徐雅潔,劉爭杰,董諾亞

河北港口集團有限公司港口醫(yī)院麻醉科 河北省秦皇島市,066002

小膠質(zhì)細胞(microglia) 是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的免疫細胞[1]。當神經(jīng)中樞受到傷害,感染或有炎癥刺激時,小膠質(zhì)細胞向M1 和M2 型活化[2-3]。M1 型活化中,小膠質(zhì)細胞匯集在受損神經(jīng)細胞周圍形成腦內(nèi)的巨噬細胞,產(chǎn)生大量促炎細胞因子和氧化代謝產(chǎn)物,例如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-1β (interleukin-1β,IL-1β)、NO 和活性氧(reactive oxygen species,ROS) 等炎性因子[4]。敗血癥等全身炎癥狀態(tài)下,小膠質(zhì)細胞吞噬星形膠質(zhì)細胞的末端,損害了血腦屏障功能[5],進而可能損害認知功能、增加腦部疾病風險[6]。

丙泊酚(propofol) 又稱異丙酚,是一種常用麻醉靜脈注射制劑,適用于包括老人和小兒的多種術(shù)前麻醉,具有血流動力學(xué)穩(wěn)定、術(shù)后恢復(fù)時間短、安全等特點[7-8]。之前的研究證實丙泊酚在不同細胞和疾病模型中具有抗氧化[9]和抗炎作用[10]。當前有廣泛的研究表明,除了作為麻醉劑,丙泊酚對多種因素誘導(dǎo)的炎性腦病具有良好的抑制作用[11-12]。如減輕脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的認知損害、神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激[13]。然而,如果丙泊酚僅僅作為一種麻醉劑減輕大腦活動從而減輕神經(jīng)損害,則其廣泛的副作用可能會導(dǎo)致其在神經(jīng)中樞的保護作用失去開發(fā)價值。因此,本研究旨在探討丙泊酚通過調(diào)控相關(guān)核轉(zhuǎn)錄因子-κB (nuclear transcription factor-κB,NF-κB) 通路對活化的小膠質(zhì)細胞炎性因子的影響。

1 材料和方法

1 材料

細胞: 小鼠小膠質(zhì)細胞BV2 細胞購于上海鈺博生物科技有限公司。

主要試劑和儀器: 丙泊酚購自江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司 (國藥準字H20123138,產(chǎn)品批號BB211010);ROS 檢測試劑盒 (S0033M,含DCFH-DA 和活性氧標準對照品) 和一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS) 檢測試劑盒[S0025,含NOS 檢測緩沖液(2 ×)、精氨酸溶液、NADPH和5 mmol/L DAF-FMDA] 購自上海碧云天生物技術(shù)公司;LPS (L8880)、CCK-8 試劑盒(CA1210,含CCK-8 工作液)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)(SEKM-0034)、IL-1β (SEKM-0002) 和 IL-6(SEKM-0007) 酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA) 試劑盒、羊抗兔IgG-HRP (SE134)、ECL 化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(PE0010,含溶液A 和B)、高效RIPA(radio immunoprecipitation assay) 裂解液(R0010)和BCA (bicinchoninic acid) 蛋白濃度測定試劑盒(PC0020) 購自北京索萊寶科技有限公司;兔抗NLRP3 單克隆抗體(1∶1 000,#13158)、兔抗含半胱氨酸-天冬氨酸酶募集結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點狀蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain,ASC) 單克隆抗體(1∶1 000,#13833)、兔抗Caspase-1 單克隆抗體(1∶1 000,#3866)、兔抗GAPDH 單克隆抗體(1∶3 000,#2118)、兔抗IκB 單克隆抗體(1 ∶1 000,#9244)、兔抗P65 單克隆抗體(#8242)、兔抗p-P65 單克隆抗體(#3033) 和兔抗Lamin 單克隆抗體(1∶1 000,#12255) 等均購自美國CST公司;免疫熒光實驗用的Alexa Fluor?488 熒光素偶聯(lián)的山羊抗兔IgG (1∶200,ab150077),普通山羊抗兔 IgG H&L (HRP) 二抗 (1 ∶4 000,ab205718) 和細胞核染料DAPI (ab104139) 購自英國Abcam 公司。SuPerMax 3100 型多功能酶標儀購于上海閃譜生物科技有限公司。SH-Focus 523 超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀購自杭州申花科技。Ixplore 熒光倒置顯微鏡購自奧林巴斯。

1.2 BV2 細胞培養(yǎng)

將BV2 細胞接種到含有10 %胎牛血清、100 U/mL 青霉素和鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液中,48 h 換1 次液,2～3 d 傳1 次代,傳代2 次后用于后續(xù)實驗[14]。

1.3 細胞分組

將BV2 細胞分為5 組: 對照組 (Control)、LPS 模型組(加入100 ng/mL LPS)、丙泊酚低劑量組(prof-L,加入100 ng/mL LPS 與20 μmol/L丙泊酚)、丙泊酚中劑量組(prof-M,加入100 ng/mL LPS 與50 μmol/L 丙泊酚) 和丙泊酚高劑量組(prof-H,加入100 ng/mL LPS 與100 μmol/L 丙泊酚),用于實驗研究。

1.4 CCK-8 檢測

使用CCK-8 試劑盒,按照操作說明,檢測丙泊酚和LPS 處理的BV2 細胞活力。將細胞接種至兩塊24 孔板,每孔1 ×104個細胞,用20、50 和100 μmol/L 的丙泊酚分別處理上述其中1 個24 孔板的細胞,另1 個24 孔板中加入上述丙泊酚后每孔再加100 ng/mL LPS,在37 ℃5 % CO2條件下培養(yǎng)24 h。將10 μL CCK-8 溶液添加至上述孔中,再培養(yǎng)2 h。用多功能酶標儀檢測每個孔在450 nm 處的吸光度[15]。CCK-8 實驗重復(fù)3 次。

1.5 檢測ROS 水平

根據(jù)ROS 檢測試劑盒廠商使用說明進行操作。按照1∶1 000 用無血清培養(yǎng)液稀釋熒光探針DCFHDA,使終濃度為10 μmol/L。細胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA 中,細胞濃度為(1～2) ×107個/mL,37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。每隔3～5 min 顛倒混勻一下,使探針和細胞充分接觸。用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3 次,以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA。使用酶標儀在525 nm 處測定光吸收值,計算BV2 細胞的ROS 水平[16]。

1.6 NOS 活性檢測

按照NOS 檢測試劑盒廠商使用說明操作。把待檢測的細胞或組織培養(yǎng)到96 孔板內(nèi),培養(yǎng)16～24 h 后細胞為80 %～90 %為宜。留一個孔作為沒有細胞的空白對照。使用酶標儀在515 nm 處測定光吸收值,計算BV2 細胞的NOS 活性[17]。

1.7 ELISA 檢測TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量

根據(jù)TNF-α、IL-1β 和IL-6 ELISA 檢測試劑盒廠商使用說明進行操作,使用酶標儀在450 nm 處測定光吸收值,計算BV2 細胞的TNF-α、IL-1β 和IL-6 的含量[18]。

1.8 免疫熒光檢測

細胞接種在蓋玻片上,加藥處理后,用4 %多聚甲醛固定15 min,0.5 % Triton X-100 透化20 min。然后,用正常山羊血清封閉細胞30 min,用P65 抗體(1∶1 600) 4 ℃孵育過夜。隨后,用PBS洗滌細胞,與Alexa Fluor?488 偶聯(lián)的羊抗兔IgG 孵育,并用DAPI 重新染色。在顯微視鏡下觀察斑點。顯微圖像處理如前所述[19]。所有實驗重復(fù)3 次。

1.9 Western 印跡檢測

收集各組細胞,加入RIPA 裂解液(50 mmol/L Tris pH 7.4,150 mmol/L NaCl,1 % NP-40,0.5 %脫氧膽酸鈉,0.1 % SDS) 裂解細胞,離心后取上清,用BCA 法檢測蛋白濃度,在上清中加入凝膠上樣緩沖液。用SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白,并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。用5 %脫脂牛奶封閉2 h,加入兔抗NLRP3、ASC、Caspase-1、GAPDH、IκB、P65、p-P65 和Lamin 單克隆抗體 (各1 ∶1 000),4 ℃下孵育過夜。PBS 洗滌3 次,每次5 min,HRP 標記的羊抗兔IgG (1∶10 000) 二抗孵育1 h。PBS 洗滌3 次,每次15 min。用ECL 化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒在凝膠成像儀觀察這些條帶[19]。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 丙泊酚對LPS 誘導(dǎo)的BV2 細胞活力無影響

本研究用100 ng/mL LPS 活化BV2 細胞后,再用prof-L (20 μmol/L)、prof-M (50 μmol/L) 和prof-H (100 μmol/L) 劑量丙泊酚處理細胞,LPS組和3 個丙泊酚組的BV2 細胞活性與對照組比較,均無細胞活力的顯著影響(P＞0.05)。由此表明,LPS 和3 種濃度丙泊酚對BV2 細胞無毒性(圖1)。

圖1 丙泊酚對LPS 激活的BV2 細胞活力影響

2.2 丙泊酚緩解了LPS 誘導(dǎo)的BV2 細胞炎性樣形態(tài)

顯微觀察發(fā)現(xiàn),與對照組比較,LPS 組的BV2小膠質(zhì)細胞胞體變圓且膨脹,突起變粗,趨向抱團聚集,表明成功建立神經(jīng)系統(tǒng)炎癥模型;prof-H 處理后,對BV2 細胞的形態(tài)表現(xiàn)介于對照組與LPS組之間(圖2)。由此表明,丙泊酚緩解了LPS 活化的BV2 細胞炎性樣形態(tài)。

圖2 丙泊酚對BV2 細胞炎性樣形態(tài)的影響(×200)

2.3 丙泊酚降低LPS 誘導(dǎo)的BV2 細胞炎性因子分泌

對培養(yǎng)基和細胞勻漿的ELISA 檢測中,LPS 活化的BV2 細胞與對照組比較IL-6、IL-1β、TNF-α、ROS 和NOS 的含量顯著增加(P＜0.01);經(jīng)過丙泊酚處理后,IL-6、IL-1β、TNF-α、ROS 和NOS的含量與LPS 組比較,具有劑量依賴性下調(diào),LPS +prof-M 組下調(diào)明顯(P＜0.05),LPS +prof-H 組下調(diào)最顯著(P＜0.01) (圖3)。由此表明,丙泊酚降低了LPS 活化的BV2 細胞的炎性因子的表達水平。

完全租賃模式下，投資主體擁有養(yǎng)老項目的特許經(jīng)營權(quán)，在經(jīng)營期內(nèi)將項目進行出租，由承租的運營主體進行經(jīng)營，運營主體不持有股權(quán)。投資主體的收入主要來自約定的租賃費用，不承擔其他風險，運營主體自負盈虧。

圖3 丙泊酚對BV2 細胞炎癥的影響

2.4 丙泊酚抑制LPS 誘導(dǎo)的NLRP3 炎性小體活化

Western 印跡檢測中,與對照組比較,LPS 組細胞的NLP3、ASC 和Caspase-1 的蛋白表達顯著上調(diào)(P＜0.01);丙泊酚處理后,BV2 細胞的NLP3、ASC 和Caspase-1 的蛋白表達與LPS 組比較,呈劑量依賴性下調(diào),LPS +prof-M 組下調(diào)顯著(P＜0.05),LPS+prof-H 組下調(diào)最明顯 (P＜0.01) (圖4)。由此得出,丙泊酚阻礙了LPS 誘導(dǎo)的BV2 細胞的炎性小體的活化。

圖4 丙泊酚對NLRP3 炎性小體活化的影響

2.5 丙泊酚在BV2 細胞中抑制LPS 誘導(dǎo)的NF-κB

Western 印跡結(jié)果表明,與對照組比較,LPS組的IκB 蛋白表達顯著下降(P＜0.01),而p-P65/P65 的表達比例顯著升高(P＜0.01);經(jīng)過丙泊酚處理后,與LPS 組比較,BV2 細胞的IκB 的蛋白表達呈劑量依賴性升高,LPS +prof-M 組顯著升高(P＜0.05),LPS+prof-H 組升高最為明顯(P＜0.01),而p-P65/P65 的表達比例呈劑量依賴性下降,LPS+prof-M 組顯著下降(P＜0.05),LPS+prof-H 組下降最為明顯(P＜0.01) (圖5A)。

圖5 丙泊酚對NF-κB 信號通路的影響

免疫熒光檢測的結(jié)果表明,相較于對照組,LPS 組每個BV2 細胞中的核定位P65 蛋白顯著性增多(P＜0.01);經(jīng)過丙泊酚處理之后,與LPS組比較,每個BV2 細胞的核定位P65 蛋白呈劑量依賴性減少,LPS+prof-M 組顯著減少 (P＜0.05),LPS+prof-H 組減少最為明顯(P＜0.01)(圖5B)。

上述結(jié)果表明,丙泊酚抑制了LPS 誘導(dǎo)的BV2細胞的NF-κB 通路的活化。

2.6 丙泊酚通過抑制NF-κB 減少BV2 細胞的炎性因子分泌

Western 印跡表明,LPS 組的IκB 表達與對照組比較,顯著降低(P＜0.01);與LPS 組比較,LPS+prof-H 組的IκB 表達顯著升高(P＜0.05),加入NF-κB 通路抑制劑SC75741 的LPS +SC75741組的IκB 表達也顯著升高(P＜0.05);與LPS +SC75741 組比較,LPS +prof-H +SC75741 組的IκB表達顯著升高(P＜0.05)。p-P65/P65 表達趨勢與IκB 的表達呈現(xiàn)相反結(jié)果(圖6A)。在此基礎(chǔ)上,測定炎性因子IL-6 和IL-1β 的含量。結(jié)果顯示,與對照組比較,LPS 組的IL-6 和IL-1β 的含量顯著增多(P＜0.01);與LPS 組比較,LPS +prof-H 組的IL-6 和IL-1β 的含量顯著降低(P＜0.01),LPS +SC75741 組的IL-6 和IL-1β 的含量也顯著降低;與LPS+SC75741 組比較,LPS +prof-H +SC75741 組的IL-6 和IL-1β 的含量顯著降低(P＜0.05) (圖6B、C)。上述結(jié)果進一步證實了丙泊酚通過抑制NF-κB 信號通路減弱活化的小膠質(zhì)細胞的促炎性因子水平。

圖6 丙泊酚通過NF-κB 信號通路減少BV2 細胞炎癥

3 討論

研究表明,激活的NF-κB 增強NLRP3 的表達并增強NLRP3-炎性小體的活性,從而觸發(fā)促炎因子的成熟和分泌[23]。在D-半乳糖胺/脂多糖誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠模型中,丙泊酚顯著抑制NF-κB和NLRP3 炎性小體蛋白,從而抑制炎癥、氧化應(yīng)激和凋亡,并明顯減輕肝損傷[24]。類似的效果也見于LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠模型中[25]。而在缺血再灌注損傷的大腦中動脈閉塞小鼠模型中,丙泊酚阻斷NLRP1-caspase-1-caspase-6 回路,抑制NLRP3 激活和相關(guān)炎性因子釋放,減輕再灌注損傷[26]。我們的研究進一步說明,對于LPS 誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞炎癥,丙泊酚具有良好的控制效果。而且,我們證明了丙泊酚對小膠質(zhì)細胞炎癥的抑制,是通過抑制NF-κB 調(diào)控的NLRP3 炎性體活化實現(xiàn)的。

另一方面,丙泊酚本身也可能誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥。在50 mg/kg 劑量下,丙泊酚顯著誘導(dǎo)的腦組織炎癥,其表現(xiàn)就包括NF-κB 激活,IL-1β,IL-6 等的分泌[27],該過程可能受某些調(diào)控RNA 和促紅細胞生成素等的影響[28]。總體而言丙泊酚在人體內(nèi)具有誘導(dǎo)和拮抗炎癥的雙重作用[29],其作用效果或許取決于病理狀態(tài)以及藥物劑量[30]。而丙泊酚在聯(lián)合其他藥物時,能表現(xiàn)出更顯著的抗炎效果,如與七氟醚聯(lián)用時更有效減輕LPS 誘導(dǎo)的肺損傷[31]。另外,作為一種麻醉劑,如果用以減輕神經(jīng)炎癥,其麻醉效應(yīng)及原有的呼吸循環(huán)抑制、驚厥等副作用可能會比較多,難于直接用于臨床。我們的研究發(fā)現(xiàn),丙泊酚對小膠質(zhì)細胞的炎癥具有良好的抑制作用,而小膠質(zhì)細胞作為中樞巨噬細胞,對腦內(nèi)炎癥的激發(fā)和持續(xù)都有重要的意義[5]。這些提示了丙泊酚的抗炎作用并不依賴其麻醉效應(yīng),具有潛在的臨床價值,其具體機制的進一步闡明,可推動基于丙泊酚的抗敗血癥相關(guān)的炎性腦病的藥物開發(fā)。

綜上所述,LPS 上調(diào)小膠質(zhì)BV2 細胞中的ROS 水平,然后刺激NF-κB P65 進入細胞核,激活NF-κB 信號通路并激活NLRP3 炎性小體表達,最終導(dǎo)致各種促炎因子的表達增加。而丙泊酚逆轉(zhuǎn)了NF-κB 信號通路和NLRP3 炎性小體的激活,抑制了LPS 誘導(dǎo)的BV2 細胞促炎性因子水平。