何宇,袁志鵬,盧志斌,廖景升,賈筠

東莞市人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 廣東省東莞市,523000

乳腺癌(breast cancer,BC) 是全世界女性最常見的惡性腫瘤之一,每年約有25 %的女性惡性腫瘤患者或150 萬女性被診斷出患有乳腺癌[1]。當前針對BC 患者的臨床治療方法包括手術(shù)治療和術(shù)后化療、靶向治療或放射治療[2]?；瘜W療法以不同的分子機制起作用,在初始治療階段協(xié)同作用可以消除大多數(shù)腫瘤細胞[3]。紫杉醇 (paclitaxel,Taxol) 是一類紫杉烷類藥物,是許多癌癥中廣泛使用的化學治療劑,用于治療包括BC 在內(nèi)的各種類型的惡性腫瘤[4]。然而,耐藥性的頻繁發(fā)展(主要是紫杉醇耐藥) 仍然是BC 患者治療的主要障礙,通常會導致患者腫瘤復發(fā)甚至死亡。因此,迫切需要闡明BC 發(fā)展和化學療法耐藥性的分子機制,對尋找乳腺癌中新的生物標志物和開發(fā)新的治療方法具有十分重要的意義。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,LncRNA) 可用作監(jiān)測乳腺癌患者的新的診斷和治療生物標志物[5]。LncRNA是一類長度超過200 個核苷酸的非編碼RNA,在調(diào)節(jié)基因表達和細胞穩(wěn)態(tài)方面具有重要作用[6]。已發(fā)現(xiàn)非編碼RNA HOX 反義基因間RNA (HOX antisense intergenic RNA,HOTAIR) 與多種癌癥的細胞轉(zhuǎn)移密切相關(guān),包括乳腺癌[7]。值得注意的是,HOTAIR 在乳腺癌中的表達增加,這為腫瘤轉(zhuǎn)移和患者死亡提供了強有力的生物標志物[8]。然而,HOTAIR 在BC 中是否參與紫杉醇耐藥仍然未知。MCF-7 是一種常用的乳腺癌細胞系,已被多個研究小組推廣了40 多年,具有非常好的研究背景,包括分子譜、增殖、遷移、侵襲、球狀體形成、其參與血管生成和淋巴管生成及其與間充質(zhì)干細胞的相互作用[9]?；诖?本研究旨在探討LncRNA HOTAIR 調(diào)控乳腺癌細胞紫杉醇耐藥的潛在分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

對照RNA、miRNA、ATP 結(jié)合盒亞家族C 成員5 (ATP binding cassette subfamily C member 5,ABCC5) 的小干擾RNA、HOTAIR 以及過表達質(zhì)粒均由北京擎科設計合成。乳腺癌細胞系MCF7購自北京賽博潤特科技發(fā)展中心 (貨號:636315)。DMEM 培養(yǎng)基購自昆明皇寶商貿(mào)有限公司 (貨 號: D917523-500 mL)。Lipofectamine 3000 試劑轉(zhuǎn)染購自北京綠源大德生物科技有限公司(貨號: L3000015)。紫杉醇購自北京百靈威科技有限公司(貨號: 985203)。MTT 細胞活力測定試劑盒購自上海邦景實業(yè)有限公司(貨號:BJ-01 X6322)。細胞凋亡檢測試劑盒購自北京金優(yōu)科技有限公司(貨號: MF123-02)。細胞周期分析試劑盒購自上海朝瑞生物科技有限公司(貨號: GMS10137.2)。RNasin 購自廣州市左克生物科技發(fā)展有限公司(貨號: R2011)。TRIzol 試劑購自廣州翔博生物科技有限公司 (貨號: XBRN01)。ReverTra Ace qPCR RT Kit 購自北京沃格東方科技有限公司(貨號: FSQ-101 C)。THUNDERBIRD SYBR?qPCR Mix 購自北京百靈克生物科技有限責任公司 (貨號: QPS-201)。ABCC5抗體購自廣州偉然生物科技有限公司 (貨號:DF7149-50)。3-磷酸甘油酯脫氫酶 (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH) 抗體購自索森 (廣州) 生物科技有限公司 (貨號:S109002)。雙熒光素酶檢測試劑盒購自廣州翔博生物科技有限公司(貨號: E1910)。

1.2 細胞培養(yǎng)

乳腺癌細胞系MCF7 在添加了10 % FBS 和100 U/mL 青霉素/鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中,并在5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在90 %的匯合處收集細胞,48～72 h 更換一次培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染前,將1 ×106個乳腺癌細胞在6 孔板中用2 mL 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,直到它們達到90 %融合。將對照RNA、miRNA、siABCC5、HOTAIR 用Lipofectamine 3000試劑轉(zhuǎn)染到MCF7 細胞系中,并按照說明在Opti-MEM 無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。根據(jù)Yang 等[10]的方法構(gòu)建紫杉醇耐藥乳腺癌細胞,MCF7 細胞隨著連續(xù)傳代以逐漸增加紫杉醇的濃度,最終處理25 代。得到的具有紫杉醇抗性的MCF7 細胞系,稱為MCF7/TR。本研究所有實驗處理乳腺癌的紫杉醇濃度為20 μmol/L。

1.3 細胞增殖水平的測定

使用MTT 細胞活力測定試劑盒檢測細胞增殖水平。將轉(zhuǎn)染的細胞接種在96 孔板中(200 μL,3 ×103個細胞/孔)。每孔加入10 μL MTT (5 mg/mL) 并繼續(xù)孵育4 h,然后將沉淀溶解在二甲基亞砜中。在微孔板分光光度計下在490 nm 處測量吸光度。

1.4 細胞凋亡水平的測定

采用流式細胞儀檢測Annexin V 和碘化丙啶的細胞凋亡。將細胞接種到組織培養(yǎng)瓶中以達到大約50 %的融合,使其附著12 h,然后用不同濃度的紫杉醇處理48 h。用紫杉醇(20 nmol/L) 處理細胞48 h。按照制造商的方案的指示,使用膜聯(lián)蛋白V-FITC 綴合的細胞凋亡檢測試劑盒和碘化丙啶。胰蛋白酶消化后收獲細胞。流式細胞儀分析并評估每個樣品。

1.5 細胞周期的測定

細胞周期分析試劑盒用于檢測細胞周期進程。不同處理后,通過離心收集的細胞在預冷的PBS中洗滌。每個樣品重復3 次。通過流式細胞儀獲取數(shù)據(jù),并通過FlowJo-V10 軟件進行分析。

1.6 細胞內(nèi)紫杉醇濃度的測定

使用靶向代謝質(zhì)譜檢測細胞內(nèi)紫杉醇濃度。用紫杉醇處理乳腺癌細胞2 h 后,收獲細胞培養(yǎng)基以測試細胞外藥物濃度。徹底洗滌后通過超聲勻漿制備細胞,500 μL 上清液與甲醇混合。樣品在真空干燥器中干燥并重新溶解在200 μL HPLC 級甲醇中。使用與線性阱四極桿-Orbitrap Velos Pro 質(zhì)譜儀在線耦合的UltiMate 3000 UPLC 系統(tǒng),通過液相色譜(LC)/電噴霧電離(ESI) -串聯(lián)MS 測量藥物。

1.7 轉(zhuǎn)錄組測序

將以下4 組MCF/TR 細胞進行轉(zhuǎn)錄組測序:①敲低對照組;②敲低HOTAIR 組;③轉(zhuǎn)染純化對照組;④轉(zhuǎn)染Bio-HOTAIR 后純化HOTAIR 相互作用RNA 組。每組設3 個重復,提取總RNA,送上海邁博生物醫(yī)藥科技有限公司使用Illumina HiSeqTM2500 測序儀進行轉(zhuǎn)錄組測序。數(shù)據(jù)通過Majorbio Cloud Platform 的免費在線平臺進行分析。

1.8 純化HOTAIR 相互作用RNA

將pcDNA3-strep-MS2 和pcDNA3-strep-HOTAIR共轉(zhuǎn)染到MCF-TR 細胞中,2 d 后收集細胞。將約1 ×107個細胞溶解在加80 U/mL RNasin 的裂解緩沖液中。向每個結(jié)合反應管中加入50 μL ANTIstrep 磁珠并孵育4 h。在裂解緩沖液中洗滌珠子6次。隨后使用Glycine-HCI (pH=2.0) 洗脫與HOTAIR 和與HOTAIR 相互作用的RNA。

1.9 RNA 抽取與實時熒光定量PCR

用TRIzol 試劑提取乳腺癌細胞的總RNA,在qRT-PCR 之前,用ReverTra Ace qPCR RT Kit 將200 ng 提取的RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用THUNDERBIRD SYBR?qPCR Mix 和LightCycler 480 實時PCR 系統(tǒng)進行定量PCR。GAPDH和U6 基因用作內(nèi)源對照基因,用于標準化靶基因的表達。一式三份分析每個樣品。熱循環(huán)程序包括在94 ℃保持2 min;然后是30 個循環(huán),即94 ℃30 s、56 ℃30 s和72 ℃60 s。然后收集熔解曲線數(shù)據(jù)以驗證PCR特異性和引物二聚體的存在。引物如下: HOTAIR正義鏈為5′-GGTAGAAAAAGCAACCACGA-AGC-3′,HOTAIR 反義鏈為 5′-ACATAAACCTCTGTCTGTGAGTGCC-3′;miR-130a-3p 正義鏈為5′-CGCCGCAGTGCAATGTTAAA-3′,miR-130a-3p 反義鏈為5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′;ABCC5 正義鏈為5′-TTTTCAGGATGGCTGTATTCT-3′,ABCC5 反義鏈為5′-TGGCTTCTTTTCCAGTATGC-3′;GAPDH正義鏈為5′-GTCAGGATCCACTCATCACG-3′,GAPDH 反義鏈為5′-GATCGGACTTACGGACTCACATC-3′;U6 正義鏈為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,U6 反義鏈為5′-AACGCTTCACGAATTTGC-GT-3′。

1.10 免疫印跡

通過刮擦或使用非酶細胞解離液收獲細胞,在PBS 中洗滌2 次。通過在蛋白質(zhì)提取緩沖液中收獲細胞制備總細胞裂解物,并使用BCA 蛋白質(zhì)測定試劑盒分析蛋白質(zhì)濃度。通過SDS-PAGE 分離等量的蛋白質(zhì),轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜,用5 %脫脂牛奶在TBST (Tris 緩沖鹽水,pH 7.4 和0.05 %Tween 20) 中封閉,并與抗ABCC5 和GAPDH 在4 ℃下過夜。探測膜的GAPDH 水平作為上樣對照。接下來,將膜與堿性磷酸酶綴合的山羊抗小鼠IgG或山羊抗兔IgG 在室溫下孵育1 h。最后,使用具有化學發(fā)光底物的抗兔或抗小鼠堿性磷酸酶偶聯(lián)二抗進行可視化。

1.11 熒光素酶報告實驗

用100 ng 質(zhì)粒和200 nmol/L miR-130a-3p mimics、ABCC5-3′UTR-WT 或ABCC5-3′UTR-MT 對照轉(zhuǎn)染細胞(1 ×105個/mL)。2 d 后,用80 μL 1 ×Passive Lysis Buffer 裂解細胞,并通過雙熒光素酶測定進行測試。通過雙熒光素酶測定系統(tǒng)評估熒光素酶活性。

1.12 統(tǒng)計學分析

使用 GraphPad Prism 6.0 分析統(tǒng)計數(shù)據(jù)。Student’st檢驗用于評估個體組之間的差異。

2 結(jié)果

2.1 HOTAIR 在紫杉醇耐藥乳腺癌細胞中高表達

篩選出乳腺癌紫杉醇抗性細胞系(MCF7/TR細胞),研究乳腺癌細胞中紫杉醇抗性的機制。將這些細胞暴露于紫杉醇中測試MCF7/TR 細胞以及親代細胞的抗性。紫杉醇處理可以顯著抑制親本細胞的增殖和誘導細胞凋亡,但不能抑制抗性細胞(圖1A、B)。紫杉醇處理可在MCF7 細胞中顯著誘導G1期停滯,但在MCF7/TR 細胞中則不然(圖1C)。這些數(shù)據(jù)表明,已成功篩選出紫杉醇抗性細胞(MCF7/TR 細胞)。同時,檢測了MCF7/TR 細胞以及親代細胞細胞群中LncRNA HOTAIR 的表達水平,發(fā)現(xiàn)MCF7/TR 細胞中HOTAIR 的表達量高于親代細胞細胞群(圖1D)。

圖1 HOTAIR 在紫杉醇耐藥乳腺癌細胞中高表達

2.2 HOTAIR 影響乳腺癌細胞紫杉醇耐藥

敲低HOTAIR 后,紫杉醇處理可以顯著抑制的MCF7/TR 細胞的增殖和誘導細胞凋亡,并且誘導MCF7/TR 細胞停滯于G1期(圖2A～C)。

圖2 HOTAIR 影響乳腺癌細胞紫杉醇耐藥

與其親代細胞相比,MCF7/TR 細胞內(nèi)紫杉醇的濃度明顯的降低,然而敲低HOTAIR 之后,MCF7/TR 細胞內(nèi)紫杉醇的濃度明顯的升高 (圖2D)。

2.3 HOTAIR 調(diào)控miR-130a-3p 影響乳腺癌細胞紫杉醇耐藥

將以下4 組MCF/TR 細胞進行轉(zhuǎn)錄組測序:①敲低對照組;②敲低HOTAIR 組;③轉(zhuǎn)染純化對照組;④轉(zhuǎn)染Bio-HOTAIR 后純化HOTAIR 相互作用RNA 組,同時滿足敲低HOTAIR 后升高并且與HOTAIR 有相互作用的miRNA 有25 個 (圖3A)。使用miRNA mimics 過表達上述25 個miRNA后,發(fā)現(xiàn)過表達miR-130a-3p 時MCF7/TR 細胞內(nèi)紫杉醇濃度明顯升高(圖3B)。相比于親代細胞細胞群,MCF7/TR 細胞中miR-130a-3p 表達水平降低(圖3C)。并且使用實時熒光定量PCR 能夠檢測到miR-130a-3p 與HOTAIR 的相互作用 (圖3C)。敲 低HOTAIR 后,MCF/TR 細胞中miR-130a-3p 的表達水平升高(圖3C)。過表達miR-130a-3p 后,紫杉醇處理可以顯著抑制的MCF7/TR細胞的增殖和誘導細胞凋亡,并且誘導MCF7/TR細胞停滯于G1期(圖4A～C)。

圖3 HOTAIR 對miR-130a-3p 的調(diào)控

圖4 miR-130a-3p 影響乳腺癌細胞紫杉醇耐藥

2.4 miR-130a-3p 調(diào)控ABCC5 影響乳腺癌細胞紫杉醇耐藥

過表達或敲低miR-130a-3p 后MCF7/TR 細胞進行轉(zhuǎn)錄組測序,發(fā)現(xiàn)多種基因被調(diào)節(jié)(圖5A)。使用過表達質(zhì)粒過表達上述基因后,發(fā)現(xiàn)過表達ABCC5 時MCF7/TR 細胞內(nèi)紫杉醇濃度明顯升高(圖5B)。同時,miR-130a-3p 可以靶向ABCC5 mRNA 的3′端非翻譯區(qū) (圖5C)。過表達miR-130a-3p 后,ABCC5 的表達水平下降;敲低miR-130a-3p 后,ABCC5 的表達水平上升(圖5D、圖6A、B)。敲低ABCC5 后,紫杉醇處理可以顯著抑制MCF7/TR 細胞的增殖和誘導細胞凋亡,并且誘導MCF7/TR 細胞停滯于G1期(圖6C～E)。

圖5 miR-130a-3p 對ABCC5 的調(diào)控

圖6 ABCC5 影響乳腺癌細胞紫杉醇耐藥

3 討論

越來越多的研究發(fā)現(xiàn),LncRNA 和miRNA 的異常表達可能通過調(diào)節(jié)某些靶點而在各種人類癌細胞的紫杉醇敏感性中起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)LncRNA HOTAIR 通過miR-130a-3p/ABCC5 軸減少了紫杉醇耐藥細胞中紫杉醇細胞內(nèi)水平,促進了乳腺癌細胞對紫杉醇的耐藥。HOTAIR-miR-130a-3p 的相互作用促進ABCC5 表達所致的紫杉醇耐藥,可能在乳腺癌的治療中具有巨大的潛力。

紫杉醇是一類紫杉烷類藥物,是許多癌癥中廣泛使用的化學治療劑,然而腫瘤細胞對紫杉醇藥物產(chǎn)生的耐藥性是臨床上應用紫杉醇治療BC 的一個主要障礙[11]。導致這種耐藥性現(xiàn)象的幾種機制包括非編碼RNA 調(diào)控的影響等[12-13]。本研究通過紫杉醇連續(xù)處理多代MCF7 細胞獲得了MCF7/TR 細胞,并發(fā)現(xiàn)MCF7/TR 細胞中HOTAIR 的表達量高于親代細胞。與其親代細胞相比,MCF7/TR 細胞內(nèi)紫杉醇濃度明顯降低,而敲低HOTAIR 后MCF7/TR 細胞內(nèi)紫杉醇濃度升高。因此,HOTAIR可能通過減少紫杉醇的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運或者增加紫杉醇的胞外轉(zhuǎn)運來幫助BC 抵抗紫杉醇治療。

LncRNA 定位于細胞質(zhì)或細胞核中,可以與miRNA、mRNA、RNA 結(jié)合蛋白相互作用并調(diào)控生理功能(包括腫瘤細胞的耐藥性)[14-17]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-130a-3p 與HOTAIR 存在相互作用。miRNA通常與目標mRNA 的3′UTR 堿基配對,從而減少mRNA 的翻譯或引起mRNA 轉(zhuǎn)錄物的降解[18-21]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-130a-3p 可以靶向ABCC5 mRNA的3′端非翻譯區(qū)。過表達ABCC5 時MCF7/TR 細胞內(nèi)紫杉醇濃度明顯升高。ABCC5 是ABC 超家族的一員,也是一種ATP 依賴性轉(zhuǎn)運蛋白,與治療乳腺癌的藥物培美曲塞的化療耐藥性顯著相關(guān)[22]。在耐藥癌細胞中,存在藥物外排泵蛋白的過表達,該蛋白由ATP 結(jié)合盒 (ABC) 超家族成員組成[23]。ABCC5 可能是通過增加紫杉醇由胞內(nèi)向胞外的轉(zhuǎn)運而減少了胞內(nèi)紫杉醇的濃度,從而促進BC 對紫杉醇的耐藥性。研究發(fā)現(xiàn),Circ_ 0007031通過調(diào)節(jié)miR-133b/ABCC5 軸增強腫瘤細胞對5-氟尿嘧啶的耐藥性[24-25]。因此,ABCC5 可能是多種腫瘤細胞對不同方案化療耐藥性的關(guān)鍵因子。此外,LncRNA-miRNA 的相互作用通過沉默靶蛋白編碼基因來引發(fā)致癌或抑癌功能,在乳腺癌的治療中具有巨大的潛力。