張乃丹，佐兆杭，王 穎,2,3,4,，孫 維，龐惟俏

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶 163319；2.國(guó)家雜糧工程技術(shù)中心，黑龍江大慶 163319；3.糧食副產(chǎn)物加工與利用教育部工程研究中心，黑龍江大慶 163319；4.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江大慶 163319）

玉米（Zea maysL.）是世界總產(chǎn)量最高的糧食作物[1]，在玉米的濕法加工過(guò)程中，可以獲取多種物質(zhì)。其中玉米皮是加工過(guò)程中分離出來(lái)的皮層部分，大約占玉米干重的14%[2-3]。在工業(yè)生產(chǎn)中，玉米皮多被用作飼料或者作為廢物丟棄，利用不夠充分、附加值低，造成了很大的資源浪費(fèi)。玉米皮富含纖維素、淀粉、脂肪、蛋白質(zhì)和酚酸等，其中酚酸主要為阿魏酸和二芥酸[4]，其內(nèi)阿魏酸含量高達(dá)3%[5]。阿魏酸是天然的抗氧化劑，具有多種生物活性，有良好的研究前景。目前已知阿魏酸及其衍生物具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、防治心血管疾病的功效[6-7]，同時(shí)還具有抗血栓[8]、抗菌消炎[9]、抗氧化[10]、抗突變和抗癌等作用[11]，其在食品加工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的研究和應(yīng)用日益廣泛[12-14]。

目前從米糠、麥麩中提取阿魏酸的研究比較成熟[15-17]，但很少有以玉米皮為原料提取阿魏酸。阿魏酸在植物中主要是和細(xì)胞壁物質(zhì)結(jié)合，堿液對(duì)玉米皮有良好的降解性，乙醇可以加快阿魏酸的提取，超聲輔助能短時(shí)性的增加細(xì)胞壁的通透性，從而高效地提取出阿魏酸[18]。大孔吸附樹(shù)脂可以通過(guò)其吸附性對(duì)化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行分離作用，節(jié)省費(fèi)用、穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)[19]。

本研究結(jié)合以米糠和麥麩為原料的提取方法，采用堿醇法提取阿魏酸，再此基礎(chǔ)上通過(guò)超聲輔助進(jìn)行提取。并通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂對(duì)阿魏酸提取液進(jìn)行純化。本研究增加了玉米皮附加值，為玉米皮深加工和阿魏酸開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米皮 山東博陽(yáng)生物科技有限公司；阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品 成都瑞芬思公司；α-淀粉酶（4×104U/mL）、堿性蛋白酶（2×105U/g）、亞硫酸鈉、氫氧化鈉 北京索萊寶科技有限公司；鹽酸、無(wú)水乙醇 遼寧泉瑞試劑有限公司；D101、HPD-100、AB-8 型大孔吸附樹(shù)脂 北京索萊寶科技有限公司。

A390 型紫外分光光度計(jì) 上海翱藝儀器有限公司；AL104 型電子天平 上海梅特勒-托利多儀器；DK-8D 型水浴鍋 山東千司科學(xué)儀器；KH-500GTDV超聲波清洗機(jī) 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；5702離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf 公司；TGL-16M 離心機(jī)湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、真空冷凍干燥機(jī) 上海舜制儀器制造有限公司；ZD-9550 搖床 Kylin-Bell 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 玉米皮預(yù)處理 玉米皮中具有較多的營(yíng)養(yǎng)成分，可先除去玉米皮中的淀粉和蛋白質(zhì)，降低提取液的粘度，降低其他成分對(duì)試驗(yàn)過(guò)程的影響。將玉米皮干燥粉碎后過(guò)60 目篩，按料液比1:10（g/mL）加入蒸餾水，放入60 ℃水浴鍋中，使用NaOH 將pH 調(diào)至6.0，加入1%的α-淀粉酶反應(yīng)1 h 后，滅酶（100 ℃，15 min）。等溫度降到53 ℃時(shí)，使用NaOH 將pH調(diào)至9.0，加入2%的堿性蛋白酶反應(yīng)2 h 后，滅酶（100 ℃，15 min）。等溫度降至室溫，4000 r/min 離心10 min，棄上清，蒸餾水清洗2 遍，將沉淀晾至干燥，得到去淀粉、去蛋白的玉米皮。

1.2.2 玉米皮中阿魏酸的提取 參考王蓓[20]的方法，稱(chēng)取10 g 預(yù)處理后的玉米皮，加入2%的亞硫酸鈉，選取不同濃度的氫氧化鈉溶液、堿醇比（NaOH:95%乙醇）和料液比（預(yù)處理后的玉米皮:堿醇混合液），在不同功率、時(shí)間和溫度的超聲波儀器中輔助提取。提取結(jié)束4000 r/min 離心10 min，用蒸餾水將沉淀洗滌2 次，合并上清，將pH 調(diào)節(jié)至4 進(jìn)行酸化，得到玉米皮中阿魏酸粗提液，定容至一定容量，靜置1 h 開(kāi)始測(cè)定。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3.1 料液比對(duì)粗提液中阿魏酸提取量的影響保持堿液質(zhì)量濃度4%，堿醇比2:1 g/mL，超聲時(shí)間30 min，超聲溫度60 ℃，超聲功率225 W，考察不同料液比（1:8、1:10、1:12、1:14、1:16 g/mL）對(duì)粗提液中阿魏酸提取量的作用。

1.2.3.2 堿液質(zhì)量濃度對(duì)粗提液中阿魏酸提取量的影響 保持料液比1:12 g/mL，堿醇比2:1 g/mL，超聲時(shí)間30 min，超聲溫度60 ℃，超聲功率225 W，考察不同堿液質(zhì)量濃度（0.5%、1%、2%、4%、6%）對(duì)粗提液中阿魏酸提取量的作用。

1.2.3.3 堿醇比對(duì)粗提液中阿魏酸提取量的影響保持料液比1:12 g/mL，堿液質(zhì)量濃度4%，超聲時(shí)間30 min，超聲溫度60 ℃，超聲功率225 W，考察不同堿醇比（1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1 g/mL）對(duì)粗提液中阿魏酸提取量的作用。

1.2.3.4 超聲時(shí)間對(duì)粗提液中阿魏酸提取量的影響保持料液比1:12 g/mL，堿液質(zhì)量濃度4%，堿醇比2:1 g/mL，超聲溫度60 ℃，超聲功率225 W?？疾觳煌晻r(shí)間（15、30、45、60、75 min）對(duì)粗提液中阿魏酸提取量的作用。

1.2.3.5 超聲溫度對(duì)粗提液中阿魏酸提取量的影響保持料液比1:12 g/mL，堿液質(zhì)量濃度4%，堿醇比2:1 g/mL，超聲時(shí)間30 min，超聲功率225 W，考察不同超聲溫度（20、40、60、80、100 ℃）對(duì)粗提液中阿魏酸提取量的作用。

1.2.3.6 超聲功率對(duì)粗提液中阿魏酸提取量的影響保持料液比1:12 g/mL，堿液質(zhì)量濃度4%，堿醇比2:1 g/mL，超聲時(shí)間30 min，超聲溫度60 ℃，考察不同超聲功率（125、150、175、200、225、250 W）對(duì)粗提液中阿魏酸提取量的作用。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取堿液質(zhì)量濃度、堿醇比、超聲溫度和超聲功率4 個(gè)因素，設(shè)計(jì)4 因素3 水平響應(yīng)面試驗(yàn)。表1為因素水平表。

1.2.5 阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制定及含量的計(jì)算 參考張康逸等[21]方法，稱(chēng)取阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用95%乙醇溶解定容至100 mL 棕色容量瓶中，搖勻得到濃度為0.1 mg/mL 的阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，避光儲(chǔ)存。將阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制成0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008 mg/mL 的阿魏酸標(biāo)樣溶液。用紫外分光光度計(jì)在320 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。得到阿魏酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=53.345x+0.0051，R2=0.9991，式中y 為吸光度，x 為阿魏酸溶液濃度（mg/mL）。

將阿魏酸粗提液稀釋至一定體積后，用紫外分光光度計(jì)于320 nm 處測(cè)定吸光值，進(jìn)行3 次平行測(cè)定，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算阿魏酸的提取量。計(jì)算阿魏酸提取量：

式中：X 為樣品中阿魏酸濃度（mg/mL）；V定為定容體積（mL）；W 為樣品的質(zhì)量（g）。

1.2.6 大孔吸附樹(shù)脂的預(yù)處理及選擇 用95%乙醇浸泡D101、HPD-100、AB-8 三種大孔吸附樹(shù)脂24 h后裝入層析柱中，用乙醇流動(dòng)沖洗，至流出液不渾濁，再將樹(shù)脂中的乙醇用蒸餾水洗去。

參考譚詩(shī)涵等[22]的方法，稱(chēng)取處理好的樹(shù)脂1 g，加入50 mL，0.3 mg/mL 的阿魏酸粗提液于振蕩搖床中（25 ℃，120 r/min，24 h），測(cè)定阿魏酸濃度。將吸附液過(guò)濾，用蒸餾水洗滌樹(shù)脂，加入50 mL 95%乙醇，置于振蕩搖床后（25 ℃，120 r/min，24 h），吸取上層液通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定其阿魏酸濃度。按照下式計(jì)算大孔樹(shù)脂的吸附率和解析率，選取吸附和解析能力較優(yōu)的大孔樹(shù)脂進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

式中：C0為吸附前樣液中阿魏酸濃度（mg/mL）；C1為吸附后上層液中阿魏酸濃度（mg/mL）；C2為解吸后上層液中阿魏酸濃度（mg/mL）。

1.2.7 大孔吸附樹(shù)脂純化玉米阿魏酸 參考尹麗等[23]的方法，稱(chēng)取一定量預(yù)處理后的HPD-100 型大孔樹(shù)脂，確定上樣量，在選取不同的阿魏酸粗提液上樣濃度、上樣流速、洗脫液質(zhì)量濃度和洗脫流速進(jìn)行大孔樹(shù)脂純化，測(cè)定流出液中阿魏酸的回收率。

1.2.7.1 上樣量的確定 將預(yù)處理后的HPD-100 型大孔吸附樹(shù)脂濕法入層析柱中，高約5 cm，即床體積為15 mL。將阿魏酸提取液緩慢上柱，控制上樣流速為3 mL/min，以15 mL 流出液體積為單位收集，測(cè)定流出液中阿魏酸的含量，得到阿魏酸的泄露率，確定最佳上樣量。

1.2.7.2 上樣濃度對(duì)回收率的影響 保持上樣流速3 mL/min，乙醇質(zhì)量濃度75%，洗脫流速1 mL/min，考察不同上樣濃度（0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL）對(duì)回收率的影響。

1.2.7.3 上樣流速對(duì)回收率的影響 保持上樣濃度0.3 mg/mL，乙醇質(zhì)量濃度75%，洗脫流速1 mL/min，考察不同上樣流速（2、3、4、5 mL/min）對(duì)回收率的影響。

1.2.7.4 乙醇質(zhì)量濃度對(duì)回收率的影響 保持上樣濃度0.3 mg/mL，上樣流速3 mL/min，洗脫流速1 mL/min，考察不同乙醇質(zhì)量濃度（35%、55%、75%、95%）對(duì)回收率的影響。

1.2.7.5 洗脫流速對(duì)回收率的影響 保持上樣濃度0.3 mg/mL、上樣流速3 mL/min、乙醇質(zhì)量濃度75%?？疾觳煌疵摿魉伲?.5、1、1.5、2 mg/mL）對(duì)回收率的影響。

1.2.8 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取上樣濃度、上樣流速、乙醇質(zhì)量濃度和洗脫流速4 個(gè)因素，設(shè)計(jì)4 因素3 水平響應(yīng)面試驗(yàn)。表2為因素水平表。

表2 響應(yīng)面因素水平表Table 2 Response surface factor level table

1.2.9 回收率的計(jì)算 參考尹麗等[23]的方法，計(jì)算回收率，公式如下：

式中：C0為吸附前樣液中阿魏酸濃度（mg/mL）；C2為解吸后上層液中阿魏酸濃度（mg/mL）；V1為吸附液體積（mL）；V2為解析液體積（mL）。

1.2.10 阿魏酸純度檢測(cè) 將純化后的阿魏酸溶液用流動(dòng)相稀釋?zhuān)?.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾后，加入進(jìn)樣瓶中，采用Ultimate Plus-C18（4.6×150 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈:0.1%磷酸水=22:78，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，在320 nm 波長(zhǎng)處進(jìn)行檢測(cè)，并采用峰面積歸一法觀(guān)察阿魏酸的純度[24]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次平行，采用SPSS 21.0、Design Expert 8.0.6 和Excel 2021 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲輔助堿醇法提取玉米皮中阿魏酸的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1.1 料液比對(duì)阿魏酸提取量的影響 由圖1 可知，隨著料液比的降低阿魏酸提取量隨之增加，提取量在1:12 g/mL 時(shí)達(dá)到最高值，之后隨著液體的增加阿魏酸提取量降低。可能是由于過(guò)多的提取液中和了游離出來(lái)的阿魏酸導(dǎo)致提取量降低。因此，在此試驗(yàn)條件下，最佳料液比為1:12 g/mL。

圖1 料液比對(duì)阿魏酸提取量的影響Fig.1 Influence of solid-liquid ratio on ferulic acid extraction

2.1.1.2 堿液質(zhì)量濃度對(duì)阿魏酸提取量的影響 由圖2 可知，隨著堿液質(zhì)量濃度的增加，提取量在4%時(shí)達(dá)到最高值，之后阿魏酸提取量呈下降趨勢(shì)?？赡苁怯捎谳^小的堿液質(zhì)量濃度不能使阿魏酸與大分子物質(zhì)分離，而堿液質(zhì)量濃度增加時(shí)提取液的黏度可能會(huì)隨之增大，所以較低或較高的堿液質(zhì)量濃度都會(huì)導(dǎo)致阿魏酸的釋放受到抑制[18]。因此，在此實(shí)驗(yàn)條件下，最佳堿液質(zhì)量濃度為4%。

圖2 堿液質(zhì)量濃度對(duì)阿魏酸提取量的影響Fig.2 Influence of lye mass concentration on ferulic acid extraction

2.1.1.3 堿醇比對(duì)阿魏酸提取量的影響 由圖3 可知，堿醇比為2:1 g/mL 時(shí)阿魏酸的提取量達(dá)到最高值?？赡苁怯捎谳^少的堿液可能無(wú)法打開(kāi)連接的酯鍵，只釋放出部分的阿魏酸，而較多的堿液會(huì)導(dǎo)致提取液的黏度大，影響阿魏酸釋放[20]，導(dǎo)致阿魏酸提取量降低。因此，在此實(shí)驗(yàn)條件下，最佳堿醇比為2:1 g/mL。

2.1.1.4 超聲時(shí)間對(duì)阿魏酸提取量的影響 由圖4可知，超聲時(shí)間30 min 時(shí)提取量達(dá)到最高值，隨著超聲時(shí)間的增加提取量緩慢降低?？赡苁怯捎诔晻r(shí)間越長(zhǎng)阿魏酸暴露在空氣中容易被氧化破壞[25]。因此，在此實(shí)驗(yàn)條件下，最佳超聲時(shí)間為30 min。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)阿魏酸提取量的影響Fig.4 Influence of ultrasonic time on ferulic acid extraction

2.1.1.5 超聲溫度對(duì)阿魏酸提取量的影響 由圖5可知，隨著超聲溫度的增加阿魏酸的提取量逐漸增加，提取量在60 ℃時(shí)達(dá)到最高值，之后隨著超聲溫度的增加阿魏酸的提取量呈下降趨勢(shì)?？赡苁怯捎谶^(guò)高的溫度導(dǎo)致阿魏酸與其他物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，從而降低了阿魏酸的提取量[18]。因此，在此實(shí)驗(yàn)條件下，最佳超聲溫度為60 ℃。

圖5 超聲溫度對(duì)阿魏酸提取量的影響Fig.5 Influence of ultrasonic temperature on ferulic acid extraction

2.1.1.6 超聲功率對(duì)阿魏酸提取量的影響 由圖6可知，隨著超聲功率的增加阿魏酸的提取量逐漸增加，提取量在225 W 時(shí)達(dá)到最高值，之后隨著超聲功率的增加阿魏酸提取量呈下降趨勢(shì)?？赡苁怯捎谶^(guò)大的超聲功率會(huì)導(dǎo)致游離的阿魏酸不穩(wěn)定從而促使其分解，降低提取量[25]。因此，在此實(shí)驗(yàn)條件下，最佳超聲功率為225 W。

圖6 超聲功率對(duì)阿魏酸提取量的影響Fig.6 Influence of ultrasonic power on ferulic acid extraction

2.1.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果 以單因素實(shí)驗(yàn)為參考選取4 個(gè)影響較大的因素，以阿魏酸提取量為指標(biāo)，設(shè)計(jì)4 因素3 水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，確定最佳提取工藝條件。

通過(guò)Design Expert 8.0 軟件對(duì)表3 數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到二次多項(xiàng)回歸方程：Y=22.41+0.26A+0.32B+0.3C+0.21D+0.027AB+0.2AC-0.22AD+0.8BC+0.36BD+-0.077CD-1.84A2-1.56B2-1.45C2-1.72D2

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及阿魏酸提取量Table 3 Response surface test design and ferulic acid extraction

表4 為響應(yīng)面回歸模型的方差分析?？芍貧w模型極顯著（P<0.0001），而回歸方程失擬項(xiàng)P值為0.2691>0.05，檢驗(yàn)結(jié)果不顯著，表明該模型能夠很好地將實(shí)驗(yàn)值真實(shí)地反映出來(lái)，并利用此回歸方程取代試驗(yàn)實(shí)際點(diǎn)對(duì)玉米皮中阿魏酸的提取進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。由方差分析表可知，因素A、B、C 和D 對(duì)玉米皮中提取阿魏酸的提取量有極顯著（P<0.0001）影響，各因素對(duì)玉米皮中提取阿魏酸的提取量影響順序依次為堿醇比>超聲溫度>堿液質(zhì)量濃度>超聲功率。

表4 方差分析及顯著性檢驗(yàn)表Table 4 Variance analysis and significance test table

由圖7 可知，響應(yīng)面圖的曲面越陡峭，兩個(gè)因素之間相互作用越強(qiáng)，等高線(xiàn)越密集并會(huì)呈現(xiàn)出橢圓形[26-27]。AC 交互和AD 交互作用對(duì)響應(yīng)值有顯著性影響，且BC 交互與BD 交互曲面彎曲程度相較前二者更大。經(jīng)Design Expert 8.06 優(yōu)化玉米皮中提取阿魏酸工藝參數(shù)：堿液質(zhì)量濃度4.16%、堿醇比2.15:1 g/mL、超聲溫度58.92 ℃、超聲功率228.75 W。此條件下阿魏酸的提取量預(yù)測(cè)值可達(dá)22.47 mg/g。為驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果真實(shí)性，考慮到實(shí)踐操作可行性，優(yōu)化工藝參數(shù)為料液比1:12 g/mL、堿液質(zhì)量濃度4%、堿醇比2:1 g/mL，超聲時(shí)間30 min，超聲溫度59 ℃，超聲功率229 W，重復(fù)3 次試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，得到阿魏酸提取量為22.31 mg/g（誤差0.71%），證明優(yōu)化的工藝參數(shù)具有準(zhǔn)確性。

圖7 各因素交互作用對(duì)阿魏酸提取量的響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖Fig.7 Response surface and contour plots of the interaction of factors on ferulic acid extraction

2.2 大孔吸附樹(shù)脂法純化阿魏酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 大孔吸附樹(shù)脂靜態(tài)吸附與解析實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由圖8 可以看出，三種大孔吸附樹(shù)脂對(duì)玉米阿魏酸提取液的吸附率大小順序?yàn)椋篐PD-100>D101>AB-8；解析率大小順序?yàn)椋篐PD-100>AB-8>D101。HPD-100 型大孔吸附樹(shù)脂適用于天然產(chǎn)物（黃酮類(lèi)、萜類(lèi)、酚酸類(lèi)等）的提取分離[28]。因此，選用HPD-100 大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 大孔吸附樹(shù)脂純化玉米阿魏酸試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2.1 上樣量的確定 由圖9 可知，床體積超過(guò)6 BV 時(shí)，隨著上樣量的增加，阿魏酸大量泄露損失。因此，最佳上樣量為6 倍床體積。

圖9 玉米阿魏酸泄露曲線(xiàn)Fig.9 Ferulic acid leakage curve of corn

2.2.2.2 上樣濃度對(duì)回收率的影響 由圖10 可知，回收率隨著上樣濃度的增加，呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，0.3 mg/mL 最高，后又出現(xiàn)下降趨勢(shì)，這可能是由于上樣濃度較低時(shí)樹(shù)脂的處理量大，吸附率也大。而較高的濃度可能會(huì)增加粘度從而影響樹(shù)脂的吸附能力[20]。因此，在此實(shí)驗(yàn)條件下，最佳上樣液濃度為0.3 mg/mL。

圖10 不同上樣濃度對(duì)回收率的影響Fig.10 Influence of different loading concentration on recovery rate

2.2.2.3 上樣流速對(duì)回收率的影響 由圖11 可知，回收率隨著上樣流速的增加，呈現(xiàn)先升高，在3 mL/min時(shí)最高，后又呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。可能是由于太慢的流速會(huì)浪費(fèi)大量的時(shí)間，導(dǎo)致大孔樹(shù)脂表面出現(xiàn)堵塞，而過(guò)快的流速時(shí)大孔樹(shù)脂和樣品的接觸時(shí)間過(guò)短，使樣品不能在大孔樹(shù)脂表面充分吸附，導(dǎo)致泄露率增加，損失增加[29]。因此，在此實(shí)驗(yàn)條件下，最佳上樣流速為3 mL/min。

圖11 不同上樣流速對(duì)回收率的影響Fig.11 Influence of different loading velocity on recovery rate

2.2.2.4 乙醇質(zhì)量濃度對(duì)回收率的影響 由圖12 可知，回收率隨著乙醇質(zhì)量濃度的增加而呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在75%時(shí)達(dá)到最高值，隨后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。可能是由于乙醇質(zhì)量濃度較低時(shí)洗脫不徹底，而過(guò)高濃度的乙醇會(huì)導(dǎo)致大量的樣品和雜質(zhì)一起被洗脫下來(lái)，導(dǎo)致回收率和質(zhì)量降低[30]。因此，在此實(shí)驗(yàn)條件下，最佳乙醇質(zhì)量濃度為75%。

圖12 不同乙醇質(zhì)量濃度對(duì)回收率的影響Fig.12 Influence of different concentration of ethanol on recovery rate

2.2.2.5 洗脫流速對(duì)回收率的影響 由圖13 可知，回收率隨著洗脫流速的增加呈現(xiàn)先升高，在1 mL/min處最高，之后呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)?？赡苁怯捎谳^快的洗脫流速樣品沒(méi)有充足的時(shí)間從大孔樹(shù)脂中分配到洗脫劑中[31]。因此，在此實(shí)驗(yàn)條件下，最佳洗脫流速為1 mL/min。

圖13 不同洗脫流速對(duì)回收率的影響Fig.13 Influence of different elution velocity on recovery rate

2.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果 以單因素實(shí)驗(yàn)為參考，以阿魏酸回收率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)4 因素3 水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，確定最佳純化工藝條件。

通過(guò)Design Expert 8.0 軟件對(duì)表5 數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到二次多項(xiàng)回歸方程：Y=95.41+0.47A+0.55B-0.15C+0.53D+0.14AB+0.075AC+0.038AD+0.07BC-0.25BD+0.56CD-1.55A2-2.16B2-1.91C2-2.19D2

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及阿魏酸回收率Table 5 Response surface design and ferulic acid recovery rate

表6 為響應(yīng)面回歸模型的方差分析?？芍貧w模型極顯著（P<0.01），而回歸方程失擬項(xiàng)P值為0.5137>0.05，檢驗(yàn)結(jié)果不顯著，表明該模型能夠很好地將實(shí)驗(yàn)值真實(shí)的反映出來(lái)，并利用此回歸方程取代試驗(yàn)實(shí)際點(diǎn)對(duì)玉米阿魏酸的純化進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。由方差分析表可知，因素A、B、C 和D 對(duì)玉米皮阿魏酸的回收率有極顯著（P<0.01）影響，各因素對(duì)玉米皮阿魏酸的回收率順序依次為上樣流速>洗脫流速>上樣濃度>乙醇質(zhì)量濃度。

表6 方差分析及顯著性檢驗(yàn)表Table 6 Variance analysis and significance test table

由圖14 可知，AB 交互、BD 交互和CD 交互曲面彎曲程度均較大，且AB 交互彎曲程度大于BD與CD，與回歸方程的方差分析結(jié)果一致。經(jīng)Design Expert 8.06 優(yōu)化玉米皮阿魏酸的回收率工藝參數(shù)：上樣濃度0.32 mg/mL，上樣流速3.13 mL/min，乙醇質(zhì)量濃度74.6%，洗脫流速1.06 mL/min。此條件下玉米皮阿魏酸的回收率預(yù)測(cè)值可達(dá)95.52%。為驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果真實(shí)性，考慮到實(shí)踐操作可行性，優(yōu)化工藝參數(shù)為上樣濃度0.3 mg/mL，上樣流速3 mL/min，乙醇質(zhì)量濃度75%，洗脫流速1 mL/min，重復(fù)3 次試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，得到玉米皮阿魏酸的回收率為95.17%（誤差0.37%），證明優(yōu)化的工藝參數(shù)具有準(zhǔn)確性。

2.2.4 阿魏酸純度檢測(cè) 圖15 為純化后阿魏酸的高相液相色譜圖。通過(guò)面積歸一法得出面積，得到純化后的阿魏酸純度為81.56%。

圖15 純化后阿魏酸高效液相色譜圖Fig.15 HPLC of ferulic acid after purification

3 結(jié)論

本研究采用超聲輔助堿醇法提取，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)得出最佳提取工藝條件為：料液比1:12 g/mL，堿液質(zhì)量濃度4%，堿醇比2:1 g/mL，超聲時(shí)間30 min，超聲溫度59 ℃，超聲功率229 W。此條件下阿魏酸的提取量可達(dá)22.31 mg/g。進(jìn)一步通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂法對(duì)玉米阿魏酸進(jìn)行純化，通過(guò)靜態(tài)吸附方法選出吸附和解吸能力最好的HPD-100 大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行玉米阿魏酸的分離純化。并在動(dòng)態(tài)吸附方法中確定最佳上樣量為6 倍床體積，在通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)得出最佳純化工藝條件為：上樣濃度0.3 mg/mL，上樣流速3 mL/min，乙醇質(zhì)量濃度75%，洗脫流速1 mL/min。此條件下玉米皮阿魏酸的回收率可達(dá)95.17%，阿魏酸純度為81.56%。本研究增加了玉米皮附加值，為玉米皮深加工和阿魏酸開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。