張陽,馬菁菁,喻哲昊,劉雪妮,孫林春

南京醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院檢驗科 南京市,210008

骨骼是人體的重要組織器官,具有支持、保護和運動功能。骨組織的新陳代謝活躍,始終處于成骨細胞介導的骨形成和破骨細胞介導的骨吸收過程的動態(tài)自我更新和平衡中,即骨的重塑[1]。生理情況下,成骨細胞和破骨細胞協(xié)同作用,在骨形成和骨吸收之間形成穩(wěn)態(tài),以維持正常的骨骼細胞形態(tài)、數(shù)量和功能[2]。骨代謝過程的任一環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常都會導致代謝性骨病的發(fā)生。代謝性骨病的發(fā)病與營養(yǎng)、藥物、衰老等多種因素有關。過去的很長時間里,研究者對骨重塑障礙的關注點更多集中在破骨細胞的過度活化。然而近年來,成骨細胞功能異常在骨重塑障礙和代謝性骨病的研究中越來越受重視[3]。成骨細胞(osteoblast,OB) 起源于間充質(zhì)細胞,主要存在于骨外膜的內(nèi)層、骨髓內(nèi)以及穿行于骨內(nèi)的小血管周圍,是骨形成的主要執(zhí)行者。有研究發(fā)現(xiàn),成骨細胞分泌的骨膠原、骨基質(zhì)、細胞因子和酶等能激活骨形成過程,并對破骨細胞的生成、成熟與活化有調(diào)控作用[4]。骨髓間充質(zhì)細胞的自我更新活躍度下降和向成骨細胞分化障礙,會導致骨形成減少,易發(fā)骨質(zhì)疏松、骨折修復能力低等問題[5]。研究成骨細胞的生物學行為及調(diào)控機制,對于了解代謝性骨病的發(fā)病機理并以成骨細胞為切入點尋找治療策略,具有重大價值。

自噬是一種細胞在應激刺激下的生存機制,基礎水平的自噬能維持細胞穩(wěn)態(tài);當機體遭遇應激刺激時,自噬通過降解一些非必需的細胞器,幫助細胞以最低的能耗生存下來。近來不斷有研究發(fā)現(xiàn),自噬現(xiàn)象貫穿各類骨細胞的發(fā)育成熟過程,對骨代謝平衡有調(diào)節(jié)作用,自噬異?？赡艹蔀楣谴x疾病新的發(fā)病機制[6]。通過調(diào)節(jié)自噬改變骨組織結(jié)構(gòu)、改善代謝性骨病病程,已成為骨科領域研究的熱點之一。骨形成蛋白 (bone morphogenetic protein,BMPs) 是一類重要的骨誘導因子,目前發(fā)現(xiàn)的BMPs 成員有20 多種,BMP9 是BMPs 家族一員,在造血、神經(jīng)元分化發(fā)育、物質(zhì)代謝等過程中都有重要功能[7-8],近來有研究發(fā)現(xiàn)BMP9 能誘導間充質(zhì)干細胞向成骨細胞和軟骨細胞分化,與骨形成有關[9-10]。P38 MAPK 是BMP9 的一個下游通路,參與細胞自噬過程[11]。此外,在腫瘤[12]、干細胞定向分化[13]、肝臟疾病[14]等的發(fā)生發(fā)展中都有BMP9/P38 MAPK 途徑參與的相關報道。P38 MAPK 活化對破骨細胞、成骨細胞及軟骨細胞活化或凋亡有影響,參與骨代謝進程[15-16],但具體機制未完全闡明。本研究中,我們擬探索BMP9/P38 MAPK 信號通路通過調(diào)控成骨細胞自噬,影響成骨細胞增殖和凋亡,參與骨形成的過程,揭示其在骨重塑過程中的作用。

1 材料和方法

1.1 細胞系

將本實驗室長期保種的小鼠成骨細胞系細胞系MC3T3-E1,用含10 %胎牛血清和雙抗霉素的α-MEM 培養(yǎng)基,37 ℃,5 % CO2,飽和濕度培養(yǎng)。自噬誘導方法如下: 將成骨細胞MC3T3-E1 用200 ng/mL 雷帕霉素(rapamycin) 處理24 h,對照組則加入等體積的雷帕霉素稀釋液。

1.2 主要儀器和試劑

雷帕霉素(北京索萊寶科技有限公司)、TRIzol 試劑盒(日本Takara 公司)、SuperReal PreMix Plus 試劑盒(北京天根生化科技有限公司)、Western 印跡兔單克隆抗體(ab207318,美國Abcam 公司) 和羊抗兔多克隆抗體(ab205718,美國Abcam 公司)、真核表達載體pcDNA3.1 (上海吉凱基因)、siRNA (上海吉瑪基因)、Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑(美國Invitrogen 公司)、P38 MAPK激活劑和抑制劑(北京中杉金橋生物技術有限公司)、CCK-8 試劑盒和ROS 檢測試劑盒(南京建成生物科技研究所)、Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡試劑盒(美國BD 公司)。

1.3 細胞分組及處理

pcDNA3.1-BMP9 組(轉(zhuǎn)入pcDNA3.1-BMP9)、BMP9 siRNA 組(轉(zhuǎn)入BMP9 siRNA)、P38 激活組(10 μmol/L 茴香霉素處理)、P38 抑制組 (10 μmol/L SB-202190 處理)、pcDNA3.1-BMP9+P38抑制組 (pcDNA3.1-BMP9+10 μmol/L SB-202190)、BMP9 siRNA+P38 激活組(BMP9 siRNA+10 μmol/L 茴香霉素處理),同時設立pcDNA3.1 組(轉(zhuǎn)入pcDNA3.1)、siRNA NC 組(轉(zhuǎn)入siRNA NC) 和對照組(不做處理)。

1.4 pcDNA3.1-BMP9 和BMP9 siRNA 構(gòu)建

根據(jù)NCBI 檢索的基因序列設計并合成針對BMP9 開放閱讀框的上下游引物,PCR 擴增BMP9開讀框序列,上游引物5′-TTCCTTCAGAGCAAACAGCA-3′,下游引物 5′-GTTGTGCTCAAATCCCCATT-3′,反應產(chǎn)物經(jīng)回收、測序無誤后,在序列兩端加上EcoRⅠ和XbaⅠ內(nèi)切酶位點,再與用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和XbaⅠ雙酶切后的線性pcDNA3.1 質(zhì)粒大片段按2∶1 摩爾比例,T4 連接酶16 ℃過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)細胞,長出的克隆用載體特異性上下游引物先將進行PCR 鑒定,再測序驗證。由上海吉瑪基因公司設計并合成3 條BMP9 siRNA 和1 條siRNA NC,引物序列見表1,轉(zhuǎn)染MC3T3-E1 細胞后,定量PCR 驗證其對BMP9 的干涉效果,上游引物為5′-GGACCCGATGCGGTTAGAG-3′,下游引物為 5′-ATCAAGTGGATGCCCCACAG-3′;內(nèi)參基因GAPDH上游引物為5′-GAATGGGCAGCCGTTAGGAA-3′,下游引物為5′-AGGAAAAGCATCACCCGGAG-3′,干涉效率最高的siRNA 用于正式實驗。

表1 BMP9 siRNA 和siRNA NC 引物序列

1.5 細胞轉(zhuǎn)染

將MC3T3-E1 細胞按105個/孔接種到6 孔板中,培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)染前1 h 更換不完全培養(yǎng)液,用Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑盒,根據(jù)操作說明進行細胞轉(zhuǎn)染,放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h 后,更換新鮮完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,收集細胞檢測轉(zhuǎn)染效率,進行后續(xù)實驗。

1.6 蛋白免疫印跡實驗

收集各組細胞于EP 管,加入1 mL RIPA 冰浴裂解20 min,低溫高速離心后,將上清轉(zhuǎn)移到新EP 管,煮沸5 min,再次離心后取上清,BCA 法進行蛋白定量。聚丙烯酰胺凝膠(8 %分離膠,12 %濃縮膠) 電泳(80 V,20 min;120 V,90 min),轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜(350 mA,90 min)。封閉2 h后洗膜,加入1∶1 000 稀釋后的一抗4 ℃過夜,充分洗膜,再加入1∶2 000 酶標二抗,室溫孵育1 h;洗膜,ECL 顯影,用自動凝膠成像分析儀檢測各組細胞BMP9、P38 MAPK、LC3-Ⅱ、Beclin-1、P62蛋白表達。

1.7 細胞增殖檢測

各組細胞用胰酶消化后調(diào)整濃度為1 ×105個/mL,按100 μL/孔接種96 孔板,置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)46 h;每孔加入10 μL CCK-8 試劑,避免產(chǎn)生氣泡影響讀數(shù),再放回培養(yǎng)箱孵育2 h;取出96 孔板,用全自動酶標儀在450 nm 處檢測各孔吸光度,反映細胞增殖情況。

1.8 細胞凋亡檢測

將各組細胞用胰酶消化,用1 ×PBS 制成105個/mL 的單細胞懸液,按100 μL/孔加入上樣管中,先加入20 μL FITC,渦旋混勻后,室溫避光孵育20 min;再加入20 μL PI,混勻后再次避光孵育20 min;每管加入500 μL 1 ×PBS 緩沖液,混勻后1 h 內(nèi)上機檢測。

2 結(jié)果

2.1 篩選有效的BMP9 siRNA

定量PCR 結(jié)果(圖1) 顯示,轉(zhuǎn)染BMP9 siRNA-1、BMP9 siRNA-2 和BMP9 siRNA-3 的細胞BMP9 mRNA 表達水平分別為 (0.66 ± 0.12)、(0.53 ±0.10) 和(0.41 ±0.09),均較對照組顯著降低(P＜0.01),BMP9 siRNA-3 的干涉效果最好,故選定BMP9 siRNA-3 為有效siRNA 用于后續(xù)實驗。

圖1 BMP9 siRNA 干涉效果鑒定

2.2 Rapamycin 誘導MC3T3-E1 細胞自噬

由圖2 可見,Rapamycin 組MC3T3-E1 細胞LC3-Ⅱ和Beclin-1 蛋白水平較對照組高 (P＜0.05),P62 蛋白水平較對照組低(P＜0.05)。結(jié)果表明Rapamycin 誘導MC3T3-E1 細胞發(fā)生自噬。

圖2 Rapamycin 誘導的MC3T3-E1 細胞自噬相關蛋白表達水平

2.3 Rapamycin 誘導MC3T3-E1 細胞BMP9 表達和P38磷酸化

由圖3 可見,Rapamycin 組MC3T3-E1 細胞BMP9 蛋白水平較對照組升高(P＜0.05);P38 蛋白水平與對照組無差異,p-P38 蛋白水平較對照組升高(P＜0.05)。結(jié)果顯示,Rapamycin 能誘導細胞BMP9 高表達和P38 磷酸化。

圖3 Rapamycin 誘導的MC3T3-E1 細胞BMP9 和P38 蛋白表達水平

2.4 BMP9/P38 MAPK 對MC3T3-E1 細胞自噬的調(diào)控

由圖4A 可見,pcDNA3.1-BMP9 組MC3T3-E1細胞LC3-Ⅱ和Beclin-1 蛋白水平高于對照組(P＜0.05),P62 蛋白水平較對照組低 (P＜0.05);BMP9 siRNA 組細胞LC3-Ⅱ和Beclin-1 蛋白水平低于對照組(P＜0.05),P62 蛋白水平高于對照組(P＜0.05),pcDNA3.1 組和siRNA NC 組細 胞LC3-Ⅱ、Beclin-1 和P62 蛋白水平與對照組無差異(P＞0.05)。結(jié)果表明,BMP9 能引起MC3T3-E1細胞自噬。

圖4 BMP9/P38 MAPK 對MC3T3-E1 細胞自噬的影響

圖4B 顯示,P38 激活組MC3T3-E1 細胞LC3-Ⅱ和Beclin-1 蛋白水平高于對照組(P＜0.05),P62 蛋白水平較對照組低(P＜0.05);P38 抑制組LC3-Ⅱ和Beclin-1 蛋白水平低于對照組 (P＜0.05),P62 蛋白水平高于對照組(P＜0.05),提示P38 通路活化能引起MC3T3-E1 細胞自噬。pcDNA3.1-BMP9+P38 抑制組細胞LC3-Ⅱ、Beclin-1和P62 蛋白水平與對照組無差異,BMP9 siRNA +P38 激活組LC3-Ⅱ、Beclin-1 和P62 蛋白水平與對照組無差異(P＞0.05) (圖4C),提示BMP9 能通過P38 MAPK 通路調(diào)控MC3T3-E1 細胞自噬。

2.5 BMP9/P38 MAPK 對MC3T3-E1 細胞增殖和凋亡的影響

由圖5A 可見,pcDNA3.1-BMP9 組細胞增殖率為(189 ±13)%,高于對照組(P＜0.05);BMP9 siRNA 細胞增殖率為(132 ±10)%,低于對照組(P＜0.05);pcDNA3.1 組和siRNA NC 組細胞增殖率與對照組無差異(P＞0.05),表明BMP9 能促進MC3T3-E1 細胞增殖。

圖5 BMP9/P38 MAPK 對MC3T3-E1 細胞增殖的影響

P38 激活組細胞增殖率為(204 ±14)%,高于對照組(P＜0.05);P38 抑制組細胞增殖率為(121 ±6)%,低于對照組(P＜0.05) (圖5B),表明P38 MAPK 通路能促進MC3T3-E1 細胞增殖。pcDNA3.1-BMP9+P38 抑制組和BMP9 siRNA+P38 激活組細胞增殖率分別為(145±8)%和(156±6)%,與對照組無差異(P＞0.05) (圖5C),提示BMP9 能通過p38 MAPK 通路調(diào)控MC3T3-E1 細胞增殖。

pcDNA3.1-BMP9 組細胞凋亡率為 (6.56 ±1.23)%,低于對照組(P＜0.05);BMP9 siRNA組細胞凋亡率為(18.45 ±3.54)%,高于對照組(P＜0.05);pcDNA3.1 組和siRNA NC 組細胞凋亡率與對照組無差異(P＞0.05),表明BMP9 能減少MC3T3-E1 細胞凋亡(圖6)。

圖6 BMP9 對MC3T3-E1 細胞凋亡的調(diào)控

P38 激活組細胞凋亡率為(4.12 ±0.87)%,低于對照組(P＜0.05);P38 抑制組細胞凋亡率為(20.71 ±2.44)%,高于對照組(P＜0.05),表明P38 MAPK 通路能減少MC3T3-E1 細胞凋亡 (圖7A)。pcDNA3.1-BMP9+P38 抑制組和BMP9 siRNA+P38 激活組細胞凋亡率分別為 (10.04 ±1.78)%和(13.15 ±2.01)%,與對照組無顯著性差異(P＞0.05) (圖7B)。

圖7 BMP9/P38 MAPK 對MC3T3-E1 細胞凋亡的影響

以上結(jié)果提示BMP9 能通過P38 MAPK 通路影響MC3T3-E1 細胞的凋亡。

3 討論

近年來,不斷有研究發(fā)現(xiàn)自噬現(xiàn)象貫穿于骨組織及各類骨細胞的發(fā)育成熟過程。Shi 等[17]發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素能以劑量依賴的方式影響破骨細胞的生成,隨著劑量的升高,破骨細胞內(nèi)自噬水平也上調(diào);應用自噬抑制劑3-MA 后糖皮質(zhì)激素對破骨細胞生成的調(diào)控作用消失,證明糖皮質(zhì)激素通過自噬影響破骨細胞生成;Nollet 等[18]發(fā)現(xiàn)自噬伴隨著成骨細胞的礦化過程,在敲除自噬基因的成骨細胞和自噬基因特異性缺陷小鼠中發(fā)現(xiàn),成骨細胞的礦化能力顯著降低,自噬作用與成骨細胞的礦化和骨穩(wěn)態(tài)密切相關。Yang 等[19]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激能通過誘導成骨細胞自噬,緩解ROS 對成骨細胞的氧化損傷,調(diào)節(jié)成骨細胞自噬可能對骨質(zhì)疏松癥具有潛在的治療價值。以上均提示我們自噬通路在骨代謝平衡中有重要的調(diào)節(jié)作用。我們用自噬誘導劑雷帕霉素處理成骨細胞后發(fā)現(xiàn),細胞的自噬蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1 水平明顯升高,同時發(fā)現(xiàn)BMP9蛋白水平也升高。目前報道與骨形成有關的BMP家族成員有BMP2、BMP4、BMP5、BMP7、BMP9等。有研究指出,BMP9 能誘導成骨細胞ALP 活性和鈣鹽沉積,促進裸鼠皮下異位成骨[20]。但關于BMP9 誘導成骨的機制研究還很少,尚未見其他報道。雷帕霉素誘導后,我們還發(fā)現(xiàn),P38 蛋白發(fā)生了磷酸化激活。P38 MAPK 是BMP9 的下游通路,上述結(jié)果提示我們,雷帕霉素誘導的成骨細胞內(nèi)發(fā)生了自噬和BMP9/P38 MAPK 信號通路的活化。

通過研究我們進一步發(fā)現(xiàn),在MC3T3-E1 細胞中轉(zhuǎn)入外源性BMP9 后,細胞自噬蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1 表達均上調(diào),P62 蛋白表達下調(diào);而轉(zhuǎn)入外源性BMP9 siRNA 后,自噬蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1表達均下調(diào),P62 蛋白表達上調(diào),以上結(jié)果表明BMP9 能誘導成骨細胞發(fā)生自噬。P38 激活劑處理MC3T3-E1 細胞后,LC3-Ⅱ和Beclin-1 蛋白表達上調(diào),P62 蛋白表達下調(diào);相反地,P38 抑制劑處理的MC3T3-E1 細胞LC3-Ⅱ和Beclin-1 蛋白表達下調(diào),而P62 蛋白表達上調(diào),說明P38 MAPK 通路活化能引起成骨細胞自噬。

目前對調(diào)控骨細胞自噬過程的相關蛋白和信號通路的研究較少。已有的研究中,Pantovic 等[21]研究發(fā)現(xiàn),AMPK 通路能通過mTOR 抑制介導的細胞自噬控制間充質(zhì)干細胞的成骨分化。Song 等[22]發(fā)現(xiàn)PTEN 和Notch 信號通路對骨髓間充質(zhì)干細胞自噬有調(diào)控作用,從而影響骨髓間充質(zhì)干細胞的成脂分化。用不同濃度NF-κB 信號通路抑制劑SN50 體外誘導小鼠成骨細胞MC3T3-E1,發(fā)現(xiàn)細胞自噬水平明顯升高[23]。BMP9 能活化P38 MAPK 信號通路,誘導間充質(zhì)干細胞的定向分化[24];且BMP9和P38 MAPK 信號通路與自噬的關系已經(jīng)得到諸多研究證實,但目前尚未見BMP9/P38 MAPK 與骨細胞自噬的研究報道。我們發(fā)現(xiàn),用P38 抑制劑處理轉(zhuǎn)入了外源性BMP9 基因的MC3T3-E1 細胞后,細胞的LC3-Ⅱ、Beclin-1 和P62 蛋白水平均回復至與對照組相當?shù)乃?說明阻斷P38 活化能有效抑制BMP9 高表達所引起的細胞自噬;而對轉(zhuǎn)入了外源性BMP9 siRNA 的MC3T3-E1 細胞用P38 激活劑處理后,細胞的LC3-Ⅱ、Beclin-1 和P62 蛋白水平也與對照組無顯著差異,即P38 活化能逆轉(zhuǎn)BMP9 低表達對成骨細胞自噬的抑制作用,BMP9 通過調(diào)控P38 MAPK 信號通路誘導成骨細胞發(fā)生自噬。

自噬是細胞在應激條件下的一種自我保護機制。自噬與凋亡的平衡對維持細胞穩(wěn)態(tài)至關重要,在骨代謝疾病和恢復過程中常伴隨成骨細胞自噬和凋亡的發(fā)生,兩者在功能上既存在聯(lián)系,又有明顯不同。自噬可以發(fā)生在凋亡之前,并啟動細胞凋亡;也可以保護細胞免于凋亡和壞死。我們發(fā)現(xiàn),BMP9 高表達和P38 MAPK 活化都能促進MC3T3-E1 細胞的增殖,抑制細胞的凋亡;P38 抑制劑能抑制BMP9 高表達的MC3T3-E1 細胞增殖,促進細胞凋亡,而P38 活化劑能促進BMP9 低表達的MC3T3-E1 細胞增殖,抑制細胞凋亡。我們的研究結(jié)果表明,MC3T3-E1 細胞發(fā)生自噬時,細胞凋亡減少;抑制MC3T3-E1 細胞自噬時,細胞凋亡增加,即自噬可能抑制MC3T3-E1 細胞凋亡,說明自噬活性對成骨細胞的保護作用。

綜合以上,BMP9 能通過P38 MAPK 信號通路調(diào)控成骨細胞自噬和凋亡,這為BMP9/P38 MAPK 通路在骨代謝疾病中的應用提供新證據(jù),也為進一步揭示細胞自噬對成骨細胞的保護作用的機制提供新思路,對骨代謝疾病的臨床治療及修復有積極的意義。