廖運國 ,唐梓瑜 ,李超 ,蒲嘉騏 ,邱世香 ,楊甜

1南充市中心醫(yī)院介入醫(yī)學科 四川省南充市,637000 2南充市高坪區(qū)人民醫(yī)院腫瘤科 四川省南充市,637100

肝癌是一種常見的惡性腫瘤,其具有早期癥狀不明顯,發(fā)生發(fā)展較快等特點,在我國的發(fā)病率和死亡率都很高[1]。隨著科技進步,常規(guī)的肝癌治療方法如手術、放化療等有所改進和提高,但是治療效果仍然不是很理想,給人們的心理和生理帶來了極大的負擔[2]。因此尋找更加有效的治療肝癌的方法十分重要。長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA,LncRNA) 是一種長度超過200 個核苷酸的非編碼RNA。既往研究發(fā)現(xiàn),在肝癌患者組織和血清中有大量異常表達的LncRNA,其中有一些LncRNA 被證實是抑制肝癌發(fā)生發(fā)展的重要調(diào)控因子[3-5]。

已有研究報道,長鏈非編碼RNA 膀胱癌相關轉(zhuǎn)錄本1 (long chain noncoding RNA bladder cancer associated transcript 1,LncRNA BLACAT1) 位于人類染色體1q32.1 的基因座上,其在人肝癌腫瘤和細胞中都過表達,抑制BLACAT1 具有抑制肝癌腫瘤的作用[6]。在肝癌中下調(diào)miR-324-5p 可促進細胞的遷移和侵襲[7],而絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶3 (mitogen activated protein kinase kinase kinase kinase 3,MAP4K3) 下調(diào)可阻滯肝癌細胞周期進程,抑制惡性增殖[8]。本研究通過生物信息學發(fā)現(xiàn),BLACAT1 與miR-324-5p 存在調(diào)控關系,miR-324-5p 與MAP4K3 可靶向結合。而BLACAT1能否通過調(diào)控miR-324-5p/MAP4K3 軸影響人肝癌細胞增殖、遷移和侵襲尚不明確。因此,本研究主要探究BLACAT1 對肝癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響以及其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

于2020 年6 月至2022 年12 月選取本院收治的50 例肝癌患者,其中男27 例,女23 例,年齡28～69 歲,收集手術中切除的癌組織及相應的癌旁組織,并儲存在液氮中。所有患者術前均未接受放療、化療及其他相關抗癌治療。所有患者均簽署知情同意書,并獲得醫(yī)院倫理委員會的批準。

人正常肝細胞(HL-7702) 和人肝癌細胞系(Huh-7、SMMC-7721、MHCC97L) 購自中國上海中科院細胞庫。

1.2 主要試劑

CCK-8 試劑盒(貨號: CK04) 購自上海經(jīng)科化學公司;兔源一抗MAP4K3 (克隆號: SB46b(HRP))、PCNA (克隆號: IPO-38)、MMP2 (克隆號: AB13a)、MMP9 (克隆 號: 5C3)、c-Myc(克隆號: 2D5)、Cyclin D1 (克隆號: EP12) 以及二抗(貨號: ab6721) 均購自Abcam 公司;LipofectamineTM2000 Reagent (貨號: ab136465) 購自美國Invitrogen 公司;LncRNA BLACAT1 敲低質(zhì)粒(si-BLACAT1) 及對照 (si-NC),miR-324-5p抑制劑 (miR-324-5p inhibitor) 及對照 (miRNC)、LncRNA BLACAT1 及miR-324-5p 引物購自廣州RiboBio。

1.3 細胞培養(yǎng)

將HL-7702 和Huh-7、SMMC-7721、MHCC97 L 細胞置于含10 % 胎牛血清、1 % 青-鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基中,在37 ℃、5 % CO2的穩(wěn)定環(huán)境中常規(guī)培養(yǎng),定期觀察,每3 天更換一次培養(yǎng)基,當細胞融合度達到85 %以上時,消化傳代,收集對數(shù)期的細胞進行實驗。

1.4 實時熒光定量PCR (RT-qPCR) 法檢測BLACAT1、miR-324-5p、MAP4K3 mRNA 表達

使用Trizol 試劑提取組織和細胞中的總RNA,將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,逆轉(zhuǎn)錄條件: 16 ℃30 min;42 ℃30 min;75 ℃,15 min。以cDNA 為模板上RT-qPCR 儀進行擴增。反應體系50 μL,其中Taq/RTase Mix Ⅱ2 μL,2 ×One Step RT-PCR Buffer 25 μL,上下游引物(10 μmol/L) 各1 μL,加雙蒸水至50 μL。BLACAT1: 正向引物為5′-ACAGAGAGTGGCCTGAT-3′,反向引物為5′-ATCCTTCCAAATCCCCTACG-3′;miR-324-5p: 正向引物為5′-GAGGCGAAGCCCTGGTATG-3′,反向引物為5′-CGGGCCGATTGATCTCAGC-3′;MAP4K3 mRNA:正向引物為5′-AACTTCCCGACAGTGAGGTT-3′,反向引物為 5′-CACCTTGGTGTCCTTGTCCAT-3′;GAPDH: 正向引物為5′-CCTTCCGTGTCACT-3′,反向引物為5′-GCCTGCTTCACCACCTTC-3′;U6: 正向引物為5′-AACGCTTCACGAATTGCGT-3′,反 向引物為5′-CTCGCTTCGGCACACA-3′。分別以GAPDH、U6 為內(nèi)參,采用2-ΔΔCT計算不同組織和細胞中BLACAT1、miR-324-5p、MAP4K3 mRNA 的相對表達量。

1.5 細胞轉(zhuǎn)染

將對數(shù)期的Huh-7 細胞分為ctrl 組(正常培養(yǎng)的Huh-7 細胞)、si-NC 組(轉(zhuǎn)染si-NC)、si-BLACAT1 組(轉(zhuǎn)染si-BLACAT1)、si-BLACAT1 +miRNC 組(si-BLACAT1 和miR-NC 共轉(zhuǎn)染)、si-BLACAT1+miR-324-5p inhibitor 組 (si-BLACAT1 和miR-324-5p inhibitor 共轉(zhuǎn)染)。按照脂質(zhì)體法(Lipofectamine 2000) 操作步驟對上述各組Huh-7 細胞進行轉(zhuǎn)染24 h。

1.6 RT-qPCR 法檢測各組細胞中BLACAT1、miR-324-5p、MAP4K3 mRNA 表達

檢測各組Huh-7 細胞中BLACAT1、miR-324-5p、MAP4K3 mRNA 的表達,具體操作同1.4。

1.7 CCK-8 法檢測細胞增殖

各組細胞以1 ×104個/孔接種到96 孔板中。分別將細胞培養(yǎng)24、48、72 h 后,棄去細胞上清液,且在指定的時間點向每個孔中加入含有10 μL CCK-8 溶液的100 μL 完全培養(yǎng)基。孵育2 h 后,使用酶標儀檢測吸光度。

1.8 劃痕實驗檢測細胞遷移

取各組轉(zhuǎn)染細胞,將細胞密度調(diào)節(jié)至5 ×105個/mL,接種到35 mm 培養(yǎng)皿中,定期孵育直到大約90 %匯合。采用20 μL 移液器槍頭進行劃痕,后置于37 ℃,5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)24 h后,顯微鏡下分別拍照記錄0、24 h 時細胞的劃痕寬度。劃痕愈合率(%)=(0 h 時劃痕寬度-24 h 時劃痕寬度)/0 h 時劃痕寬度×100 %。

1.9 Transwell 小室實驗檢測細胞侵襲

取各組干預24 h 的細胞,用胰蛋白酶消化,離心,之后制成細胞懸液,調(diào)整濃度為1 ×105個/孔。取-20 ℃保存的基質(zhì)膠放4 ℃過夜融化后稀釋,每小室加入100 μL 基質(zhì)膠稀釋液,置37 ℃,5 % CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 h,使其呈干膠狀。將Transwell 小室放入6 孔板中,取細胞懸液加入上室,下室加入10 % FBS 的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出下室,棄上清,甲醇固定。晾干后,結晶紫染色后清洗,將小室倒置于顯微鏡上,每孔隨機選5 個不同區(qū)域,在顯微鏡下觀察拍照,Image-J 圖像分析軟件計算侵襲細胞數(shù)。細胞侵襲率(%)=下室細胞數(shù)量/細胞總數(shù)量×100 %。

1.10 Western 印跡檢測蛋白表達

利用RIPA 裂解緩沖液充分裂解各組轉(zhuǎn)染后的細胞,提取細胞總蛋白。BCA 法測定蛋白濃度并使蛋白煮沸變性。每個樣品取20 μg 蛋白進行電泳分離蛋白,100 V 恒壓轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF 膜上,用5 %的脫脂牛奶封閉2 h,將膜與一抗MAP4K3、PCNA、MMP2、MMP9、c-Myc、Cyclin D1、GAPDH,在4 ℃孵育過夜,再將膜與HRP 偶聯(lián)的羊抗兔二抗在室溫下孵育2 h,棄去液體,洗滌3 次,加入ECL 試劑觀察蛋白質(zhì)印跡,Image J 軟件評估蛋白的灰度值。

1.11 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/h3>

構建BLACAT1 野生型質(zhì)粒(BLACAT1-WT)和突變型質(zhì)粒 (BLACAT1-MUT),將BLACAT1-WT 和BLACAT1-MUT 分別與miR-NC 或miR-324-5p mimic 共轉(zhuǎn)染于Huh-7 細胞,48 h 后,檢測熒光素酶活性。

構建MAP4K3 野生型質(zhì)粒(MAP4K3-WT) 和突變型質(zhì)粒(MAP4K3-MUT),將MAP4K3-WT 和MAP4K3-MUT 分別與miR-NC 或miR-324-5p mimic共轉(zhuǎn)染于Huh-7 細胞,48 h 后,檢測熒光素酶活性。

1.12 統(tǒng)計分析

Graphpad Prism 7.0 軟件用于分析數(shù)據(jù)。所有細胞實驗重復6 次。符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差()。單因素方差分析用于多組間的比較,進一步兩組間的比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組織和細胞中BLACAT1、miR-324-5p、MAP4K3 mRNA 表達比較

RT-qPCR 結果顯示,與癌旁組織相比,肝癌組織中BLACAT1、MAP4K3 mRNA 表達顯著增加,miR-324-5p表達顯著降低(P＜0.05) (表1)。

表1 比較組織中BLACAT1、miR-324-5p、MAP4K3 mRNA 表達(,n=50)

表1 比較組織中BLACAT1、miR-324-5p、MAP4K3 mRNA 表達(,n=50)

與癌旁組織比較,*P＜0.05

為了進一步明確BLACAT1、miR-324-5p、MAP4K3 在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用,經(jīng)RT-qPCR實驗檢測其在不同肝癌細胞(SMMC-7721、MHCC97L、Huh-7) 和HL-7702 細胞中的表達情況,結果顯示與HL-7702 細胞相比,Huh-7、SMMC-7721、MHCC97L 細 胞BLACAT1、MAP4K3 mRNA表達水平顯著增加(P＜0.05),miR-324-5p表達顯著降低(P＜0.05),以Huh-7 細胞中變化最為顯著并作為后續(xù)研究對象(圖1)。

圖1 細胞中BLACAT1、miR-324-5p、MAP4K3 mRNA 表達比較

2.2 各組 Huh-7 細胞中 BLACAT1、miR-324-5p、MAP4K3 mRNA 表達比較

轉(zhuǎn)染si-BLACAT1 以及si-BLACAT1 和miR-324-5p inhibitor 共轉(zhuǎn)染后,經(jīng)RT-qPCR 驗證各組轉(zhuǎn)染效率,結果顯示,與ctrl 組、si-NC 組比較,si-BLACAT1 組Huh-7 細胞中BLACAT1、MAP4K3 mRNA 表達顯著降低、miR-324-5p表達顯著升高(P＜0.05);與si-BLACAT1 組、si-BLACAT1+miR-NC組比較,si-BLACAT1+miR-324-5p inhibitor 組Huh-7細胞中BLACAT1 表達變化差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),MAP4K3 mRNA 表達顯著升高(P＜0.05),miR-324-5p表達顯著降低(P＜0.05,圖2)。

圖2 各組Huh-7 細胞中BLACAT1、miR-324-5p、MAP4K3 mRNA 表達比較

2.3 各組Huh-7 細胞增殖能力比較

經(jīng)CCK-8 實驗檢測LncRNA BLACAT1 調(diào)控miR-324-5p/MAP4K3 軸對細胞增殖的影響,結果顯示,與ctrl 組、si-NC 組比較,si-BLACAT1 組Huh-7 細胞A450值顯著降低(P＜0.05);與si-BLACAT1 組、si-BLACAT1+miR-NC 組比較,si-BLACAT1 +miR-324-5p inhibitor 組Huh-7 細胞A450值顯著升高(P＜0.05,表2)。

表2 各組Huh-7 細胞A450值比較

2.4 各組Huh-7 細胞遷移能力比較

通過敲低BLACAT1 表達以及敲低BLACAT1的同時抑制miR-324-5p 表達,經(jīng)劃痕實驗檢測其對細胞遷移的影響。

結果顯示,與ctrl 組、si-NC 組相比較,si-BLACAT1 組Huh-7 細胞劃痕愈合率顯著降低(P＜0.05);與si-BLACAT1 組、si-BLACAT1+miR-NC組相比較,si-BLACAT1+miR-324-5p inhibitor 組Huh-7 細胞劃痕愈合率顯著升高(P＜0.05) (圖3)。

2.5 各組Huh-7 細胞侵襲情況比較

經(jīng)Transwell 實驗檢測LncRNA BLACAT1 調(diào)控miR-324-5p/MAP4K3 軸對細胞侵襲的影響,結果顯示,與ctrl 組、si-NC 組比較,si-BLACAT1 組Huh-7 細胞侵襲率顯著降低 (P＜0.05);與si-BLACAT1 組、si-BLACAT1+miR-NC 組比 較,si-BLACAT1 +miR-324-5p inhibitor 組Huh-7 細胞侵襲率顯著升高(P＜0.05,圖4)。

圖4 Transwell 實驗檢測Huh-7 細胞侵襲(×100)

2.6 各組 Huh-7 細胞中 MAP4K3、PCNA、MMP2、MMP9 蛋白表達比較

采用Western 印跡法驗證轉(zhuǎn)染si-BLACAT1 以及si-BLACAT1 和miR-324-5p inhibitor 共轉(zhuǎn)染后對細胞MAP4K3 以及與增殖、遷移和侵襲相關的蛋白表達,結果顯示,與ctrl 組、si-NC 組比較,si-BLACAT1 組Huh-7 細胞MAP4K3、PCNA、MMP2、MMP9、c-Myc、Cyclin D1 蛋白表達顯著降低(P＜0.05);與si-BLACAT1 組、si-BLACAT1+miR-NC組比較,si-BLACAT1 +miR-324-5p inhibitor 組Huh-7 細胞MAP4K3、PCNA、MMP2、MMP9、c-Myc、Cyclin D1 蛋白表達顯著升高(P＜0.05) (圖5,表3)。

圖5 Western 印跡檢測Huh-7 細胞中MAP4K3、PCNA、MMP2、MMP9 蛋白表達

表3 各組Huh-7 細胞中MAP4K3、PCNA、MMP2、MMP9 蛋白表達比較

2.7 雙熒光素酶報告基因檢測結果

為了驗證miR-324-5p 分別與LncRNA BLACAT1、MAP4K3 之間的靶向關系,本研究分別利用Starbase、TargetScan 網(wǎng)站預測BLACAT1 與miR-324-5p、miR-324-5p 與MAP4K3 的結合位點。采用雙熒光素酶報告基因檢測實驗證實LncRNA BLACAT1 與miR-324-5p 之間的靶向關系,結果顯示,與miR-NC 和BLACAT1-WT 共轉(zhuǎn)染組比較,miR-324-5p mimic 和BLACAT1-WT 共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性顯著降低 (P＜0.05);與miR-NC 和BLACAT1-MUT 共轉(zhuǎn)染組比較,miR-324-5p mimic 和BLACAT1-MUT 共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。采用雙熒光素酶報告基因檢測實驗證實miR-324-5p 與MAP4K3 之間的靶向關系,結果顯示,與miR-NC 和MAP4K3-WT 共轉(zhuǎn)染組比較,miR-324-5p mimic 和MAP4K3-WT 共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性顯著降低(P＜0.05);與miRNC 和MAP4K3-MUT 共轉(zhuǎn)染組比較,miR-324-5p mimic 和MAP4K3-MUT 共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性變化差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05,圖6)。

圖6 BLACAT1、miR-324-5p 和MAP4K3 之間關系鑒定

3 討論

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)現(xiàn)時通常已經(jīng)處于發(fā)展的終末期,患者的生存質(zhì)量嚴重下降,嚴重威脅著人們的生命健康[9]。隨著醫(yī)學領域的不斷發(fā)展,肝癌患者的生存率雖然有一定的提高,但術后復發(fā)率依然較高,放化療的治療效果也并不理想,肝癌的治療并未得到根本改善[10]。因此,尋找更加經(jīng)濟高效的治療方法對肝癌的治療有著重要的意義。

研究表明,LncRNA 參與了多種疾病尤其是腫瘤發(fā)生發(fā)展的調(diào)控過程,在肝癌治療中的地位不言而喻。有研究證實,LncRNA TPT1-AS1 敲低可抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲[11]。還有研究表明,LncRNA NEAT1 在肝癌組織中表達增加,下調(diào)LncRNA NEAT1 可促進肝癌細胞凋亡,抑制細胞周期,進而抑制肝癌細胞增殖和侵襲[12]。研究發(fā)現(xiàn),LncRNA BLACAT1 在多種癌癥中異常表達,包括宮頸癌、前列腺癌、胃癌、結直腸癌等,例如,有研究表明,敲降LncRNA BLACAT1 顯著抑制宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力[13]。Liao 等[14]研究證實,BLACAT1 在前列腺癌組織中的表達異常升高,敲低BLACAT1 可顯著抑制前列腺癌細胞的增殖和遷移能力。但LncRNA BLACAT1 在肝癌中的表達以及作用機制尚不清楚。本研究通過RTqPCR 實驗檢測,結果顯示在肝癌組織和細胞中BLACAT1 表達增加,經(jīng)細胞轉(zhuǎn)染si-BLACAT1 后,得出敲減BLACAT1 可降低Huh-7 細胞的A450值、侵襲率、遷移率、PCNA、MMP2、MMP9、c-Myc和Cyclin D1 表達,提示敲減BLACAT1 可降低肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。這與上述研究結果一致[13-14]。

LncRNA 的分子功能是多方面的,可充當miRNA 海綿,而miRNAs 進一步通過與靶基因的3′非翻譯區(qū)結合調(diào)節(jié)靶基因的表達,從而控制多種生物學功能。微小RNA (microRNA,miRNA) 是一類含有15～18 個核苷酸的非編碼RNA,在人類癌癥進展中起著至關重要的作用[15]。miR-324-5p 是一種miRNA,其定位于17p13.1,有研究證實,過表達miR-324-5p 在體外顯著抑制了膽囊癌細胞的遷移、侵襲和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,并阻礙了膽囊癌細胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移[16]。大量研究證實LncRNA 可以靶向miRNA 對癌癥細胞起到調(diào)控作用[17]。有研究表明,LINC00491 可通過調(diào)控miR-324-5p/ROCK1 抑制肝癌細胞增殖、克隆和遷移,誘導細胞周期停滯和凋亡[18]。本研究通過雙熒光素酶報告實驗驗證BLACAT1 可靶向調(diào)節(jié)miR-324-5p,通過RT-qPCR檢測組織和細胞中基因表達,得出相比于人正常肝細胞,肝癌細胞BLACAT1 表達升高,miR-324-5p表達顯著降低,進一步說明了其靶向關系,而敲減BLACAT1 可上調(diào)miR-324-5p 表達,且下調(diào)miR-324-5p 減弱了敲減BLACAT1 對肝癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的抑制作用。提示敲減BLACAT1 可能通過上調(diào)miR-324-5p 抑制Huh-7 細胞增殖、遷移和侵襲能力。

本研究還表明MAP4K3 是miR-324-5p 的靶標,進一步的雙熒光素酶實驗驗證了二者的靶向關系。MAP4K3 是絲裂原激活蛋白激酶的一個上游激活因子,其參與細胞增殖、凋亡、周期調(diào)控等多種生物學行為,在多種腫瘤中高表達,加速腫瘤細胞轉(zhuǎn)化[19]。有研究表明,miR-199a-5p 和let-7c 通過靶向MAP4K3 來抑制肝癌細胞的遷移和侵襲[20]。本研究與前人研究趨勢相吻合,MAP4K3 mRNA 在肝癌組織及細胞中顯著增加,而敲減BLACAT1 可下調(diào)MAP4K3 蛋白表達,下調(diào)miR-324-5p 減弱了敲減BLACAT1 對MAP4K3 蛋白表達的抑制作用,表明干擾BLACAT1 通過miR-324-5p/MAP4K3 軸抑制Huh-7 細胞惡性生物學行為。然而本研究尚存在不足之處,僅僅在一種細胞水平上驗證了BLACAT1/miR-324-5p/MAP4K3 軸對肝癌增殖、遷移和侵襲的影響,并未在多種細胞以及制備荷瘤小鼠在動物體內(nèi)水平上進行探討,后續(xù)研究將進行更深一步的探索。

綜上所述,在肝癌組織以及細胞中,BLACAT1、MAP4K3 表達升高,miR-324-5p 表達降低,敲減BLACAT1 可能通過靶向miR-324-5p 并下調(diào)MAP4K3 抑制Huh-7 細胞增殖、遷移和侵襲。BLACAT1/miR-324-5p/MAP4K3 軸可能成為治療肝癌的一種新的靶點。