 所示。AA-ASC、TA-ASC、CA-ASC 的熱轉(zhuǎn)變溫度（Tm）均在32 ℃左右，這與Yan 等[35]報(bào)道的AA 提取的羅非魚皮膠原的Tm（31.85 ℃）一致。圖6 的結(jié)果表明有機(jī)酸提取不會(huì)影響羅非魚皮ASC 的Tm。另一方面，變性焓（ΔH）與膠原分子周圍形成的水化網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的氫鍵數(shù)量相關(guān)[36]。AAASC、TA-ASC、CA-ASC 的ΔH 分別為1.18、0.73、0.35 J/g，表明三者的熱穩(wěn)定性依次降低。這可能是因?yàn)锳A-ASC 的亞氨基酸和氫鍵含量最高，TA-ASC的氫鍵含量低于CA-ASC，但亞氨基酸含量顯著高于CA-ASC（表1 和圖5）。鄧明霞等[37]通過(guò)相關(guān)性數(shù)學(xué)模型分析，也表明了氫鍵和亞氨基酸含量會(huì)影響淡水魚膠原的熱穩(wěn)定性。

圖6 羅非魚皮酸溶性膠原DSC 曲線Fig.6 DSC thermograms of ASCs extracted from tilapia skin

2.8 不同有機(jī)酸對(duì)羅非魚皮酸溶性膠原成纖維能力的影響

羅非魚皮AA-ASC、TA-ASC、CA-ASC 的濁度-時(shí)間曲線和動(dòng)力學(xué)常數(shù)如圖7 所示。膠原自組裝成纖維過(guò)程一般分為遲滯期（吸光度值保持不變）、增長(zhǎng)期（吸光度值快速增大）和穩(wěn)定期（吸光度值達(dá)到最大并保持穩(wěn)定狀態(tài)）。AA-ASC、TA-ASC、CAASC 的遲滯時(shí)間分別為6、21、19 min（圖7a）。研究表明，膠原三螺旋構(gòu)象含量降低會(huì)導(dǎo)致自組裝時(shí)間（遲滯期和增長(zhǎng)期）延長(zhǎng)[38]。在本研究中，AA-ASC的三螺旋構(gòu)象含量與CA-ASC 接近且均高于TAASC（圖3b），這可能導(dǎo)致TA-ASC 的遲滯期和自組裝時(shí)間最長(zhǎng)。由圖7 可知，穩(wěn)定期的吸光度值和動(dòng)力學(xué)常數(shù)大小順序依次為AA-ASC>CA-ASC>TAASC。這與膠原三螺旋構(gòu)象含量（圖3b）和氫鍵含量（圖5）的變化趨勢(shì)一致。這個(gè)結(jié)果表明自組裝成纖維過(guò)程可能受膠原分子的三螺旋結(jié)構(gòu)和氫鍵等因素的影響。

圖7 羅非魚皮酸溶性膠原的濁度-時(shí)間曲線（a）和動(dòng)力學(xué)常數(shù)（b）Fig.7 Turbidity-time curves (a) and kinetic constants (b) of ASCs extracted from tilapia skin

3 結(jié)論

本研究揭示了醋酸、酒石酸和檸檬酸三種有機(jī)酸對(duì)羅非魚膠原提取和性質(zhì)的影響。醋酸對(duì)羅非魚膠原提取率明顯低于其他有機(jī)酸，但提取的膠原其三螺旋構(gòu)象含量和熱變性焓值均最高。研究結(jié)果表明有機(jī)酸的種類會(huì)影響酸對(duì)膠原三螺旋結(jié)構(gòu)和氫鍵的破壞，進(jìn)而影響膠原的提取率、氨基酸組成、熱穩(wěn)定性和成纖維能力。膠原的成纖維速率主要受三螺旋構(gòu)象含量的影響，三螺旋構(gòu)象含量越高，成纖維速率越大。本研究為有機(jī)酸種類對(duì)羅非魚皮酸溶性膠原提取和性質(zhì)的影響機(jī)制提供了一定的理論基礎(chǔ)。