岳程程，王 哲，佟麗鳳，邢維臣，段玉敏，王致力，肖志剛，王 鵬,

（1.沈陽師范大學(xué)，遼寧沈陽 110034；2.東方集團(tuán)哈爾濱福肴食品有限公司，黑龍江哈爾濱 150001）

大豆是重要的油料作物和植物蛋白來源之一，在農(nóng)業(yè)中占有重要的地位。低溫脫脂大豆粕（簡(jiǎn)稱大豆粕）是大豆榨油后的剩余副產(chǎn)物，其含有35%～55%的蛋白質(zhì)以及豐富的功能因子，如大豆異黃酮、大豆膳食纖維等[1]，常作為飼料行業(yè)的加工原料。雖然大豆粕含有較豐富的植物蛋白質(zhì)資源，但由于其經(jīng)濟(jì)價(jià)值低，造成了優(yōu)質(zhì)植物蛋白資源的浪費(fèi)，因此，有必要對(duì)大豆粕開展高值化開發(fā)利用。近年來，作為動(dòng)物肉替代品的高水分?jǐn)D壓植物蛋白肉受到了越來越多的關(guān)注[2-3]，由于大豆分離蛋白中含有近90%的球蛋白和5%的白蛋白，使其成為加工植物蛋白肉的理想原料[4]。大豆分離蛋白主要是從大豆粕中分離提取的，其使用成本要遠(yuǎn)高于大豆粕，同時(shí)，以大豆分離蛋白作為植物蛋白肉的加工原料也會(huì)直接推高產(chǎn)品的生產(chǎn)成本。此外，大豆粕中的部分不溶性膳食纖維在擠壓過程中會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄陨攀忱w維，這會(huì)影響擠壓產(chǎn)品的流變性能及品質(zhì)[5]，因此，探究利用大豆粕替代大豆分離蛋白作為高水分?jǐn)D壓植物蛋白肉加工原料的可能性，對(duì)生產(chǎn)企業(yè)控制生產(chǎn)成本及提高大豆粕經(jīng)濟(jì)價(jià)值都具有重要意義。

高水分?jǐn)D壓技術(shù)是新興的植物蛋白重組技術(shù)[6]，擠壓原料的水分含量通常達(dá)到60%以上，采用該技術(shù)制成的產(chǎn)品質(zhì)地緊密、口感細(xì)膩，具有類似于動(dòng)物肌肉的纖維組織[7]，而且無需復(fù)水即可直接食用。由于水分具有增塑、導(dǎo)熱、降黏、熟化和利于成型的作用，因此，在擠壓過程中的水分添加量對(duì)植物蛋白肉的順利擠出和最終產(chǎn)品特性的形成有著十分重要的作用。產(chǎn)品原料被水浸潤(rùn)軟化后，其熔融溫度低于熱分解溫度，易于后續(xù)的擠壓加工和營(yíng)養(yǎng)成分的保護(hù)[8]。此外，水分還可以作為反應(yīng)溶劑降低物料的黏度和在機(jī)筒內(nèi)的停留時(shí)間，進(jìn)而降低蛋白質(zhì)亞基之間的聚合交聯(lián)，增加二硫鍵與氫鍵、疏水作用之間的協(xié)同作用，并影響產(chǎn)品的色澤，提高產(chǎn)品的纖維化程度[9]。Lin 等[10]以大豆分離蛋白和小麥粉為原料，通過研究發(fā)現(xiàn)物料含水率是影響擠壓過程最重要的因素。張玉潔等[11]以大豆分離蛋白（SPI）和金線魚魚糜為原料，證實(shí)了水熱參數(shù)組合作用顯著（P<0.05）影響SPI-魚糜混合物的微觀結(jié)構(gòu)以及質(zhì)構(gòu)特性，并且物料水分的影響更顯著。

為了探究大豆粕能否作為高水分?jǐn)D壓植物蛋白肉的加工原料，本文以低溫脫脂大豆粕為原料，固定進(jìn)料速度、螺桿轉(zhuǎn)速、機(jī)筒溫度等條件，考察水分添加量對(duì)擠壓植物蛋白肉理化性質(zhì)和微觀結(jié)構(gòu)的影響。本文的研究結(jié)果將為大豆粕作為原料在高水分?jǐn)D壓植物蛋白肉中的應(yīng)用提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

低溫脫脂大豆粕（水分含量10.62%；蛋白含量38.5%（干基）；纖維含量4.33%（干基）；灰分含量4.28%（干基））黑龍江冬雪生物科技有限公司；磷酸鹽博邁德生物化學(xué)試劑有限公司；尿素 天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；巰基乙醇 麥克林試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉 Coolaber Science &Technology。

UVTE-36 雙螺桿擠壓機(jī) 長(zhǎng)沙創(chuàng)享食品科技有限公司；CT3 4500 型質(zhì)構(gòu)儀 美國(guó)Brookfield 公司；CR-400 型色彩色差計(jì) 日本柯尼卡美能達(dá)有限公司；TA Q20 差式掃描量熱儀 美國(guó)TA 公司；貝克曼冷凍離心機(jī) 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；SU3500 掃描電子顯微鏡 日本Hitachi Ltd 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大豆粕植物肉擠壓實(shí)驗(yàn) 根據(jù)擠壓機(jī)的構(gòu)造特點(diǎn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將水分添加量分別設(shè)置為10.5、11、11.5、12 和12.5 kg/h（通過預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)得上述水分添加量范圍內(nèi)制備的植物肉含水量皆大于60%，所對(duì)應(yīng)的含水量分別為61%、62%、63%、64%和65%），其他擠壓參數(shù)不變，將粉碎且過100 目篩的低溫脫脂大豆粕以8 kg/h 的速度從喂料區(qū)加入到雙螺桿擠壓機(jī)機(jī)筒中，設(shè)定螺桿轉(zhuǎn)速為220 r/min，機(jī)筒共開啟六段加熱區(qū)，溫度分別設(shè)定為（40±1）、（60±1）、（90±1）、（120±1）、（150±1）和（160±1）℃，冷卻裝置溫度設(shè)定在（55±1）℃，進(jìn)行擠壓試驗(yàn)。將擠出的植物蛋白肉冷卻至室溫后，對(duì)一部分試樣進(jìn)行質(zhì)構(gòu)和顏色測(cè)試，另一部分試樣經(jīng)真空冷凍干燥后粉碎，并過100 目篩后進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2.2 豆粕植物肉色澤測(cè)定 采用色差儀測(cè)定植物蛋白肉的L*、a*、b*的數(shù)值。對(duì)每個(gè)樣品3 個(gè)不同位置的色澤進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)實(shí)驗(yàn)測(cè)定至少進(jìn)行3 次，去掉異常值，取平均值。

1.2.3 豆粕植物肉質(zhì)構(gòu)特性測(cè)定 參考肖志剛等[12]的方法并做適當(dāng)修改。將植物蛋白肉樣品裁剪為長(zhǎng)寬均為25 mm 高為10 mm 的長(zhǎng)方體，設(shè)置質(zhì)構(gòu)儀操作條件：TPA 模式，探頭選用TA-5，測(cè)試前速度1.0 mm/s，測(cè)試速度1.0 mm/s，測(cè)試后速度1.0 mm/s，下壓程度50%，測(cè)定樣品硬度、彈性、咀嚼性的數(shù)值，每個(gè)樣品進(jìn)行3 次平行測(cè)定，取平均值。

1.2.4 豆粕植物肉持水性、持油性測(cè)定

1.2.4.1 豆粕植物肉持水性 參考Mazaheri 等[13]的方法并加以改進(jìn)。稱取1.5 g 植物蛋白肉樣品放入到50 mL 的離心管中，然后加入30 mL 的去離子水，室溫下渦旋10 min 后于4000 r/min 離心20 min，然后倒掉上清液，植物蛋白肉的持水性根據(jù)下列公式進(jìn)行計(jì)算:

式中：m 為樣品的質(zhì)量，g；m1為樣品的質(zhì)量+離心管質(zhì)量，g；m2為離心管除去上清液后的質(zhì)量，g。

1.2.4.2 豆粕植物肉持油性 參考Mazaheri 等[13]的方法并加以改進(jìn)。稱取1.5 g 植物蛋白肉樣品放入到50 mL 的離心管中，然加入30 mL 的葵花籽油，室溫下渦旋10 min 后于4000 r/min 離心20 min，然后倒掉上清液，植物蛋白肉的持油性根據(jù)下列公式進(jìn)行計(jì)算：

式中：m 為樣品的質(zhì)量，g；m1為樣品的質(zhì)量+離心管質(zhì)量，g；m2為離心管除去上清液后的質(zhì)量，g。

1.2.5 豆粕植物肉熱特性分析 參考張金闖[14]的方法并加以改進(jìn)。稱取5 mg 樣品置于耐高壓鋁盤中，密封。使用TA Q20 差式掃描量熱儀，掃描溫度區(qū)間25～130 ℃、升溫速率5 ℃/min，N2保護(hù)，N2流速為50 mL/min。空鋁盤做參比。記錄熱轉(zhuǎn)變起始溫度（To）、熱轉(zhuǎn)變峰值溫度（TP）、熱轉(zhuǎn)變焓值（ΔH）和峰寬（ΔT），每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次，結(jié)果取平均值。

1.2.6 豆粕植物肉SDS-PAGE 凝膠電泳測(cè)定 利用SDS-PAGE 凝膠電泳測(cè)定植物蛋白肉的相對(duì)分子量，具體操作參考張金闖[14]的方法并加以改進(jìn)。將不同水分添加量擠出樣品經(jīng)過冷凍干燥后，粉碎，過100 目篩網(wǎng)。將過篩樣品（2 mg）溶于0.5 mL 樣品緩沖液（0.08 mol/L Tris-HCl 緩沖液，pH6.8），1%（w/v）SDS，2%（v/v）2-ME，5%（v/v）甘油和0.025%（w/v）溴酚藍(lán)并充分混合。然后將樣品在沸水浴中加熱10 min，12000 r/min 離心10 min。進(jìn)樣時(shí)取上清5 μL進(jìn)樣，Marker 分子量范圍為10000 至250000 Da。在Mini-PROTEAN 系統(tǒng)上進(jìn)行電泳，所配制電泳膠為5%的濃縮膠和12%的分離膠。電泳選取恒壓模式，首先電壓選用80 V，溴酚藍(lán)條帶跑至濃縮膠底端時(shí)換用110 V 電壓，等溴酚藍(lán)條帶跑至底端停止。采用考馬斯亮藍(lán)R250 振蕩染色60 min。染色完成后，用脫色液進(jìn)行振蕩脫色10 h，每隔1 h 更換一次脫色液。使用Gel DocTMXR+凝膠成像系統(tǒng)拍攝蛋白質(zhì)電泳光譜的圖像。

1.2.7 豆粕植物肉掃描電鏡觀察 將冷凍干燥后的植物蛋白肉樣品進(jìn)行橫縱方向切片并固定在樣品臺(tái)上。采用Hitachi IB-5 離子鍍膜儀進(jìn)行噴金處理后，置于SU8010 掃描電子顯微鏡下放大300 倍觀察并拍照。

1.2.8 豆粕植物肉化學(xué)交聯(lián)作用測(cè)定 參考肖志剛等[15]的方法并加以改進(jìn)。取粉末狀樣品0.25 g（精確至0.1 mg）于25 mL 燒杯中，分別加入10 mL 八種溶劑：a.0.035 mol·L-1pH7.6 磷酸鹽緩沖溶液（P）；b.磷酸鹽緩沖液中尿素含量為8 mol·L-1尿素（P+U）；c.磷酸鹽緩沖溶液中2-巰基乙醇（2-ME）0.1 mol·L-1（P+M）；d.磷酸緩沖液中十二烷基硫酸鈉（SDS）1.5 g·100 mL-1（P+S）；e.磷酸鹽緩沖溶液中尿素和2-ME 分別為8 和0.1 mol·L-1（P+U+M）；f.磷酸鹽緩沖液中SDS 和尿素分別為1.5 g·100 mL-1和8 mol·L-1（P+U+S）；g.磷酸鹽緩沖液中SDS 和2-ME 分別為1.5 g·100 mL-1和0.1 mol·L-1（P+S+M）；h.磷酸鹽緩沖溶液中尿素為8 mol·L-1，SDS 為1.5 g·100 mL-1，2-ME 為0.1 mol·L-1（P+U+S+M），常溫下攪拌浸提1 h 后放入冰箱4 ℃保存，離心（12000×g，10 ℃，15 min），取上清液。沉淀中再分別加入10 mL 上述八種溶劑，重復(fù)浸提兩次，離心。取1 mL 上清液于1.5 mL 離心管中（36×3 個(gè)），混勻（搖床160 r/min，1 h）。加20 μL 到96 孔酶標(biāo)板的樣品孔中，采用Lowery法測(cè)得（測(cè)定波長(zhǎng)650 nm）上清液中可溶性蛋白含量，原料和擠出樣品中總的蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法測(cè)定，蛋白質(zhì)溶解度計(jì)算方法為上清液中可溶性蛋白與樣品中總蛋白的比值。每次測(cè)量重復(fù)三次。蛋白質(zhì)溶解度，總蛋白質(zhì)量濃度根據(jù)下列公式進(jìn)行計(jì)算：

根據(jù)不同溶液中的溶解度計(jì)算各種化學(xué)鍵：天然狀態(tài)蛋白：a；氫鍵作用：b-a；二硫鍵：c-a；疏水作用：d-a；氫鍵和二硫鍵交叉作用：e+a-b-c；氫鍵和疏水作用交叉作用：f+a-b-d；疏水和二硫鍵交叉作用：g+a-c-d；氫鍵和二硫鍵和疏水作用交叉作用：h+b+c+d-a-e-f-g。

1.2.9 豆粕植物肉蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析 參考Guo等[16]的方法并加以改進(jìn)，將1 mg 樣品和100 mg 溴化鉀稱重制成透明片劑，掃描范圍設(shè)置為1600～1700 cm-1，分辨率為4 cm-1和信號(hào)掃描64 次。使用Peakfit 版本4.12 軟件處理光譜。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)結(jié)果分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件和Origin 2018 軟件進(jìn)行分析及圖形繪制。通過單因素方差分析（ANOVA）確定顯著性，然后進(jìn)行Duncan 檢驗(yàn)，通過Pearson 相關(guān)系數(shù)法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，所得試驗(yàn)結(jié)果均采用三次重復(fù)試驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 水分添加量對(duì)植物蛋白肉外觀色澤的影響

水分添加量對(duì)植物蛋白肉外觀色澤的影響如表1 所示，隨著水分添加量從10.5 kg/h 增加到11.5 kg/h時(shí)，植物蛋白肉亮度值（L*）逐漸增加，而紅綠值（a*）逐漸下降，這表明適當(dāng)增加水分含量有利于提高植物蛋白肉產(chǎn)品的外觀色澤。水分添加量的增加促進(jìn)了組織化蛋白形成更多的定向纖維和多孔結(jié)構(gòu)，并且隨著纖維化程度的提高，在植物蛋白肉的表面形成了一層光滑的薄膜結(jié)構(gòu)[8]；同時(shí)水分含量增加也會(huì)導(dǎo)致物料粘度降低，這減少了推動(dòng)物料通過機(jī)筒所需的力以及物料與螺桿和機(jī)筒之間的摩擦，縮短了物料在擠壓機(jī)中的停留時(shí)間，降低了美拉德反應(yīng)引起的褐變程度[17]，從而提高了植物蛋白肉的光澤度。此外，隨著水分含量的增加，水分子與受熱斷開的蛋白質(zhì)鏈上的親水結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合更加緊密，塑化作用增強(qiáng)，這可能與顏色L*的增加有關(guān)。陳鋒亮等[18]和張汆[19]也發(fā)現(xiàn)了物料水分的增加會(huì)促使大豆蛋白素肉或花生蛋白素肉變得更亮白。然而，當(dāng)水分添加量從11.5 kg/h進(jìn)一步升高到12.5 kg/h 時(shí)，植物蛋白肉的亮度值呈下降趨勢(shì)，這可能是因?yàn)楫?dāng)水分添加量過多時(shí)，物料的黏度也隨之升高，物料在機(jī)筒內(nèi)的滯留時(shí)間變長(zhǎng)，因此加劇了物料之間發(fā)生美拉德反應(yīng)的程度[20]，從而使植物肉的外觀色澤下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，適量的物料水分含量有助于提高植物蛋白肉產(chǎn)品的外觀色澤。

表1 水分添加量對(duì)植物蛋白肉外觀色澤、質(zhì)構(gòu)特性的影響Table 1 Effect of water addition on appearance and color and texture properties of plant protein meat

2.2 水分添加量對(duì)植物蛋白肉質(zhì)構(gòu)特性的影響

表1 列出了水分添加量對(duì)植物蛋白肉質(zhì)構(gòu)特性的影響結(jié)果。從表1 中可以看出，不同的水分添加量對(duì)植物蛋白肉的硬度、咀嚼度和彈性具有顯著影響（P<0.05）。隨著水分添加量的逐漸增加，物料在機(jī)筒內(nèi)結(jié)合了過多的水分，導(dǎo)致植物蛋白肉的質(zhì)地變得愈加柔軟，其硬度、咀嚼度和彈性均顯著降低（P<0.05），尤其以硬度變化最為明顯，植物蛋白肉的硬度由2898.83 g 顯著降至1435.00 g（P<0.05），而咀嚼度和彈性則分別由25.82 g 和0.94 降至10.66 g和0.83，由此可知，通過調(diào)節(jié)水分添加量能夠調(diào)控植物蛋白肉產(chǎn)品的口感。

2.3 水分添加量對(duì)植物蛋白肉持水性、持油性的影響

水分添加量對(duì)植物蛋白肉持水性、持油性的影響如圖1 所示，隨著水分添加量的增加，植物蛋白肉的持水性、持油性均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)水分添加量低于11.5 kg/h 時(shí)，植物蛋白肉持水性和持油性的升高主要是因?yàn)樗衷跀D壓過程中起到了增塑的作用[21]，一定量的水分可以加快聚合物分子的運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)-水的相互作用，從而促使更多的疏水基團(tuán)暴露，這加速了蛋白質(zhì)的變性，并引起蛋白質(zhì)的凝聚度下降，蛋白質(zhì)的溶脹特性和形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的能力進(jìn)一步得到增強(qiáng)，產(chǎn)品組織化程度下降，從而導(dǎo)致植物蛋白肉的持水和持油能力均得到提高[22]。此外，豆粕中的不溶性膳食纖維在擠壓的作用下會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄陨攀忱w維，這也有助于提高植物蛋白肉的持水能力[23]。水分添加量由12.0 kg/h增加至12.5 kg/h 時(shí)，植物蛋白肉的持水性和持油性均呈下降趨勢(shì)，這可能是由于過量的水分阻礙了蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，導(dǎo)致形成了較弱的凝膠網(wǎng)絡(luò)[24]，從而造成植物蛋白肉持水性和持油性的下降?？梢钥闯觯m當(dāng)提高水分添加量有利于增強(qiáng)植物蛋白肉的持水和持油能力。

圖1 水分添加量對(duì)植物蛋白肉持水性、持油性的影響Fig.1 Effects of water addition on water absorption capacity,oil absorption capacity of plant protein meat

2.4 水分添加量對(duì)植物蛋白肉熱特性的影響

水分添加量對(duì)植物蛋白肉熱特性的影響如表2所示，由于豆粕中大豆蛋白11S 亞基的熱轉(zhuǎn)變焓值明顯高于7S 亞基，其熱轉(zhuǎn)變峰更明顯，因此，在本研究中，植物蛋白肉的熱特性變化僅以11S 亞基為代表進(jìn)行分析[18]。當(dāng)水分添加量由10.5 kg/h 增加到11.0 kg/h 時(shí)，植物蛋白肉發(fā)生熱轉(zhuǎn)變的起始溫度（To）和峰值溫度（Tp）均呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，而峰寬（ΔT）和熱轉(zhuǎn)變焓值（ΔH）卻出現(xiàn)明顯下降，這可能與水分含量的突然增大有關(guān)。物料水分含量的突然增大會(huì)使蛋白分子結(jié)構(gòu)變得靈活[25]，分子結(jié)構(gòu)更易于被打開[26]，從而降低了植物蛋白肉的熱穩(wěn)定性。當(dāng)水分添加量由11.0 kg/h 繼續(xù)升高到12.5 kg/h 時(shí)，植物蛋白肉發(fā)生熱轉(zhuǎn)變的起始溫度（To）和峰值溫度（Tp）隨之逐漸下降，但峰寬（ΔT）和熱轉(zhuǎn)變焓值（ΔH）卻逐漸升高，To和Tp分別從78.84 和101.21 ℃降低至67.23和96.31 ℃，ΔT 和ΔH 分別從34.15 ℃和26.75 J/g升高至58.71 ℃和57.88 J/g，這表明水分含量進(jìn)一步的升高加快了植物蛋白肉中大豆蛋白的熱轉(zhuǎn)變速率。而植物蛋白肉中大豆蛋白的熱焓值△H 顯著增大，說明其分子結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)固，打開其分子結(jié)構(gòu)所需要的能量明顯增加。

表2 水分添加量對(duì)植物蛋白肉熱特性的影響Table 2 Effect of water addition on thermal properties of plant protein meat

2.5 水分添加量對(duì)植物蛋白肉相對(duì)分子量的影響

豆粕中的大豆蛋白主要組分包括7S 亞基（分子量分別為78.41、73.00、54.05 kDa）和11S 亞基（分子量分別為42.18、37.62、34.03、31.58、22.05、19.02 kDa）[18]。從圖2 的SDS-PAGE 電泳結(jié)果中可以看出，隨著擠壓過程中水分添加量的升高，植物蛋白肉樣品中的7S/11S 球蛋白比例也發(fā)生了顯著的變化。當(dāng)水分添加量為10.5 kg/h 時(shí)，植物蛋白肉樣品電泳條帶中亞基的顏色與條帶頂端顏色均很淺。隨著水分添加量的進(jìn)一步增加，7S 中的α′亞基（78.41 kDa）、α亞基（73.00 kDa）、β亞基（54.05 kDa）以及11S 中的A 組分（42.18 kDa）和B 組分（22.05 kDa）的亞基條帶逐漸變寬，并且亞基條帶顏色以及擠出樣品條帶頂端的顏色逐漸變深，這可能是因?yàn)殡S著水分添加量的增加，豆粕中的大豆蛋白經(jīng)擠壓蒸煮后發(fā)生聚合、交聯(lián)等變性反應(yīng)的程度增強(qiáng)，形成了分子量較大的聚合物[27]。然而，當(dāng)水分添加量由12 kg/h 增加到12.5 kg/h 時(shí)，植物蛋白肉樣品條帶頂端的顏色略微變淺，這可能是因?yàn)樾纬傻妮^大分子量的聚合物可以透過濃縮膠，但卻不能透過分離膠的網(wǎng)絡(luò)孔隙，因此在條帶的頂端發(fā)生了聚集[28]?？梢钥闯觯m當(dāng)提高水分添加量有利于提高蛋白質(zhì)聚合交聯(lián)變性的程度。

圖2 水分添加量對(duì)植物蛋白肉相對(duì)分子量的影響Fig.2 Effect of water addition on relative molecular weight of plant protein meat

2.6 水分添加量對(duì)植物蛋白肉微觀形貌的影響

掃描電子顯微鏡觀察植物蛋白肉的形態(tài)如圖3所示。在擠壓過程中，由于豆粕中含有的纖維成分與蛋白質(zhì)流動(dòng)性能不同，在高溫、高剪切條件下兩者發(fā)生相分離，從而在冷卻裝置中逐漸形成具有拉絲效果的纖維結(jié)構(gòu)[29]。當(dāng)水分添加量為10.5 kg/h 時(shí)，植物蛋白肉拉絲效果并不明顯，所形成的纖維結(jié)構(gòu)內(nèi)部孔洞較大，出現(xiàn)了明顯分層的現(xiàn)象，這主要是因?yàn)樵谙鄬?duì)較低的水分含量下，植物蛋白肉在冷卻模具中受到較高摩擦力和剪切力所導(dǎo)致[30]。隨著水分添加量增加至11.5 kg/h 時(shí)，植物蛋白肉表面形成了更加致密的纖維細(xì)絲結(jié)構(gòu)，組織蛋白層狀結(jié)構(gòu)清晰且整齊，具有精細(xì)的定向結(jié)構(gòu)，這主要是由于合適的水分含量促進(jìn)疏水基團(tuán)暴露[31]，加速了蛋白質(zhì)的變性[32]，使豆粕中的蛋白質(zhì)分子由最初的無序多孔結(jié)構(gòu)變?yōu)榻Y(jié)構(gòu)致密且具有一定規(guī)則的晶型排列結(jié)構(gòu)，這有利于三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，從而使植物蛋白肉形成更多具有類似于肉類纖維的條狀纖維結(jié)構(gòu)。然而隨著水分添加量繼續(xù)升高至12.5 kg/h 時(shí)，植物蛋白肉形成了更多層狀而非纖維狀的結(jié)構(gòu)且疏松多孔，這主要是因?yàn)殡S著水分添加量的升高，機(jī)筒的高溫導(dǎo)致更多的水蒸汽產(chǎn)生，蛋白質(zhì)形成了更多的膜狀氣孔結(jié)構(gòu)[9]，這加劇了蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水基團(tuán)的暴露和蛋白質(zhì)交聯(lián)變性程度的增大，造成產(chǎn)品氣孔結(jié)構(gòu)更加明顯。此外，過量的水分促使豆粕中更多的糖類物質(zhì)溶于水中，加劇了蛋白質(zhì)的溶脹程度[28]，使得蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用減弱，產(chǎn)生了不相容的聚合物網(wǎng)絡(luò)[33]，從而導(dǎo)致植物蛋白肉形成了更多分離的層狀結(jié)構(gòu)。

2.7 水分添加量對(duì)植物蛋白肉化學(xué)交聯(lián)作用力的影響

水分添加量對(duì)植物蛋白肉化學(xué)交聯(lián)作用力的影響如表3 所示，植物蛋白肉的結(jié)構(gòu)是由疏水作用、氫鍵、二硫鍵以及彼此之間的交互作用共同維持的。從表3 可以看出，隨著水分添加量的增加，植物蛋白肉中的氫鍵數(shù)量和疏水作用均隨之升高，這表明提高水分含量能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)與水混合，從而形成更多的氫鍵[16]。當(dāng)水分添加量由10.5 kg/h 增加到11 kg/h時(shí)，植物蛋白肉中二硫鍵顯著地增加（P<0.05），而當(dāng)水分添加量進(jìn)一步增加時(shí)二硫鍵數(shù)量則無顯著變化。Sheard 等[34]認(rèn)為當(dāng)物料水分含量較高時(shí)，疏水作用是維持蛋白聚集的主要作用力；而隨著水分含量的降低，二硫鍵逐漸形成并成為穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的主要作用力。此外，當(dāng)水分添加量由10.5 kg/h 增加到12.5 kg/h時(shí)，氫鍵、疏水相互作用、二硫鍵三者交叉作用呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，且在水分添加量為11.5 kg/h時(shí)，氫鍵、疏水相互作用、二硫鍵三者交叉作用達(dá)到最強(qiáng)，由此可知，適當(dāng)?shù)靥岣咚痔砑恿坑欣诘鞍踪|(zhì)變性，對(duì)氫鍵、疏水相互作用、二硫鍵三者交互作用具有促進(jìn)作用。

表3 水分添加量對(duì)植物蛋白肉化學(xué)交聯(lián)變化的影響Table 3 Effect of water addition on the chemical cross-linking force of plant protein meat

綜合上述結(jié)果可知，植物蛋白肉的結(jié)構(gòu)由共價(jià)鍵與非共價(jià)鍵的交互作用共同維持。在所考察的水分添加量范圍內(nèi)，共價(jià)鍵與非共價(jià)鍵的交互作用對(duì)維持植物蛋白肉結(jié)構(gòu)的貢獻(xiàn)最大，非共價(jià)鍵作用和共價(jià)鍵作用次之，并且非共價(jià)鍵作用大于共價(jià)鍵作用，這與張金闖[14]的研究結(jié)果一致。

2.8 水分添加量對(duì)植物蛋白肉二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

水分添加量對(duì)植物蛋白肉紅外光譜圖的影響如圖4a 所示。在3700～3100 cm-1內(nèi)，5 種水分添加量的植物蛋白肉均出現(xiàn)較寬的特征條帶，這主要由O-H、N-H 伸縮振動(dòng)和氫鍵伸縮振動(dòng)引起的，在3000～2700 cm-1處出現(xiàn)的尖銳吸收峰，這歸因于C-H 收縮振動(dòng)[35]。植物蛋白肉在2500～2300 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰主要與O=C=O 和R-N=C=O 伸縮振動(dòng)有關(guān)[36]，此處吸收峰強(qiáng)度隨著水分含量的增加先增強(qiáng)后減弱，并且在水分添加量為11.0 kg/h 時(shí)達(dá)到最強(qiáng)，這表明植物蛋白肉的穩(wěn)定性隨著水分添加量的升高呈先升高后降低的趨勢(shì)，這與前面熱特性分析結(jié)果一致。而在1500～1700 cm-1處的吸收峰與美拉德反應(yīng)產(chǎn)物如羰基化合物、希夫堿和吡嗪類相關(guān)的C=O、C=N 和C-N 伸縮振動(dòng)有關(guān)[37]，吸收峰強(qiáng)度均隨著水分含量增加而減弱，表明擠壓過程中水分含量對(duì)美拉德反應(yīng)的發(fā)生程度具有一定影響。

圖4 水分添加量對(duì)植物蛋白肉二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effect of water addition on the secondary structure of plant protein meat

由圖4a 可知，隨著水分添加量的變化并未有新峰出現(xiàn)，但結(jié)合傅里葉自卷積、二階導(dǎo)數(shù)和高斯曲線擬合（圖4b～圖4f），通過定量分析頻譜的二階導(dǎo)數(shù)發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)隨著水分添加量的增加發(fā)生顯著變化。根據(jù)文獻(xiàn)[16]報(bào)道可知，α螺旋由分子內(nèi)氫鍵維持，位于1646～1662 cm-1；β轉(zhuǎn)角為松散有序結(jié)構(gòu)，位于1662～1681 cm-1；無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)由C=O和H2O 之間形成的氫鍵維持，位于1637～1645 cm-1；β1 為反向平行式折疊的β層狀結(jié)構(gòu)，由分子間氫鍵維持，位于1608～1622 和1682～1700 cm-1。β2 為平行式折疊的β層狀結(jié)構(gòu)，由分子內(nèi)的氫鍵維持，位于1622～1639 cm-1。

水分添加量對(duì)植物蛋白肉二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響如表4 所示。由表4 與圖4b～圖4f 可知，隨著水分添加量的增加，植物蛋白肉的二級(jí)結(jié)構(gòu)分別出現(xiàn)在不同位置，并且具有不同峰面積。β折疊為植物蛋白肉二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要作用力，其中α螺旋與β2 所占含量高于β1，表明分子內(nèi)氫鍵作用力更強(qiáng)，這與Guo 等[16]研究的結(jié)果一致。隨著水分添加量由10.5 kg/h 增加到11.5 kg/h 時(shí)，β1、β2 與α螺旋含量均呈降低趨勢(shì)，這表明植物蛋白肉中維持β1、β2 與α螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵作用力減弱，這可能與水分含量的突然增大有關(guān)。結(jié)合DSC 與化學(xué)交聯(lián)結(jié)果可知，物料水分添加量的突然增加會(huì)使蛋白分子結(jié)構(gòu)變得靈活，其分子結(jié)構(gòu)更易于被打開[26]，從而使植物蛋白肉的熱穩(wěn)定性降低。此外，當(dāng)水分添加量由10.5 kg/h 增加到11.5 kg/h時(shí)，β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲分別呈現(xiàn)出先升高后降低與先降低后升高趨勢(shì)，這表明在適當(dāng)?shù)臄D壓水分條件下，分子二級(jí)結(jié)構(gòu)中松散有序結(jié)構(gòu)逐漸增加，這有利于β折疊、α螺旋、無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)向β轉(zhuǎn)角的轉(zhuǎn)化。當(dāng)繼續(xù)增大水分含量時(shí)，加劇了蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水基團(tuán)的暴露和蛋白質(zhì)交聯(lián)變性程度的增大，蛋白質(zhì)形成了更多的膜狀氣孔結(jié)構(gòu)，這與掃描電鏡觀察到的結(jié)果一致。

表4 水分添加量對(duì)植物蛋白肉二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Table 4 Effect of water addition on the secondary structure of plant protein meat

2.9 植物蛋白素肉的相關(guān)性分析

對(duì)不同水分添加量植物蛋白肉的質(zhì)構(gòu)特性、色差、二級(jí)結(jié)構(gòu)、變性熱焓、化學(xué)交聯(lián)鍵進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如圖5 和表5 所示。從圖5 可知，12.5 和12.0 kg/h 水分添加量與10.5、11.0、11.5 kg/h 水分添加量方向不同，并且11.5 kg/h 水分添加量與其他4 組所在象限均不同，表明水分含量對(duì)植物蛋白肉作用效果顯著。同時(shí)從載荷可以看出，硬度與咀嚼度這兩個(gè)特性彼此接近，表明它們之間存在正相關(guān)關(guān)系。此外，二硫鍵所處正交方向，表明其獨(dú)立變化，對(duì)其他性能沒有影響。由表5 可知硬度、咀嚼度、彈性指數(shù)與氫鍵、疏水相互作用、二硫鍵和疏水相互作用均呈負(fù)相關(guān)，而咀嚼度、彈性指數(shù)與α螺旋含量呈正相關(guān)。P<0.01 時(shí)，L*與β轉(zhuǎn)角含量呈正相關(guān)，L*與氫鍵+二硫鍵呈負(fù)相關(guān)且皮爾遜系數(shù)最大。P<0.01 時(shí)，持水性與β1 呈負(fù)相關(guān)，P<0.05 時(shí),持水性與β轉(zhuǎn)角和氫鍵+二硫鍵+疏水相互作用呈正相關(guān)。持油性在P<0.01 時(shí)與疏水相互作用呈正相關(guān)且皮爾遜系數(shù)最大為0.743。

表5 植物蛋白肉的相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis of soybean meal simulated meat

圖5 植物蛋白肉的相關(guān)性分析載荷圖、分值圖及雙標(biāo)圖Fig.5 Loading plot and scora plot and biplot correlation analysis of soybean meal simulated meat

綜上所述，植物蛋白肉質(zhì)構(gòu)特性主要是化學(xué)交聯(lián)力中的氫鍵、二硫鍵、氫鍵+疏水相互作用及二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋共同作用的結(jié)果。二級(jí)結(jié)構(gòu)中β1、β2 和β轉(zhuǎn)角的變化對(duì)植物蛋白肉的亮度影響顯著。此外植物蛋白肉持水性是β1、β轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲、氫鍵+二硫鍵+疏水相互作用的結(jié)果，而持油性變化主要受疏水相互作用影響。

3 結(jié)論

本文以低溫脫脂大豆粕為原料，探究了水分添加量對(duì)高水分?jǐn)D壓植物蛋白肉理化性質(zhì)和微觀結(jié)構(gòu)的調(diào)控作用。研究結(jié)果表明，水分添加量作為擠壓過程中的重要參數(shù)對(duì)植物蛋白肉的品質(zhì)特性影響效果顯著，隨著擠壓過程中水分添加量的增加，植物蛋白肉的硬度、彈性、咀嚼性均顯著下降，而亮度值、持水性和持油性均呈先升高后降低趨勢(shì)。水分添加量在11.5 kg/h 時(shí)，植物蛋白肉具有較好的品質(zhì)特性與纖維結(jié)構(gòu)。適當(dāng)提高水分添加量有利于α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)向β-轉(zhuǎn)角的轉(zhuǎn)化，同時(shí)促進(jìn)共價(jià)鍵與非共價(jià)鍵的交互作用，對(duì)植物蛋白肉松散有序結(jié)構(gòu)的增加，形成具有一定規(guī)則的晶型排列結(jié)構(gòu)具有促進(jìn)作用。高水分?jǐn)D壓植物肉具有更接近于動(dòng)物肉的纖維結(jié)構(gòu)和質(zhì)構(gòu)等特性，對(duì)其開發(fā)在減少全球碳排放、滿足民眾日益增加的肉類需求、減少動(dòng)物性食品的消費(fèi)以及確保中國(guó)和世界食物供給安全等方面具有重要意義。