李芬,古麗比亞·艾則孜,苑錦睿,亞力坤·穆罕穆德,溫蒙科,沈谷群

新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院婦外二科 烏魯木齊市,830011

宮頸癌是女性第四大常見癌癥,也是世界上最常見的癌癥之一[1]。初級手術加放射治療是早期宮頸癌的主要治療方法,對于晚期轉移性宮頸癌,目前尚無有效的治療策略,宮頸癌在女性癌癥相關死亡中仍占很大比例[2]。因此,深入研究宮頸癌發(fā)生發(fā)展的分子機制仍然是當務之急,尤其是探索早期診斷和治療的新方法。最近,轉錄組學研究表明,大多數(shù)轉錄事件都是產生非編碼RNA,其中微小RNA (miRNAs) 和長鏈非編碼RNA (long noncoding RNAs,LncRNAs) 越來越受到關注[3]。LncRNAs 是一組長度超過200 nt 且無蛋白質編碼潛能的RNA[4]。據報道,LncRNAs 可以與DNA、miRNAs 或蛋白質相互作用,通過在轉錄、轉錄后和翻譯水平上調節(jié)靶基因的表達,參與多種生物和病理細胞過程[5]。越來越多的研究表明,LncRNA在腫瘤發(fā)生中起著關鍵作用。如LINC01419 通過海綿化miR-485-5p 上調LSM4 的表達,從而促進肝癌細胞的惡性生物學行為[6]。LINC00472 通過mir-4311/GNG 軸抑制口腔鱗狀細胞癌的進展[7]。LINC01133 位于染色體1q23.2,它首先被確定為肺鱗癌的癌基因[8]。研究表明,LINC01133 在胰腺癌、肝細胞癌、腎細胞癌和子宮內膜癌中發(fā)揮致癌作用,而在大腸癌中,LINC01133 抑制惡性進展[9-10]。有文獻研究表明LINC01133 在宮頸癌細胞中的表達上調并與宮頸癌的預后不良有關[11-12]。然而,LINC01133 在宮頸癌細胞中的功能和機制仍有待探究。因此,本實驗探討干擾LINC01133 對宮頸癌細胞腫瘤免疫微環(huán)境、氧化應激以及裸鼠成瘤的影響,以期為宮頸癌的臨床治療提供新參考。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

RPMI1640 培養(yǎng)液、10 % 胎牛血清、0.25 %胰蛋白酶、TRIzol 試劑和SuperScript First-Strand cDNA System 試劑盒(美國Thermo Fisher 公司);SYBR EX TAQ Ⅱ預混液(大連Takara 公司);RIPA 細胞裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑(美國Apexbio 公司);腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素(interleukin,IL) -6 和IL-1β 酶聯(lián)免疫吸附測定(enzymelinked immunosorbent assay,ELISA) 試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD) 試劑盒和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH) 試劑盒(南京建成生物工程研究所);4 %多聚甲醛(上海麥克林生化科技有限公司);兔來源P65 和p-P65 一抗及山羊抗兔二抗(英國Abcam 公司)。FAC Scan 流式細胞儀購自美國BD Biosciences 公司,Multiskan FC酶標儀購自賽默飛世爾科技(中國) 有限公司,HH-M2 恒溫水浴鍋購自上海赫田科學儀器有限公司,BDF-86V158 超低溫冰箱購自濟南鑫貝西生物技術有限公司,CQT-191IR CO2恒溫培養(yǎng)箱購自蘇州珀西瓦爾實驗設備有限公司,BX50 熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)

人宮頸癌細胞系(HT-3,HeLa 和SiHa) 和正常宮頸表皮細胞(HaCaT) 購自中國科學院(上海) 細胞庫。細胞在含有10 %胎牛血清、100 IU/mL 青霉素、100 mg/mL 鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基中,在37 ℃、5 % CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當融合程度達到80 %～90 %時,對細胞進行傳代培養(yǎng)。

1.3 細胞轉染與分組

用于下調LINC01133 的shRNAs 以及相應的陰性對照(shRNA-NC) 均購自上海GenePharma 公司。將SiHa 細胞隨機分為對照組(Control)、陰性對照組(shRNA-NC)、LINC01133-shRNA1、LINC-01133-shRNA2、LINC01133-shRNA3。其中,對照組不進行轉染,其余4 組按照分組轉染不同序列,轉染48 h 后,采用定量實時聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR) 驗證轉染效率。

1.4 qRT-PCR 檢測LINC01133 的表達

用TRIzol 試劑從細胞和腫瘤組織中提取RNA,然后用SuperScript First-Strand cDNA System 反轉錄成cDNA。根據制造商的說明,在ABI 7500 Realtime PCR 系統(tǒng)上進行qRT-RCR,反應體系中加入SYBR EX TAQⅡ預混液,相應引物及cDNA 模板。以GAPDH 作為內參,采用2-ΔΔCt法分析LINC01133的表達水平。引物序列如下: LINC01133 正向引物為5′-CCTGTGGTGGAGAGAATGGA-3′,反向引物為5′-CCCCACCTTTCCAGATCCAAA-3′;GAPDH 正向引物為5′-ACCCACATCCCTCAGACAC-3′,反向引物為5′-CCCCAATACGACCAAATCC-3′。

1.5 克隆形成實驗

根據1.3 步驟的篩選,將SiHa 細胞隨機分成Control、shRNA-NC 和LINC01133-shRNA1 組,按照分組分別轉染相應序列,然后制備成單細胞懸浮液,進行計數(shù),接種到60 mm 培養(yǎng)皿(每個培養(yǎng)皿1 000 個細胞) 中,培養(yǎng)14 d 后用甲醇固定菌落15 min,并用結晶紫染色15 min。在顯微鏡下計算可見菌落(超過50 個細胞) 的數(shù)量。

1.6 ELISA 檢測炎性因子水平

根據1.3 步驟的篩選,將SiHa 細胞隨機分成Control、shRNA-NC 和LINC01133-shRNA1 組,按照分組分別轉染相應序列,48 h 后收集各組細胞培養(yǎng)上清液,按照試劑盒說明書進行操作檢測TNF-α、IL-6 和IL-1β 的水平。

1.7 免疫熒光檢測P65 的含量

取1.5 分組處理的SiHa 細胞,稀釋后進行細胞爬片,將玻璃蓋玻片上生長的細胞用預冷的DPBS 清洗,并用含0.01 % Triton X-100 的4 %多聚甲醛在冰上固定25 min。在用PBST 短暫清洗1次后,用含0.05 % Triton X-100 的PBS 處理細胞10 min 以進行滲透。用PBST 短暫清洗細胞1 次,在室溫下用含有5 %正常血清和50 mmol/L NH4Cl的PBST 封閉30 min。用稀釋在含有1 %正常血清的PBST 中的P65 一抗(1∶100) 培養(yǎng)細胞過夜后,用PBST 清洗細胞3 次,每次5 min。然后在室溫下用熒光染料結合的二抗(1∶ 200) 在含有1 %正常血清的PBST 中培養(yǎng)細胞1 h。DAPI 染色10 min,封片,在奧林巴斯BX50 熒光顯微鏡下觀察免疫熒光染色。

1.8 試劑盒檢測氧化應激標記物水平

取1.5 分組處理的SiHa 細胞,裂解細胞后離心收集上清液,并通過BCA 試劑盒測定蛋白質濃度。按照試劑盒說明進行操作,檢測裂解液中SOD 和LDH 的水平。

1.9 建立裸鼠移植瘤模型

12 只SPF 級BALB/c 裸鼠(雄性,4 周齡,18～20 g),購自新疆醫(yī)科大學,生產許可證號: SCXK(新) 2018-0002。將裸鼠隨機分為2 組: shRNA-NC組和sh-LINC01133 組,每組6 只。分別將shRNANC 和LINC01133-shRNA1 轉染至SiHa 細胞,然后將轉然后的細胞以1 ×106個/100 μL 分別接種于裸鼠右側腋下0.5 cm 處,觀察腫瘤形成情況,每5 天測量一次腫瘤的長和寬,計算腫瘤體積(長×寬2/2),30 d 后處死小鼠,獲取腫瘤組織并稱重。

1.10 WB 檢測P65 的磷酸化

取1.9 獲得的腫瘤組織,在RIPA 裂解溶液中添加蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑,混勻后置于冰上裂解40 min,高速離心后收集上清,BCA 法定量。上清液在100 ℃的水浴中加熱10 min 以使蛋白質變性。使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質,然后轉移到聚偏氟乙烯膜上。用5 %的脫脂牛奶封閉膜2 h,然后用一抗P65 (1∶1 000) 和p-P65 (1∶1 000) 在4 ℃孵育過夜。然后用山羊抗兔二抗室溫孵育1 h,采用ECL 法顯色,Image J 分析條帶灰度值。

1.11 統(tǒng)計學方法

采用SPSS21.0 統(tǒng)計軟件進行分析,結果用平均值±標準差() 表示,兩組數(shù)據用獨立樣本t檢驗,多組數(shù)據用單因素方差分析,P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LINC01133 在宮頸癌中的表達上調

TCGA 數(shù)據庫獲得的數(shù)據顯示宮頸癌患者的LINC01133 表達明顯高于相應的對照組(P＜0.05,圖1A)。qRT-PCR 檢測宮頸癌細胞中LINC01133的表達,結果顯示,與HaCaT 組相比,HT-3、Hela 和SiHa 細胞中LINC01133 的表達均顯著上調(P＜0.05,圖1B),且SiHa 細胞中LINC01133 表達上調最為顯著,因此后續(xù)實驗在SiHa 細胞中展開。

圖1 LINC01133 在宮頸癌中的表達

2.2 干擾LINC01133 的表達對細胞增殖的影響

qRT-PCR 驗證不同干擾RNA 的敲低效率,結果顯示,與 Control 組相比,shRNA-NC 組LINC01133 表達水平差異無統(tǒng)計學意義,3 個干擾組LINC01133 表達水平均降低 (P＜0.05,圖2A),其中LINC01133-shRNA1 組敲低效率最高,選擇此組為后續(xù)實驗干擾組?？寺⌒纬蓪嶒灆z測結果顯示,與對照組比較,LINC01133-shRNA1 組SiHa細胞克隆形成率顯著減少(P＜0.05,圖2A)。提示干擾LINC01133 的表達可抑制SiHa 細胞的增殖。

圖2 干擾LINC01133 的表達對細胞增殖的影響

2.3 干擾LINC01133 對炎性因子水平的影響

ELISA 檢測各組中細胞上清液中的炎性因子水平,與Control 組相比,shRNA-NC 組細胞上清液中TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平差異無統(tǒng)計學意義,LINC01133-shRNA1 組細胞上清液中TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平顯 著降低(P＜0.05,圖3),提 示干 擾LINC01133 表達可抑制SiHa 細胞中炎性細胞因子水平。

圖3 ELISA 檢測細胞上清液中炎性因子的水平

2.4 干擾LINC01133 對P65 磷酸化和核轉移的影響

Western 印跡檢測SiHa 細胞中P65 的磷酸化水平,結果顯示,與Control 組相比,LINC01133-shRNA1 組SiHa 細胞中P65 的磷酸化水平顯著降低(P＜0.05,圖4A)。

圖4 干擾LINC01133 對P65 活化的影響

免疫熒光染色檢測P65 的核定位,結果顯示,與Control 組相比,LINC01133-shRNA1 組核內P65 的熒光強度顯著減弱(P＜0.05,圖4B),表明干擾LINC01133 表達可以減少P65 的磷酸化和入核,提示干擾LINC01133 抑制NF-κB P65 通路的活化。

2.5 干擾LINC01133 對宮頸癌細胞氧化應激的影響

為探究干擾LINC01133 對SiHa 細胞氧化應激的影響,我們檢測了各組細胞裂解液中SOD 和LDH 的含量。與Control 組相比,shRNA-NC 組氧化應激標記物水平差異無統(tǒng)計學意義,LINC01133-shRNA1 組SOD 活性顯著降低,LDH 水平顯著升高(P＜0.05,圖5)。實驗提示干擾LINC01133 誘導氧化應激反應增強,促進線粒體損傷。

圖5 干擾LINC01133 對宮頸癌細胞氧化應激的影響

2.6 干擾LINC01133 對裸鼠成瘤的影響

裸鼠成瘤實驗結果顯示,與shRNA-NC 組相比,LINC01133-shRNA1 組裸鼠腫瘤重量與體積顯著降低 (P＜0.05,圖6A～C),腫瘤組織中LINC01133 表達顯著升高 (P＜0.05,圖6D),SOD 活性顯著降低(P＜0.05,圖6E),p-P65/P65比值顯著降低 (P＜0.05,圖6F)。提示干擾LINC01133 在體內抑制裸鼠腫瘤的生長。

圖6 干擾LINC01133 對宮頸癌細胞裸鼠成瘤的影響

3 結論

LncRNA 在基因表達和多種基本細胞機制中發(fā)揮著關鍵的調節(jié)作用,特別是在惡性細胞中異常表達,提示其在腫瘤發(fā)病機制中可能發(fā)揮作用。Jin等[14]報道指出LncRNA SNHG12 通過調節(jié)miR-125b/STAT3 促進宮頸癌的進展;Zou 等[15]研究表明干擾LncRNA OGFRP1 可抑制宮頸癌細胞的增殖和遷移。因此,LncRNA 對宮頸癌的發(fā)生發(fā)展具有重要作用,可能成為宮頸癌診治的新契機、為腫瘤精準治療指出新的方向。研究表明LINC01133 的異常表達對惡性腫瘤也惡性腫瘤的細胞增殖有關[10,16]。本實驗研究結果顯示LINC01133 在宮頸癌組織和細胞中的表達顯著上調,敲低LINC01133的表達顯著降低SiHa 細胞的克隆形成率,與之前的研究結果一致[17],提示LINC01133 在宮頸癌中發(fā)揮促癌作用。此外,體內實驗顯示,干擾LINC01133 表達使裸鼠腫瘤重量和體積均顯著降低,提示干擾LINC01133 抑制宮頸癌腫瘤細胞生長。

炎癥在癌癥發(fā)展中通過誘導血管生成、侵襲和轉移而促進腫瘤的發(fā)展進程[18]。NF-κB 被認為是免疫和炎性反應的中心介質,參與多種細胞途徑,是惡性腫瘤中不同基因表達的關鍵調節(jié)因子[19]。P65 是NF-κB 家族成員之一,是腫瘤微環(huán)境中重要的調控因子,受到上游信號分子激活后,引起多種炎性基因表達上調,而IL-6 細胞因子亦可以增加NF-κB 信號通路的激活[20-21]。本研究結果顯示干擾LINC01133 的表達明顯降低P65 的磷酸化水平,且核內P65 的熒光強度均顯著減弱。此外,干擾LINC01133 明顯降低SiHa 細胞中的TNF-α、IL-6和IL-1β 水平。提示干擾LINC01133 通過調控P65核轉移抑制SiHa 細胞的炎性反應,從而阻止腫瘤的發(fā)展和轉移。

SOD 是機體抵抗過氧化物毒性作用的主要防御機制,研究表明SOD 活性的增加與癌癥進展和腫瘤細胞的惡性轉化有關[22];LDH 主要存在于胞漿內,正常時不能通過細胞膜,當細胞受損或死亡時被釋放,所以細胞死亡數(shù)目與LDH 活性成正比[23]。本實驗顯示干擾LINC01133 的表達,SOD活性顯著降低,LDH 活性顯著升高,提示干擾LINC01133 表達誘導SiHa 細胞的氧化應激反應,引起線粒體損傷,促使宮頸癌細胞死亡。

綜上,干擾長鏈非編碼RNA LINC01133 具有抑制宮頸癌細胞增殖、炎性反應、氧化應激的作用,且體內能夠抑制腫瘤的生長,具有成為宮頸癌治療靶點的潛力。