黃瑩，張娟，竇勇*，原雪峰，翟勝利，曲木，周文禮

（1.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)試驗(yàn)室，天津 300384；2.天津現(xiàn)代天驕農(nóng)業(yè)科技股份有限公司，天津市綠色生態(tài)飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301801；3.天津現(xiàn)代晨輝科技集團(tuán)，天津 301802）

雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）是一種淡水單細(xì)胞藻類，隸屬于綠藻門、綠藻綱、團(tuán)藻目、紅球藻科、紅球藻屬，普遍分布于自然界的淡水生境中[1]。在外界環(huán)境條件適宜時，微藻以游動狀態(tài)存在，此時細(xì)胞呈卵圓形或橢圓形，依靠兩條頂生、等長的鞭毛運(yùn)動，這一階段的細(xì)胞大多呈綠色，營養(yǎng)生長旺盛，生物量積累迅速。在受到環(huán)境脅迫時，雨生紅球藻細(xì)胞以紅色厚壁孢子形式存在，細(xì)胞鞭毛脫落，運(yùn)動能力喪失，微藻細(xì)胞逐漸合成并積累蝦青素，此階段藻細(xì)胞內(nèi)積累大量蝦青素，雨生紅球藻細(xì)胞內(nèi)的蝦青素含量可以占到細(xì)胞干重的1.5%～4.0%[2-3]，而且全部是高生物活性的3S、3S＇形態(tài)，因此，雨生紅球藻被公認(rèn)為自然界中生產(chǎn)天然蝦青素的最佳“生物反應(yīng)器”。蝦青素是一種脂溶性的次級類胡蘿卜素，屬于菇烯類的不飽和化合物，蝦青素是目前為止在自然界有機(jī)體中發(fā)現(xiàn)的抗氧化能力最強(qiáng)的物質(zhì)[4]，其清除自由基和單線態(tài)氧淬滅的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于維生素E，比玉米黃質(zhì)、番茄紅素及β-胡蘿卜素等常見抗氧化物質(zhì)的抗氧化能力也要高10 倍以上。因其具有清除自由基、提高機(jī)體免疫力的作用，目前多被用作保健品輔料和食品添加劑[5-7]。蝦青素的功能不僅如此，其還有良好的著色效果，可以進(jìn)入生物體并貯存在組織中，例如農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2003 年318 號公告中指定天然蝦青素為水產(chǎn)動物唯一著色劑[8-9]。雨生紅球藻不動孢子內(nèi)積累大量蝦青素，且均為具有高生物活性的3S、3S＇異構(gòu)體，目前被公認(rèn)為自然界中生產(chǎn)天然蝦青素的最佳生物[10]。

然而自然條件下雨生紅球藻合成蝦青素的效率和對底物、能源的利用率都很低，基本無法支撐蝦青素的工業(yè)化生產(chǎn)，因此使用外源化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行人工誘導(dǎo)成為提高雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素能力的常用方法[11-17]。3-羥基丁酸（3-hydroxybutyric acid，3-HB）通常被認(rèn)為是生物體內(nèi)關(guān)鍵的能量代謝中間產(chǎn)物之一[18]，它是分子量較小的高分子有機(jī)化合物，具有光學(xué)活性，純態(tài)時可結(jié)晶，羥基基團(tuán)能締合，易溶于水、乙醇、乙醚、干蒸易分解等特點(diǎn)。目前，已有研究證實(shí)3-羥基丁酸具有一系列重要的生理活性，例如可以促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞生長，增強(qiáng)顆粒細(xì)胞和半顆粒細(xì)胞的體外吞噬作用，提高血細(xì)胞內(nèi)溶菌（lysozyme，LZM）和血清酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）的活性[19]，除此外在臨床醫(yī)療領(lǐng)域，3-羥基丁酸及其聚合物已被用來治療出血性休克等多種疾病[20]。雖然3-羥基丁酸具備許多生理功能且具有重要的臨床醫(yī)療價值，但是在誘導(dǎo)微藻積累次級代謝產(chǎn)物方面尚未得到應(yīng)用，因此利用3-羥基丁酸研究雨生紅球藻是一個創(chuàng)新性的試驗(yàn)，通過研究它對雨生紅球藻生長和蝦青素積累的影響可以更進(jìn)一步地尋找雨生紅球藻更優(yōu)的培養(yǎng)條件。本研究主要探索3-羥基丁酸對雨生紅球藻光系統(tǒng)Ⅱ（pthotosystem Ⅱ，PSⅡ） 光化學(xué)活性與色素合成的影響，以期為藻源蝦青素的生產(chǎn)提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雨生紅球藻（H.pluvialis）：天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)試驗(yàn)室；3-羥基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品（3CAS 300-85-6，純度≥98%）：美國Sigma-Aldrich 公司；BBM 培養(yǎng)基配方試劑（均為分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

調(diào)制脈沖熒光儀（IMAGING-PAM）：德國WALZ有限公司；紫外-可見分光光度計（TU-1810）：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；超聲波細(xì)胞破碎儀（JY92-Ⅱ）：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計

以BBM 培養(yǎng)基對H.pluvialis 進(jìn)行培養(yǎng)（配方見表1），設(shè)置光照強(qiáng)度為55 μmol/（m2·s），光暗比為12 h：12 h，培養(yǎng)溫度為（22±1）℃。每天搖動培養(yǎng)瓶6 次，防止細(xì)胞附壁或下沉。

表1 BBM 培養(yǎng)基配方Table 1 BBM medium formula

將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的H.pluvialis 接種到250 mL三角瓶中，各試驗(yàn)組微藻初始密度均為5×105cells/mL，培養(yǎng)體系體積控制在150 mL。試驗(yàn)設(shè)置的3-羥基丁酸濃度分別為0、0.01、0.02、0.05、0.10 μg/L，每個試驗(yàn)組均設(shè)置3 次平行。試驗(yàn)周期為30 d，每3 d 取樣分析1 次。

1.3.2 H.pluvialis PSⅡ光化學(xué)活性測定

使用調(diào)制脈沖熒光儀測定PSⅡ光化學(xué)活性。向比色杯中依次加入3 mL 雙蒸水和15 μL 藻液，混勻，將樣品暗適應(yīng)15 min，讀取最大光能轉(zhuǎn)化效率（Fv/Fm）、有效光能轉(zhuǎn)化效率（Yield）和表觀電子傳遞速率（electron transfer rate，ETR）的數(shù)值。

1.3.3 H.pluvialis 葉綠素a 含量測定

吸取2 mL 藻液置于離心管中，4 ℃下以12 000 r/min離心5 min，用移液槍吸去上清液，加入80%丙酮對藻泥進(jìn)行再懸浮，然后用錫箔完全包裹離心管，在暗處置于55 ℃水浴中30 min，再于4 ℃下以12 000 r/min 離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至10 mL 離心管中，并用80%丙酮定容至5 mL，使用紫外-可見分光光度計測定663 nm 處吸光值（A663），然后根據(jù)下列公式計算葉綠素a 含量（Y，mg/L）[21]。

1.3.4 H.pluvialis 蝦青素含量測定

取5 mL 藻液進(jìn)行離心，去上清液，向沉淀加入5 mL雙蒸水，重復(fù)此過程2 次。加入5% KOH+30%甲醇混合液去除葉綠素。再次離心后加入5 滴乙酸降低pH值，收集藻泥后加入2 mL 丙酮，用細(xì)胞破碎儀處理10 min，然后用二甲基亞砜抽提至藻團(tuán)呈白色。用紫外可見分光光度計測定抽提液在490 nm 下的吸光度A490[22]。蝦青素含量（X，mg/L）參照如下公式計算。

X=4.5×A490×VA×VB

式中：VA為二甲基亞砜體積，mL；VB為藻液體積，mL。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

各試驗(yàn)組數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，并且采用Duncan 方法進(jìn)行多重比較，顯著性水平P=0.05。

不對稱條件下的儲能虛擬同步發(fā)電機(jī)低電壓穿越控制技術(shù)//何安然,侯凱,王小紅,蔣應(yīng)偉,劉建平,盧方舟//(10):122

2 結(jié)果與分析

2.1 3-羥基丁酸對H.pluvialis PSⅡ光化學(xué)活性的影響

2.1.1 3-羥基丁酸對H.pluvialis Fv/Fm的影響

3-羥基丁酸對H.pluvialis 最大光能轉(zhuǎn)化效率的影響如圖1 所示。

圖1 3-羥基丁酸對H.pluvialis Fv/Fm 的影響Fig.1 Effect of 3-hydroxybutyric acid on Fv/Fm in H.pluvialis

Fv/Fm為最大光能轉(zhuǎn)化效率，反映了植物PS II 的潛在最大光合能力，環(huán)境條件改變時微藻Fv/Fm會發(fā)生顯著變化。整體來看，3-羥基丁酸處理組的雨生紅球藻Fv/Fm從試驗(yàn)開始至第18 天有緩慢下降趨勢，此后有一定程度上升，說明雨生紅球藻的PS II 反應(yīng)中心經(jīng)過一段時間后對3-羥基丁酸產(chǎn)生了一定的抗性，然而隨著時間的延長藻受到的損害更加嚴(yán)重，從第21 天開始Fv/Fm值又呈現(xiàn)逐漸下降趨勢。試驗(yàn)期間，濃度分別為0.01、0.02、0.05、0.10 μg/L 的雨生紅球藻Fv/Fm較初始狀態(tài)分別降低了9.7%、13.6%、13.6%、25.7%，在大多數(shù)時間，3-羥基丁酸處理組的微藻Fv/Fm均顯著低于對照組的微藻Fv/Fm（P＜0.05）。結(jié)果表明在缺氮條件下3-羥基丁酸處理組對雨生紅球藻加強(qiáng)了脅迫作用，并且在0.01 μg/L 的處理組時Fv/Fm值下降幅度最大。

2.1.2 3-羥基丁酸對H.pluvialis 實(shí)際光化學(xué)量子產(chǎn)量的影響

3-羥基丁酸對H.pluvialis 實(shí)際光能轉(zhuǎn)化效率的影響如圖2 所示。

圖2 3-羥基丁酸對H.pluvialis 實(shí)際光化學(xué)量子產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of 3-hydroxybutyric acid on Yield in H.pluvialis

Yeild 為實(shí)際光能轉(zhuǎn)化效率，反映植物PS II 在部分關(guān)閉情況下的實(shí)際原初光能捕獲效率。由圖2 可知，3-羥基丁酸處理組的Yield 參數(shù)在3 d 時，除0.02 μg/L組外，其他各3-羥基丁酸處理組的Yield 參數(shù)顯著低于對照組的參數(shù)（P＜0.05）；在6、9、21、24 d 時，0.10 μg/L 組的Yield 參數(shù)均低于對照組（P＜0.05）；在18 d 時，各處理組的Yield 參數(shù)均顯著低于對照組（P＜0.05）。至試驗(yàn)第27 天時，0.02 μg/L 和0.10 μg/L 濃度組的雨生紅球藻Yield 參數(shù)下降幅度最明顯，相比較初始階段分別降低了25%和16%，而其他濃度組的微藻Yield 數(shù)值下降幅度均未超過10%。說明3-羥基丁酸降低了雨生紅球藻PSⅡ的實(shí)際光合能力。

2.1.3 3-羥基丁酸對H.pluvialis 光合電子傳遞速率的影響

圖3 3-羥基丁酸對H.pluvialis ETR 的影響Fig.3 The effect of 3-hydroxybutyric acid on ETR in H.pluvialis

表觀光合電子傳遞速率（electrontransportrate，ETR）是反映植物PS II 反應(yīng)中心活性與光合電子傳遞效率強(qiáng)弱的一個重要指標(biāo)，其數(shù)值影響因素較多，主要與光強(qiáng)、植物吸收入射光和能量分布比例以及光子通量密度有關(guān)。由圖3 可知，3-羥基丁酸處理組的雨生紅球藻ETR 參數(shù)在第3 天時，除0.02 μg/L 組外，其余各處理組的雨生紅球藻ETR 均顯著低于對照組（P＜0.05）；在6、9 d 時，0.01μg/L 組和0.10 μg/L 組雨生紅球藻ETR 低于對照組；在24、27 d 時，0.1 μg/L 組的雨生紅球藻ETR顯著低于對照組；在第30天各3-羥基丁酸處理組的雨生紅球藻ETR 顯著低于對照組的ETR 參數(shù)值（P＜0.05），說明3-羥基丁酸降低了雨生紅球藻PSⅡ的實(shí)際光和能力。直至試驗(yàn)結(jié)束時，0.02 μg/L 組和0.10 μg/L 組的雨生紅球藻ETR 參數(shù)下降幅度最大，分別較初始階段降低了12.5%和32.9%，說明0.02 μg/L 和0.10 μg/L 濃度的3-羥基丁酸對于降低光合電子傳遞效率更加明顯。

2.2 3-羥基丁酸對H.pluvialis 色素合成的影響

3-羥基丁酸處理?xiàng)l件下，微藻資源在光合作用與抗逆合成之間權(quán)衡分配的情況，通過構(gòu)建雨生紅球藻細(xì)胞內(nèi)蝦青素與葉綠素a 含量比值這一指標(biāo)來反映，如圖4 所示。

圖4 3-羥基丁酸對H.pluvialis 蝦青素與葉綠素a 含量比值的影響Fig.4 Effect of 3-hydroxybutyric acid on the content ratio of astaxanthin to chlorophyll a in H.pluvialis

試驗(yàn)期間，雨生紅球藻的蝦青素與葉綠素a 含量的比值呈現(xiàn)波動變化，其中在第6、12、27 天出現(xiàn)極大值，在第9 天和第21 天出現(xiàn)極小值，從第27 天后又開始呈逐漸降低的趨勢。3-羥基丁酸處理對雨生紅球藻蝦青素與葉綠素a 含量比值的影響明顯高于對照組的含量比值，其中6、12、15、18、24、27、30 d 時，0.01 μg/L 組的數(shù)值顯著高于其他濃度組（P＜0.05），這與Ding 等[23]使用叔丁基羥基茴香醚作為誘導(dǎo)物的結(jié)果相類似。試驗(yàn)結(jié)果說明3-羥基丁酸影響了雨生紅球藻自身資源在光合作用與抗逆合成之間的權(quán)衡分配，而低濃度的影響作用更強(qiáng)。

2.2.1 3-羥基丁酸對H.pluvialis 葉綠素a 合成的影響

隨著試驗(yàn)逐步進(jìn)行，不同濃度的3-羥基丁酸對雨生紅球藻進(jìn)行脅迫處理，雨生紅球藻細(xì)胞內(nèi)的葉綠素a 含量呈波動變化趨勢如圖5 所示。

圖5 3-羥基丁酸對H.pluvialis 葉綠素a 合成的影響Fig.5 Effect of 3-hydroxybutyric acid on chlorophyll a synthesis in H.pluvialis

從圖5 中可以看出，隨著試驗(yàn)時間的不斷延長，雨生紅球藻合成葉綠素a 含量變化呈不規(guī)律情況。微藻細(xì)胞內(nèi)的葉綠素a 含量在試驗(yàn)3、9、21 d 出現(xiàn)極大值，在6 d 和12 d 出現(xiàn)極小值，從21 d 開始又逐漸降低。試驗(yàn)期間，雨生紅球藻中的葉綠素a 含量最高超過0.6 mg/L（21 d）。

2.2.2 3-羥基丁酸對H.pluvialis 蝦青素合成的影響

3-羥基丁酸對H.pluvialis 蝦青素合成的影響如圖6 所示。

圖6 3-羥基丁酸對H.pluvialis 蝦青素合成的影響Fig.6 Effect of 3-hydroxybutyric acid on astaxanthin synthesis in H.pluvialis

從圖6 中可以看出隨著試驗(yàn)時間的延長，雨生紅球累積蝦青素含量逐漸緩慢呈現(xiàn)上升趨勢，從試驗(yàn)開始至第24 天各試驗(yàn)組的蝦青素水平呈緩慢上升趨勢，從第24 天開始藻細(xì)胞蝦青素含量積累出現(xiàn)大幅快速增長，且在第27 天蝦青素含量的積累達(dá)到了最高峰，此時0.01 μg/L 組的蝦青素含量最高達(dá)到7.57 mg/L，是對照組的1.67 倍，由此可知，3-羥基丁酸對微藻的生長雖然沒有促進(jìn)作用。此后各試驗(yàn)組的蝦青素水平出現(xiàn)迅速回落。

3 討論

3.1 3-羥基丁酸對H.pluvialis PSⅡ光化學(xué)活性的影響

葉綠素a 是微藻光合作用時需要的主要色素，是綠色葉片進(jìn)行光合作用時捕獲光能的重要物質(zhì)，其含量的高低在一定程度上反映了微藻光合能力的強(qiáng)弱[24]。當(dāng)微藻受到環(huán)境脅迫時，光合作用同時受到抑制，導(dǎo)致光合效率降低，藻細(xì)胞吸收的部分光能通過熱量和熒光形式散發(fā)出來，因此通過測定葉綠素?zé)晒鈪?shù)可以了解微藻光合機(jī)構(gòu)受脅迫而損傷的程度[25]。并且有研究證實(shí)，環(huán)境脅迫會使藻類的PSⅡ反應(yīng)中心的受損，降低PSⅡ反應(yīng)中心活性、電子傳遞效率和光能的轉(zhuǎn)化效率。在本研究中，通過用3-羥基丁酸處理，結(jié)果造成雨生紅球藻細(xì)胞PSⅡ光化學(xué)參數(shù)Fv/Fm、Yield 和ETR 均出現(xiàn)不同程度降低，說明3-羥基丁酸是雨生紅球藻生長的脅迫因子，而試驗(yàn)中Yield 和ETR 之間的變化趨勢更為接近，發(fā)現(xiàn)它們之間具有較強(qiáng)相關(guān)的聯(lián)系。

3.2 3-羥基丁酸對H.pluvialis 色素合成的影響

本研究主要考察了雨生紅球藻細(xì)胞內(nèi)的葉綠素a 和蝦青素的含量變化，葉綠素a 含量反映微藻的光合能力，蝦青素含量反映微藻的抗逆水平。在本試驗(yàn)中雨生紅球藻細(xì)胞內(nèi)的葉綠素a 含量隨時間延長呈波動變化趨勢，而3-羥基丁酸加劇了這種變化波動，這可能是微藻的光合機(jī)構(gòu)在脅迫抑制和損傷修復(fù)共同作用下的結(jié)果。在試驗(yàn)后期（27～30 d）雨生紅球藻的葉綠素a 含量出現(xiàn)極小值，說明3-羥基丁酸對微藻的脅迫超出了其修復(fù)作用的限度，這也得到了微藻3 種PSⅡ光化學(xué)參數(shù)均出現(xiàn)不同程度降低現(xiàn)象的同步印證。本研究結(jié)果表明，雖然3-羥基丁酸對雨生紅球藻的光合能力造成抑制，卻能夠提高微藻合成與積累蝦青素的能力，這與岳陳陳等[26]使用褪黑素作為誘導(dǎo)物的研究結(jié)果類似。此外，本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)較低濃度（0.01 μg/L） 的3-羥基丁酸有利于雨生紅球藻合成蝦青素，但當(dāng)濃度較高時蝦青素的積累反而受到抑制，此現(xiàn)象說明0.01 μg/L 適合作為3-羥基丁酸誘導(dǎo)雨生紅球藻積累蝦青素的使用濃度，而高濃度3-羥基丁酸對雨生紅球藻施加的脅迫可能已經(jīng)超出了其抗逆能力的限度。3-羥基丁酸對雨生紅球藻具有雙重作用，不僅具有抑制葉綠素a 合成的作用，還具有促進(jìn)蝦青素積累的作用。因此，雨生紅球藻的生長和蝦青素的積累與其所處的環(huán)境脅迫有著密切關(guān)系，由于雨生紅球藻在逆境條件下積累蝦青素的自我保護(hù)機(jī)制，所以適宜脅迫條件下會增加雨生紅球藻積累蝦青素的含量。

4 結(jié)論

3-羥基丁酸對雨生紅球藻PSⅡ光反應(yīng)中心造成了脅迫損傷，在脅迫條件下雨生紅球藻的光合結(jié)構(gòu)和功能都受到了一定的傷害。微藻細(xì)胞PSⅡ光化學(xué)參數(shù)Fv/Fm、Yield 和ETR 均出現(xiàn)不同程度降低，其中0.02、0.10 μg/L 組的作用最明顯，降低的數(shù)值顯著高于其他組，并且通過蝦青素與葉綠素比值的分析同樣證明0.01 μg/L 濃度對雨生紅球藻積累蝦青素為最好的濃度。3-羥基丁酸造成雨生紅球藻葉綠素a 含量波動變化并最終下降至較低水平；3-羥基丁酸能夠促進(jìn)雨生紅球藻合成并積累蝦青素，其中3-羥基丁酸的濃度為0.01 μg/L 時，雨生紅球藻積累蝦青素效果優(yōu)于其他組，在到達(dá)積累峰值時最高積累量為7.57 mg/L，是對照組的1.67 倍。3-羥基丁酸會對雨生紅球藻的光合作用產(chǎn)生影響，同時會干涉雨生紅球藻自身資源在光合作用與抗逆合成之間的權(quán)衡分配。