張若男，呂雷

（衛(wèi)仕寵物營(yíng)養(yǎng)研究院，安徽蕪湖 241200）

貓的尿路感染是指由細(xì)菌感染所引起的泌尿道炎癥性疾病，包括腎盂腎炎、膀胱炎和尿道炎等[1]。 尿路細(xì)菌感染會(huì)使尿液中銨離子濃度增加，促進(jìn)礦物質(zhì)鹽類析出形成結(jié)晶，從而形成尿路結(jié)石[2]。尿路感染與尿路結(jié)石是寵物貓多發(fā)疾病，伴有排尿困難、血尿等癥狀[3]。大腸桿菌（Escherichia coli）是最常見的誘發(fā)貓尿路感染的病原菌，對(duì)大腸桿菌具有抗菌活性的抗生素能夠有效控制貓尿路感染的發(fā)生[4]。 甘露糖是一種廣泛存在于自然界多種植物中的糖類，在哺乳動(dòng)物血漿中的濃度為50～100 μM[5]。有研究表明，甘露糖可以代替抗生素用于治療人類的復(fù)發(fā)性尿路感染，發(fā)揮卓越的抗感染作用[6]。 西方國(guó)家也將甘露糖用作人類保健品，用以預(yù)防尿路感染，保護(hù)泌尿系統(tǒng)健康[7]。 鑒于甘露糖對(duì)人類尿路感染的預(yù)防和治療作用，本研究著眼于目前動(dòng)物臨床上貓尿路感染疾病多發(fā)的情況，探究了不同濃度的甘露糖對(duì)貓尿路感染病原菌（大腸桿菌）增殖活性的影響，并以貓腎上皮細(xì)胞系（CRFK）為載體，探究了不同濃度的甘露糖對(duì)大腸桿菌感染的貓腎上皮細(xì)胞的保護(hù)作用，以期為貓尿路感染的治療和預(yù)防提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系及菌株

貓腎上皮細(xì)胞（CRFK，PWE-CT001）購(gòu)于大連美侖生物技術(shù)有限公司，大腸桿菌（HBJZ087）購(gòu)于青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 材料與試劑

DMEM 高糖細(xì)胞培養(yǎng)基（MA0212-2）、細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)PBS （MA0015-2）、 青霉素/鏈霉素滅菌溶液（MA0110-1）購(gòu)于大連美侖生物技術(shù)有限公司，胎牛血清 （10100147） 購(gòu)于 Gibico 公司， 氯化鈉（10019308）、甲醇（10014108）購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，EDTA（0.25%）-胰蛋白酶（40127ES60）購(gòu)于上海翌圣生物科技有限公司，甘露糖（M2069）購(gòu)于默克公司，改良吉姆薩染色液（C0131）購(gòu)于碧云天生物。

1.3 主要儀器

主要儀器設(shè)備見表1。

表1 主要儀器一覽表

1.4 試劑配制

細(xì)胞完全培養(yǎng)基： 在DMEM 高糖細(xì)胞培養(yǎng)基中添加10%的胎牛血清和1%的青霉素/鏈霉素滅菌溶液。LB 液體細(xì)菌培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g，加純凈水定容至1 L。

1.5 試驗(yàn)分組與處理

1.5.1 大腸桿菌增殖試驗(yàn)。 將大腸桿菌接種至LB 液體培養(yǎng)基中，設(shè)置如下分組。 對(duì)照組：不含甘露糖的LB 培養(yǎng)基；5 mM 甘露糖處理組：含5 mM 甘露糖的LB 培養(yǎng)基；10 mM 甘露糖處理組：含10 mM 甘露糖的LB 培養(yǎng)基。 將上述3 組大腸桿菌培養(yǎng)液置于臥式光照振蕩細(xì)菌培養(yǎng)箱內(nèi)，37 ℃、250 r/min 培養(yǎng)16 h。 重復(fù)上述試驗(yàn)3 次。

1.5.2 大腸桿菌感染試驗(yàn)。 將CRFK 細(xì)胞接種于6 孔板中，在含5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，將培養(yǎng)基更換為不含抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)基并設(shè)置如下分組。 對(duì)照組：細(xì)胞培養(yǎng)基正常培養(yǎng)；大腸桿菌感染組:細(xì)胞培養(yǎng)基中加入大腸桿菌（OD600=0.5）；5 mM 甘露糖處理-大腸桿菌感染組：培養(yǎng)基中含5 mM 甘露糖， 加入大腸桿菌攻毒1 h（OD600=0.5）；10 mM 甘露糖處理-大腸桿菌感染組：培養(yǎng)基中含10 mM 甘露糖， 加入大腸桿菌攻毒1 h（OD600=0.5）。 重復(fù)上述試驗(yàn)3 次。

1.6 試驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)

1.6.1 大腸桿菌增殖試驗(yàn)。 將培養(yǎng)16 h 后的各組大腸桿菌培養(yǎng)液充分搖勻，分別取100 μL 置于96 孔板中，通過酶標(biāo)儀檢測(cè)OD600值以反映菌液濃度。

1.6.2 大腸桿菌感染試驗(yàn)。CRFK 細(xì)胞培養(yǎng)過程中，在倒置顯微鏡下觀察并拍攝細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行大腸桿感染菌后，使用PBS 清洗3 遍，加入甲醇固定15 min， 然后使用改良吉姆薩染色液染色30 min 并清洗干凈，在倒置顯微鏡下觀察并拍攝細(xì)胞形態(tài)與大腸桿菌感染情況， 最后使用Image J 軟件對(duì)上述拍攝圖片中的大腸桿菌數(shù)目與細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，通過大腸桿菌數(shù)/CRFK 細(xì)胞數(shù)的比值來(lái)反映大腸桿菌感染情況。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用GraphPad Prism 8 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示；采用單因素方差分析對(duì)各組結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析，***表示P<0.001，****表示P<0.000 1。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘露糖對(duì)大腸桿菌增殖的影響

如圖1 所示，經(jīng)過16 h 的搖菌培養(yǎng)后，相比于對(duì)照組，5 mM 甘露糖處理組和10 mM 甘露糖處理組的大腸桿菌菌液濃度均極顯著降低（P<0.001），表明甘露糖對(duì)大腸桿菌的增殖具有抑制作用。

圖1 甘露糖對(duì)大腸桿菌增殖的影響

2.2 甘露糖對(duì)大腸桿菌感染的CRFK 細(xì)胞的影響

如圖2 和圖3 所示， 未受大腸桿菌感染的CRFK細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，但經(jīng)過1 h 的感染試驗(yàn)，與對(duì)照組相比，大腸桿菌感染組的細(xì)胞發(fā)生了明顯的細(xì)菌感染。 如圖4 所示，5 mM 甘露糖處理-大腸桿菌感染組和10 mM 甘露糖處理-大腸桿菌感染組的細(xì)胞被細(xì)菌感染的程度極顯著降低（P<0.000 1），其中10 mM甘露糖的效果更佳，表明甘露糖能夠極顯著抑制大腸桿菌對(duì)CRFK 細(xì)胞的感染（P<0.000 1）。

圖2 未受感染的CRFK 細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)

圖3 大腸桿菌對(duì)CRFK 細(xì)胞的感染

圖4 大腸桿菌數(shù)/CRFK 細(xì)胞數(shù)

3 討論

尿路感染與結(jié)石疾病不僅給貓帶來(lái)排尿障礙與疼痛，也會(huì)嚴(yán)重影響貓的精神狀態(tài)與食欲，導(dǎo)致其免疫力下降引發(fā)更嚴(yán)重的疾病[8]。 動(dòng)物臨床上對(duì)于貓尿路感染與尿石癥的治療主要是通過抗感染藥物治療和溶解療法，對(duì)于病癥嚴(yán)重者會(huì)采用手術(shù)治療[9-10]。 雖然動(dòng)物臨床上對(duì)于貓尿路感染與尿石癥已經(jīng)有了較完善的治療策略，但是在此過程中貓仍無(wú)法避免疾病帶來(lái)的痛苦與治療的恐懼，因此預(yù)防該類疾病的發(fā)生能夠改善寵物貓的生存質(zhì)量。

甘露糖在維護(hù)人類泌尿系統(tǒng)健康方面的作用已經(jīng)獲得了認(rèn)可[6-7]。本研究通過試驗(yàn)探究了甘露糖在貓泌尿系統(tǒng)健康中的潛在作用，發(fā)現(xiàn)甘露糖能夠抑制貓尿路感染的病原菌——大腸桿菌的增殖，并抑制大腸桿菌對(duì)貓腎上皮細(xì)胞的感染。 在小鼠體內(nèi)的試驗(yàn)表明，以20%（m/V）的甘露糖水溶液作為飲用水，不會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)小鼠的正常生長(zhǎng)發(fā)育[11]，這表明甘露糖對(duì)動(dòng)物具有較高的安全性。 因此，甘露糖有望作為貓的食品添加劑或保健品，用以預(yù)防尿路感染，保持泌尿系統(tǒng)健康。另外，蔓越莓富含甘露糖與多種維生素。蔓越莓提取物能夠抑制人類尿路上皮細(xì)胞的感染[12]，同時(shí)蔓越莓提取物與甘露糖聯(lián)合應(yīng)用能夠促進(jìn)抗生素對(duì)急性尿路感染治療的敏感性[13]。 因此使用甘露糖作為食品添加劑有望對(duì)保持寵物貓泌尿系統(tǒng)健康產(chǎn)生一定的積極作用。