孫夢楚，陸亮宇，申曉林，孫新曉，王佳，袁其朋

（北京化工大學(xué)化工資源有效利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京軟物質(zhì)科學(xué)與工程高精尖創(chuàng)新中心，北京 100029）

合成生物學(xué)是一門發(fā)展迅猛的前沿交叉學(xué)科，從早期僅是探究自然界中生命體合成化合物能力的認(rèn)識階段到分子生物學(xué)技術(shù)快速發(fā)展，從基因?qū)用鎸?shí)現(xiàn)生命體局部功能改造與優(yōu)化的改造階段再到創(chuàng)造新“價(jià)值”生物系統(tǒng)的創(chuàng)造階段［1］。經(jīng)過多年積累和發(fā)展，合成生物學(xué)已經(jīng)形成了相對成熟的理論系統(tǒng)，即以工程化思想為核心，設(shè)計(jì)和構(gòu)建具有目標(biāo)功能的人工生命系統(tǒng)。目前，合成生物學(xué)已廣泛應(yīng)用到在醫(yī)藥、化工、農(nóng)業(yè)、食品、化妝品及綠色環(huán)保等領(lǐng)域。利用合成生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建和改造微生物細(xì)胞工廠，可以實(shí)現(xiàn)高附加值化學(xué)品、醫(yī)藥活性成分、石油燃料等產(chǎn)品的綠色生物合成［2-6］。目前，微生物細(xì)胞工廠開發(fā)依賴于“設(shè)計(jì)-構(gòu)建-測試-學(xué)習(xí)”的DBTL（Design-Built-Test-Learn）循環(huán)［7］。但由于缺乏理性設(shè)計(jì)，當(dāng)前仍需長期、反復(fù)的人工實(shí)驗(yàn)試錯。

基于理性合成途徑設(shè)計(jì)與非理性的進(jìn)化工程相結(jié)合的方法，建立一套高效微生物工廠設(shè)計(jì)和構(gòu)建策略是重要的研究方向。由于微生物代謝網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性及基因型和表型偶聯(lián)中“生命暗物質(zhì)”大量存在，理性方式（如解析生理機(jī)制、構(gòu)建基因操作體系、重構(gòu)及改造代謝途徑等）設(shè)計(jì)和構(gòu)建微生物工廠耗時費(fèi)力，有時甚至無效［8］。通過非理性的進(jìn)化工程方式，利用生物信息學(xué)、代謝組學(xué)等分析方法從整體水平對復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控機(jī)制中的未知信息進(jìn)行挖掘和學(xué)習(xí)，實(shí)現(xiàn)原理標(biāo)準(zhǔn)化，從而高效指導(dǎo)微生物工廠的設(shè)計(jì)和構(gòu)建［9］。具體而言，首先通過多種誘變方式構(gòu)建一個非特異性的突變庫；隨后以特定性狀作為篩選指標(biāo)建立高通量篩選方法，利用先進(jìn)的高通量篩選技術(shù)和設(shè)備，高效、快速篩選高產(chǎn)菌株；通過基因組、轉(zhuǎn)錄組、代謝組等數(shù)據(jù)處理方法比較分析高產(chǎn)菌株與野生型菌株之間的區(qū)別，尋找突變體高產(chǎn)的原因（功能基因變化、代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控變化、生命暗物質(zhì)挖掘等）；最后將誘導(dǎo)高產(chǎn)的原理應(yīng)用到其他菌株，理性指導(dǎo)目標(biāo)化合物的生產(chǎn)，從而實(shí)現(xiàn)原理普適化。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)和基因編輯技術(shù)的發(fā)展，突變方法從蛋白質(zhì)到代謝通路再到基因組水平不斷迭代創(chuàng)新，致使突變體庫的規(guī)模巨大，增加了突變文庫的篩選難度。為了加快DBTL循環(huán)，測試階段需要與文庫規(guī)模相匹配的高通量篩選技術(shù)。微孔板（microtiter plates， MTP）作為傳統(tǒng)篩選方法，利用微升培養(yǎng)液中代謝物的光學(xué)變化進(jìn)行檢測分析，滿足文庫中變體重復(fù)檢測、精準(zhǔn)測定，同時也具備胞外代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株篩選的能力［10］。但該篩選方法耗時且通量低?；谖⒖装遄詣踊ぷ髡敬罱ê芎玫亟鉀Q了微孔板篩選通量低的局限性［11］。然而，自動化設(shè)備昂貴、平臺運(yùn)行成本高，導(dǎo)致自動化工作站不具有普適性［12-14］。目前，高通量篩選主要方法是熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)，它可以達(dá)到每秒約10萬個細(xì)胞的篩選通量。然而，熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)（FACS）應(yīng)用僅限于檢測細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)產(chǎn)物相關(guān)的熒光信號或與膜結(jié)合的代謝物熒光信號，不能用于細(xì)胞外代謝物的細(xì)胞篩選［15-16］。液滴微流控技術(shù)很好地解決了這一問題，該技術(shù)將單細(xì)胞包埋和培養(yǎng)在單分散、皮升液滴中，每個液滴作為單獨(dú)的微反應(yīng)器［17］。這種區(qū)室化將胞外分泌產(chǎn)物與單細(xì)胞控制在液滴中，實(shí)現(xiàn)基因型與表型的偶聯(lián)［18］。液滴微流控技術(shù)在微生物細(xì)胞選育及酶定向進(jìn)化領(lǐng)域的應(yīng)用，對龐大突變文庫的篩選，篩選通量可達(dá)107個/天，有效提高了微生物工業(yè)菌株開發(fā)和酶定向進(jìn)化工作效率，而且在實(shí)驗(yàn)成本方面也表現(xiàn)出極大優(yōu)勢，實(shí)現(xiàn)篩選通量高、成本消耗低的微生物細(xì)胞工廠開發(fā)及高活性酶變體篩選［19-20］。

本文結(jié)合具體案例綜述了高通量篩選技術(shù)在工業(yè)微生物育種和酶定向進(jìn)化領(lǐng)域應(yīng)用的主要進(jìn)展，首先介紹近幾年興起的微孔板高通量篩選自動化工作站及目前主流篩選技術(shù)——熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)在高通量篩選中的原理和應(yīng)用。然后，重點(diǎn)介紹液滴微流控技術(shù)的組成和特點(diǎn)，并介紹近年來FADS在工業(yè)微生物育種和酶定向進(jìn)化領(lǐng)域應(yīng)用案例。最后介紹目標(biāo)分子與熒光信號偶聯(lián)常見策略，并簡單介紹目前國內(nèi)外基于液滴微流控技術(shù)高通量篩選裝備的研發(fā)情況。

1 基于微孔板的高通量篩選自動化工作站

微孔板篩選是一種傳統(tǒng)且直接的高通量篩選方法。篩選要求是在微孔板容器中直接或間接測量目標(biāo)代謝物或蛋白質(zhì)特性，最常見的檢測方式是通過分光光度法或熒光法［21］。通常實(shí)驗(yàn)流程如下：構(gòu)建突變菌庫；挑選單個菌落接種到微孔板中培養(yǎng)；在適宜的生長條件下孵育菌株及蛋白質(zhì)表達(dá)，最終將每個培養(yǎng)物的上清液或細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移到新的微孔板以檢測與產(chǎn)物、蛋白質(zhì)功能相關(guān)的光學(xué)特性?？傮w而言，微孔板篩選是早期高通量篩選的常用方法，雖然微孔板篩選精準(zhǔn)性、可重復(fù)性高于其他篩選技術(shù)，但其耗時費(fèi)力且通量低，無法適配龐大突變文庫的篩選工作。

近些年，基于微孔板自動化工作站的搭建完全模擬人工操作，將常規(guī)操作利用自動化設(shè)備代替，并結(jié)合機(jī)械臂完成中間步驟從而實(shí)現(xiàn)整體自動化（圖1）。一般實(shí)驗(yàn)流程為：利用全自動培養(yǎng)基分裝系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)600～800皿/h培養(yǎng)基分裝；采用QPix系列等菌種自動挑選設(shè)備實(shí)現(xiàn)平板菌落向微孔板自動轉(zhuǎn)移，該設(shè)備每小時挑取至少2000菌落，在挑取過程中能實(shí)現(xiàn)快速精準(zhǔn)挑取，避免交叉污染風(fēng)險(xiǎn)；利用多通道全自動移液工作站，可實(shí)現(xiàn)每批次多達(dá)300塊微孔板精準(zhǔn)移液操作。自動化工作站的優(yōu)點(diǎn)為完全模擬人工操作、篩選模型易于構(gòu)建而且篩選通量大幅提高，其篩選通量可達(dá)到每天103～105克隆。例如，研究人員結(jié)合自動化設(shè)備建立解脂耶氏酵母過量生產(chǎn)α-酮戊二酸的高通量篩選工藝［22］。實(shí)驗(yàn)中使用一系列pH指示劑用于平板預(yù)篩選和微孔板篩選。在高通量篩選過程，使用菌株自動挑選設(shè)備Qpix460從2880個突變體中成功篩選出1-C6突變體。該突變菌在500 mL三角瓶中產(chǎn)量比野生型提高了51.8%［22］。除此之外，基于微孔板高通量篩選自動化工作站已經(jīng)成功用于多種工業(yè)微生物菌株和酶元件篩選工作［23-25］。但自動化裝置和機(jī)械臂引入增加實(shí)驗(yàn)經(jīng)濟(jì)成本，并且由于自動化設(shè)備維護(hù)費(fèi)用高、實(shí)驗(yàn)耗材貴，致使工作站運(yùn)行成本高，不具備普適性。

圖1 微孔板的高通量篩選自動化工作站Fig. 1 High-throughput screening automation workstation for microplates

2 流式細(xì)胞技術(shù)和熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)

流式細(xì)胞技術(shù)是利用流式細(xì)胞儀對熒光標(biāo)記的單細(xì)胞進(jìn)行高速、逐一的多參數(shù)定量分析和分選的技術(shù)［26-28］。其原理是利用激光作為光源照射異質(zhì)流體混合液產(chǎn)生散射光和熒光信號，并將這些光學(xué)信號通過電子檢測器讀取、轉(zhuǎn)換為電子信號輸出，從而對異質(zhì)流體混合物的單個細(xì)胞進(jìn)行快速分析和篩選的技術(shù)［26］。根據(jù)細(xì)胞分選能力將流式細(xì)胞術(shù)分為：非分選型和分選型。其中分選型流式細(xì)胞儀主要部件包括：流體系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)（激發(fā)和收集）、電子系統(tǒng)（檢測器）、數(shù)據(jù)系統(tǒng)和細(xì)胞分選系統(tǒng)［28］。

熒光激活細(xì)胞分選術(shù)（FACS）是一種分選型流式細(xì)胞術(shù)，能夠從混合細(xì)胞群中分析單細(xì)胞的多個參數(shù)，同時快速對目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行分選［圖2（a）］［29］。基于FACS分選的常規(guī)流程為：高壓將熒光染色的細(xì)胞懸液從樣品管中壓入充滿鞘液的流動室內(nèi)；在鞘液的包裹和推動下細(xì)胞流體被排成單列柱狀，由于噴口處高壓晶體振動使柱狀流體斷裂成均勻的細(xì)胞液滴，形成的水相液滴與入射的激光束垂直相交，激發(fā)產(chǎn)生熒光；根據(jù)每個細(xì)胞經(jīng)過監(jiān)測點(diǎn)時光學(xué)信號的變化來判斷該細(xì)胞的形態(tài)、大小以及熒光強(qiáng)度，電子系統(tǒng)將這些信息轉(zhuǎn)化為數(shù)據(jù)；數(shù)據(jù)系統(tǒng)分析后，將這些單細(xì)胞液滴充以正、負(fù)不同的電荷；細(xì)胞到達(dá)偏轉(zhuǎn)板時，在高壓靜電場的作用下發(fā)生偏轉(zhuǎn)，落入各自不同的收集管中實(shí)現(xiàn)目標(biāo)微生物細(xì)胞的分選（圖2）。熒光激活細(xì)胞分選在單細(xì)胞水平上分析大型突變文庫，并將表現(xiàn)出高熒光的細(xì)胞從培養(yǎng)液中分離出。因此，基于FACS高通量篩選是工業(yè)菌株選育和酶定向進(jìn)化最常用的方法［19，30］。然而，由于單細(xì)胞水平的差異和目標(biāo)產(chǎn)物在細(xì)胞間運(yùn)輸，這兩種情況都可能導(dǎo)致基于FACS高通量篩選的假陽性率，所以在應(yīng)用該篩查技術(shù)時可能會出現(xiàn)挑戰(zhàn)［15，31］。即使存在這些障礙，也有許多基于FACS高通量篩選獲得高活性酶突變體和高產(chǎn)能工業(yè)菌株的成功案例（表1）。

表1 FACS應(yīng)用工業(yè)微生物菌株構(gòu)建和酶分子定向進(jìn)化及實(shí)例Table 1 Summary of recent FACS applications for microbial cell factories and directed evolution

圖2 基于FACS技術(shù)高通量篩選Fig. 2 Based on FACS high-throughput screening technology

2.1 基于FACS技術(shù)高通量篩選實(shí)例

目前，F(xiàn)ACS技術(shù)對大容量突變文庫高通量的分析和篩選，與傳統(tǒng)篩選方法相比具有顯著優(yōu)勢，尤其是對代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控復(fù)雜的工業(yè)菌株選育、酶定向進(jìn)化等領(lǐng)域都有著重要應(yīng)用。以下主要介紹近幾年基于FACS高通量篩選技術(shù)經(jīng)典案例。

L-半胱氨酸是生物體重要的含硫氨基酸，已廣泛應(yīng)用到多個領(lǐng)域［45］。利用代謝工程策略已經(jīng)設(shè)計(jì)和構(gòu)建了生產(chǎn)L-半胱氨酸的微生物工業(yè)菌株［46］。然而，L-半胱氨酸的細(xì)胞毒性及其代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，利用傳統(tǒng)代謝工程策略（例如敲除競爭基因和過表達(dá)途徑關(guān)鍵基因）無法實(shí)現(xiàn)L-半胱氨酸在細(xì)胞內(nèi)的過量生產(chǎn)。工業(yè)菌株的選育（工業(yè)菌株定向進(jìn)化）可以有效改善菌株耐受性，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)量提升。研究人員首先開發(fā)了響應(yīng)L-半胱氨酸的轉(zhuǎn)錄因子生物傳感器，并與FACS高通量篩選技術(shù)結(jié)合應(yīng)用到絲氨酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶定向進(jìn)化和L-半胱氨酸高產(chǎn)菌株的選育工作中。利用該篩選平臺成功獲得酶活性提高7倍的絲氨酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶變體及10株L-半胱氨酸高產(chǎn)變體菌株［31］。綜上所述，當(dāng)對遺傳代謝信息認(rèn)識不足時，基于FACS高通量篩選技術(shù)是構(gòu)建微生物工廠的有力工具。

楊廣宇團(tuán)隊(duì)［42］利用細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對于熒光標(biāo)記底物和產(chǎn)物通透性差異，實(shí)現(xiàn)熒光在細(xì)胞內(nèi)的富集并結(jié)合FACS高通量篩選法，用于篩選巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶突變庫。實(shí)驗(yàn)中，設(shè)計(jì)多種熒光標(biāo)記底物衍生物通過半乳糖透酶轉(zhuǎn)運(yùn)，由胞內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶催化生成無法跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的熒光產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)成功捕獲熒光，并且利用FACS高通量篩選技術(shù)成功篩選到活性提高14倍的α-1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶突變體［42］。單胺氧化酶是一類黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）依賴性氧化酶，其催化一類構(gòu)型胺生成氧化產(chǎn)物亞胺，同時釋放過氧化氫作為副產(chǎn)物。研究人員利用H2O2高度敏感的熒光探針結(jié)合FACS高通量篩選技術(shù)，用于篩選單胺氧化酶（MAO-N）突變文庫［43］。此外，基于過氧化氫高度敏感熒光探針的FACS高通量篩選方法也廣泛適用于大腸桿菌中其他FAD依賴性氧化酶的定向進(jìn)化。由于熒光蛋白或單細(xì)胞水平途徑酶表達(dá)的異質(zhì)性造成FACS篩選過程的假陽性，可通過瓊脂平板或者微孔板篩選的形式進(jìn)行低通量二次復(fù)篩來消除這種誤差。此外，為了解決細(xì)胞間產(chǎn)物擴(kuò)散造成篩選誤差，研究人員添加了一種甲醛清除劑——谷胱甘肽，作為甲醛的“水槽”［47］。因?yàn)楣入赘孰脑趶纳a(chǎn)細(xì)胞擴(kuò)散到其他細(xì)胞之前與甲醛形成復(fù)合體，從而阻止谷胱甘肽的細(xì)胞間擴(kuò)散［47］。

2.2 液滴FACS技術(shù)及應(yīng)用

基于表1中FACS高通量篩選技術(shù)成功案例，充分說明FACS是在微生物選育及酶定向進(jìn)化領(lǐng)域最普遍應(yīng)用的分選方法。但FACS應(yīng)用僅限于分析細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)產(chǎn)物相關(guān)的熒光信號或與膜結(jié)合的代謝物熒光信號，不能用于鑒定過量生產(chǎn)細(xì)胞分泌代謝物和胞外分泌酶的細(xì)胞篩選。在合成生物學(xué)和代謝工程的背景下，F(xiàn)ACS局限性直接限制了工程菌株在工業(yè)上的應(yīng)用。特別是許多底物和目標(biāo)產(chǎn)品存在于胞外，即使是細(xì)胞內(nèi)的產(chǎn)物，科研人員也通過各種策略改造微生物實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物向外分泌，從而緩解毒性對細(xì)胞造成的壓力、降低產(chǎn)品的分離難度及經(jīng)濟(jì)成本［31，48］。為了克服FACS應(yīng)用的局限性，研究人員提出水/油/水（W/O/W）雙液滴或水凝膠的仿細(xì)胞區(qū)室化以實(shí)現(xiàn)基因型和表型的偶聯(lián)，從而拓寬FACS的應(yīng)用范圍［圖2（b）］［48］。

在核黃素高產(chǎn)菌株篩選的一項(xiàng)研究中，將微滴FACS與傳統(tǒng)的單細(xì)胞FACS進(jìn)行了比較［16］。結(jié)果表明，盡管通量和特異性相同，但不同的篩選模式會產(chǎn)生不同表型的菌株。與傳統(tǒng)的單細(xì)胞FACS分選出細(xì)胞內(nèi)核黃素含量增加的突變菌株相比，水/油/水（W/O/W）雙液滴包裹細(xì)胞的微滴FACS分選出胞外產(chǎn)量增加的菌株更有利于工業(yè)應(yīng)用，可直接從培養(yǎng)物中獲取核黃素［16］。此外，木聚糖酶定向進(jìn)化篩選工作中將生成的突變菌與熒光底物一起包埋在凝膠液滴中，以將所需高酶活性的表型與增加的熒光偶聯(lián)，從而能夠通過液滴FACS高通量篩選技術(shù)成功鑒定具有提高木聚糖酶生產(chǎn)能力的酵母突變體［38］。然而，通過水/油/水和水凝膠形成的液滴仍然無法實(shí)現(xiàn)后續(xù)底物和分析試劑的添加操作［15］，甚至如何生成這種穩(wěn)定的水/油/水雙液滴或水凝膠都存在技術(shù)障礙。

3 液滴微流控技術(shù)

微流控技術(shù)（microfluidics）是在微米到納米通道中進(jìn)行微流體精確操縱和分析的一項(xiàng)技術(shù)［49］。因能將整個生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室集成到單個芯片中，又稱之為“芯片實(shí)驗(yàn)室”（lab-on-chip）。近年來，由于微流控技術(shù)在化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、物理等多領(lǐng)域的應(yīng)用，它已成為一個獨(dú)特的新研究領(lǐng)域。液滴微流控技術(shù)（microdroplet）是微流控技術(shù)的重要分支，其通過互不相容的兩流體剪切形成單分散的微液滴，并在芯片中實(shí)現(xiàn)液滴孵育、融合、分裂、檢測和分選等精細(xì)操作（圖3）［17］。

圖3 液滴微流控裝置的設(shè)計(jì)示意圖Fig. 3 Schematic of droplet microfluidic device

微液滴的單分散性可實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞代謝物濃度定量監(jiān)測，而其包裹性為單細(xì)胞及液體環(huán)境提供了一個隔絕的空間［30］。因此，微液滴是高通量篩選中細(xì)胞區(qū)室良好的替代方案，為實(shí)現(xiàn)基因型和表型偶聯(lián)奠定了基礎(chǔ)。液滴微流控技術(shù)通常以每秒超過3萬個液滴的速度進(jìn)行分析和操作，有效提高了篩選效率［50-51］。此外，該技術(shù)快速、大量生成體積低至皮升的微隔室，不僅有利于細(xì)胞精準(zhǔn)分選，還極大程度降低實(shí)驗(yàn)過程中生物試劑和耗材的經(jīng)濟(jì)成本［52］。

3.1 液滴微流控技術(shù)原理及微滴分選模式

由于不同領(lǐng)域的需求，液滴微流體技術(shù)設(shè)計(jì)方案有很多。本文僅描述應(yīng)用于高通量篩選中單細(xì)胞液滴微流控技術(shù)總體設(shè)計(jì)，主要從微滴的生成、細(xì)胞液滴培養(yǎng)、微滴融合、皮升注射器、微液滴檢測及細(xì)胞分選等方面進(jìn)行介紹。

3.1.1 微滴的生成（microdroplet generation）

微滴生成，是結(jié)合兩個不混溶的相通過液-液界面剪切力和界面張力自發(fā)形成微細(xì)胞反應(yīng)器的過程［圖3（a）］［53］。微滴生成旨在持續(xù)、快速且均勻地生產(chǎn)微滴，而產(chǎn)生微滴的方法很多，包括T形結(jié)構(gòu)法（T-junction）、流動聚焦法（flow focusing）、并流（co-flowing）、微滴分裂（microdroplet splitting）和微孔矩陣（microwell arrays）［54-55］。微滴生成的方法主要取決于微生物突變文庫的通量和后續(xù)分選設(shè)計(jì)要求，其中利用流動聚焦法生成微滴過程快速、穩(wěn)定且微滴尺度操作范圍廣，因此是微生物細(xì)胞微滴生成中最常見的方法［56］。流動聚焦法又稱之為十字通道法，是由Anna最早提出的［57］。該方法是在十字微管道中分散相（細(xì)胞懸液）和連續(xù)相（油相）匯合于十字交叉管處，注入的分散相同時被兩側(cè)通道泵出的垂直連續(xù)相擠壓剪切，細(xì)胞懸液在油相的垂直擠壓和管道幾何結(jié)構(gòu)作用下斷裂，從而形成油包水或水保油的液滴［圖3（a）］［58-59］。通過控制兩相流速比，可以調(diào)節(jié)液滴生成的大小和頻率。

3.1.2 細(xì)胞液滴培養(yǎng)

細(xì)胞液滴培養(yǎng)是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的一個關(guān)鍵點(diǎn)［圖3（b）］。細(xì)胞液滴在不良環(huán)境中，可能會產(chǎn)生液滴收縮和細(xì)胞生長減慢等問題［60-61］。尤其對于一些好氧微生物細(xì)胞，其生長需要充足的氧氣、適宜的溫度。為解決這一問題，研究者提出采用管式培養(yǎng)方式。具體操作是在芯片中通過細(xì)胞液滴在微型透氣管道中流動實(shí)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)，并將這樣一個集成性芯片系統(tǒng)安裝于可以控制溫度、濕度及透氣性的容器中，從而滿足菌株的生長條件。然而，尋找通透性、堅(jiān)韌性良好的微管材料應(yīng)用到芯片中滿足細(xì)胞生長需求和后續(xù)液滴精細(xì)操作是具有挑戰(zhàn)性的。所以，研究人員提出了另外一個替代方案，即在芯片中設(shè)計(jì)了離線的分離培養(yǎng)室，將液滴操作和細(xì)胞孵育過程分離，以確保細(xì)胞正常生長和后續(xù)液滴分選操作［62］。此外，新型表面活性劑可維持液滴的亞穩(wěn)狀態(tài)，使細(xì)胞微滴可以穩(wěn)定孵育長達(dá)數(shù)周［63］。當(dāng)然，表面活性劑對于液滴生產(chǎn)不是必需的，但未添加表面活性劑的液滴之間可能會發(fā)生聚結(jié)和融合［64］。

3.1.3 微滴融合和皮升注射器

微流體系統(tǒng)中的微滴可用作獨(dú)立的微反應(yīng)器，執(zhí)行一系列生化反應(yīng)。然而，為了在特定時間將預(yù)先生成的細(xì)胞液滴與含有試劑液滴發(fā)生融合，需添加以下試劑形成新液滴完成生化反應(yīng)，包括：維持細(xì)胞穩(wěn)定的表面活性劑、檢測信號的生物傳感器、生化反應(yīng)的底物及細(xì)胞裂解劑等［65］。液滴融合（droplet merge）是通過微管幾何結(jié)構(gòu)及液滴表面張力改變或外加施壓（電場、磁場等），改變液滴表面的穩(wěn)定性，將含有試劑的液滴與細(xì)胞液滴相融合［66］。例如，研究人員利用微滴融合的方法將裂解劑、底物rac-PheTIQ以及由辣根過氧化物酶（HRP）和熒光染料Amplex UltraRed組成的混合液滴與細(xì)胞液滴融合發(fā)生生化反應(yīng)，便于檢測胞外目標(biāo)代謝物產(chǎn)量［67］。這種通過液滴融合方法將新試劑添加到細(xì)胞液滴中完成反應(yīng)的做法，已廣泛地應(yīng)用到液滴操作中。在液滴融合過程中，表面活性劑的添加在保證液滴穩(wěn)定的同時也會阻礙液滴間融合［64］。為了解決這類問題，研究人員提出通過皮升注射器方法實(shí)現(xiàn)液滴中試劑的添加工作。皮升注射器（pico-injection）通過類似于電子介導(dǎo)融合方式將試劑直接注入細(xì)胞液滴中［圖3（c）］［62］。具體而言，當(dāng)液滴通過皮升注射器時，利用電極通電破壞微液滴水-油界面的穩(wěn)定性致使試劑進(jìn)入液滴。這種方法可用于向含有細(xì)胞的微滴中注入各種試劑，從而實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品檢測。

3.1.4 微液滴檢測及細(xì)胞分選

微液滴信號檢測決定液滴微流控技術(shù)在工業(yè)微生物選育及酶定向進(jìn)化領(lǐng)域的應(yīng)用范圍［圖3（d）］。目前，主要的液滴檢測方法是基于熒光強(qiáng)度的，被稱為熒光激活液滴分選技術(shù)（FADS）。由于自發(fā)熒光的化合物稀缺，分析物通常需用熒光染料標(biāo)記和熒光探針輔助，并且也開發(fā)了多種用于觸發(fā)熒光信號的生物傳感器。除此之外，研究人員也開發(fā)許多無標(biāo)記檢測方法，例如雙光子熒光壽命（TPEFLADS）［68］、紫外-可見光譜（UVADS）［69］、光學(xué)吸光度（AADS）［51］、拉曼光譜（RACS）［70］、質(zhì)譜［71］和圖像識別［72］等。其中一些檢測技術(shù)，如雙光子熒光壽命可對小芳香族化合物進(jìn)行無標(biāo)記熒光檢測［68］。該方法將深紫外光譜區(qū)域吸收的小芳香族化合物進(jìn)行無標(biāo)記的液滴內(nèi)檢測，并通過時間相關(guān)的單光子計(jì)數(shù)，可動態(tài)測定液滴的熒光壽命從而區(qū)分具有不同化學(xué)成分的液滴。再比如，拉曼光譜檢測根據(jù)分子震動、轉(zhuǎn)動特性指紋檢測化合物。質(zhì)譜檢測根據(jù)化合物離子狀態(tài)質(zhì)荷比進(jìn)行物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析和檢測。這些方法多數(shù)根據(jù)化合物化學(xué)特異性分析樣品。然而，因吸光度檢測靈敏性低、拉曼光譜檢測通量低、質(zhì)譜檢測存在破壞性且通量低等問題，這些技術(shù)仍需進(jìn)一步發(fā)展以擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。

液滴分選是液滴微流控流程的最后一步，其旨在從巨大文庫中捕獲和分離具有目標(biāo)性狀的液滴。液滴分選的通量和精確性主要取決于液滴驅(qū)動方法［20］。在不同的驅(qū)動力中，電力驅(qū)動具有通量高和靈活性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)［73-74］。目前，液滴分選技術(shù)利用了被動和主動策略，可快速、準(zhǔn)確地分選出目標(biāo)液滴。介電電泳捕獲（dielectrophoresis DEP）技術(shù)是微流控中常用的主動分選策略。當(dāng)交流電壓施加兩端時可產(chǎn)生超高的電場梯度力，由于介電極化的作用，細(xì)胞受到不同的介電力進(jìn)而以不同的速率偏離原始軌跡，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分選［圖3（e）］［74］。

3.2 基于微滴細(xì)胞分選技術(shù)高通量篩選實(shí)例

傳統(tǒng)的篩選方法，如平板篩選和微量滴定板測定，其成本高且通量低。熒光激活細(xì)胞分選（FACS）是目前用于單細(xì)胞分選和分析的高通量方法。然而，F(xiàn)ACS要求熒光標(biāo)記物必須保留在待分選細(xì)胞的內(nèi)部或表面上。液滴微流控技術(shù)提供了一種多功能的操作系統(tǒng)，在微流體芯片中以千赫茲的速率產(chǎn)生單分散的油包水細(xì)胞液滴，液滴中的單細(xì)胞隔室增加孵育后的細(xì)胞密度，并使分泌物在液滴中積累，然后以0.1～1 kHz的頻率單獨(dú)篩選［64］。近幾年，熒光激活液滴分選（FADS）已被應(yīng)用于酶定向進(jìn)化和工程微生物篩選（表2）。下面主要介紹2020年以來的最新案例，闡明FADS方法在酶定向進(jìn)化和微生物工業(yè)菌株選育工作中的最新研究進(jìn)展。

表2 FADS應(yīng)用工業(yè)微生物菌株構(gòu)建和酶分子定向進(jìn)化及實(shí)例Table 2 Summary of recent FADS applications for microbial cell factories and directed evolution

3.2.1 FADS應(yīng)用于食品發(fā)酵菌株改造

對于安全要求高的發(fā)酵食品或食品酶制劑的生產(chǎn)菌株構(gòu)建，只能選擇誘變的方法獲取龐大突變株文庫，結(jié)合FADS高通量篩選技術(shù)獲得高產(chǎn)菌株［85］。例如食品工業(yè)酶制劑谷氨酰胺酶可以提高食品中蛋白質(zhì)的溶解性和乳化性。研究人員利用FADS技術(shù)篩選解淀粉芽孢桿菌高產(chǎn)谷氨酰胺酶突變株。團(tuán)隊(duì)研發(fā)了熒光信號傳感器應(yīng)用到FADS中，對全基因組突變細(xì)胞文庫進(jìn)行單次實(shí)驗(yàn)通量高達(dá)105克隆篩選，成功獲得了1株谷氨酰胺酶產(chǎn)量提高47%以上的突變株［85］。

3.2.2 FADS應(yīng)用于菌株基因挖掘領(lǐng)域

基于生物體多個基因決定性狀特點(diǎn)，借鑒正向遺傳篩選思路，即“表型基因型”。通過FADS篩選隨機(jī)誘變文庫以鑒定高產(chǎn)菌株，并使用全基因組測序輔助分析挖掘關(guān)鍵功能基因［80］。清華大學(xué)張翀和江南大學(xué)劉秀霞團(tuán)隊(duì)［80］開發(fā)了一個CRISPRi-FADS微流體篩選平臺，用于全面挖掘谷氨酸棒狀桿菌高產(chǎn)分泌蛋白潛在的關(guān)聯(lián)基因，并系統(tǒng)指導(dǎo)理性改造納米抗體VHH高效分泌生產(chǎn)。在實(shí)驗(yàn)中，研究人員首先構(gòu)建谷氨酸棒桿菌的CRISPRi突變文庫，使用熒光素衍生物FlAsHEDT2對VHH進(jìn)行熒光標(biāo)記。其標(biāo)記原理是VHH的C末端與四半胱氨酸短肽標(biāo)簽發(fā)生融合，該融合體被綠色熒光FlAsH-EDT2 試劑標(biāo)記形成熒光復(fù)合物［80］。然后，結(jié)合FADS高通量篩選技術(shù)對文庫進(jìn)行單細(xì)胞篩選。最后，經(jīng)過三輪篩選的基因型分析，揭示了促進(jìn)蛋白分泌的潛在靶點(diǎn)［80］。從基因組規(guī)模挖掘表型關(guān)聯(lián)基因，實(shí)現(xiàn)微生物細(xì)胞工廠高效構(gòu)建不僅需要全面的基因型干擾技術(shù)，還需要高通量表型篩選策略，而FADS高通量篩選是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的有力工具。

3.2.3 FADS應(yīng)用于缺乏遺產(chǎn)操作系統(tǒng)菌株的改造

放線菌的代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)新穎、生物活性獨(dú)特，多用于臨床藥物研發(fā)。由于放線菌的基因遺傳操作方法不夠完善，對于放線菌的改造多采用非理性突變的方式。利用FADS技術(shù)可以解決放線菌突變株文庫的高通量篩選問題。研究人員首先開發(fā)全細(xì)胞生物傳感器：利用放線菌產(chǎn)生的紅霉素與大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄因子MphR結(jié)合激活GFP蛋白表達(dá)，從而將紅霉素濃度信號轉(zhuǎn)化為綠色熒光信號［87］。在實(shí)驗(yàn)中，研究人員利用液滴包埋放線菌和大腸桿菌（全細(xì)胞生物傳感器）構(gòu)建共培養(yǎng)體系實(shí)現(xiàn)產(chǎn)量和熒光信號的轉(zhuǎn)換。然后，結(jié)合FADS篩選技術(shù)完成多輪迭代突變和篩選，獲得多種紅霉素高產(chǎn)放線菌。最后，通過測序和生物信息學(xué)分析解析高產(chǎn)紅霉素機(jī)理。此外，研究人員通過反義RNA技術(shù)成功驗(yàn)證一個關(guān)鍵基因?qū)τ诩t霉素生產(chǎn)的影響，為完善放線菌遺傳操作系統(tǒng)提供了一個潛在的靶點(diǎn)［87］。

3.2.4 FADS應(yīng)用于調(diào)控復(fù)雜初級代謝產(chǎn)物菌株構(gòu)建

初級代謝產(chǎn)物丙酮酸是一種重要的α-酮酸，在生物代謝途徑中具有重要作用。雖然丙酮酸合成路徑清晰，但嚴(yán)格受到菌株多水平復(fù)雜調(diào)控影響，嚴(yán)重制約了工業(yè)菌株產(chǎn)量提高。周景文團(tuán)隊(duì)［39］基于構(gòu)建光滑球擬酵母表面熒光展示體系和FADS技術(shù)，建立了微液滴中丙酮酸與熒光信號偶聯(lián)的高通量篩選方法。最終獲得了1株高產(chǎn)突變菌，其丙酮酸搖瓶產(chǎn)量達(dá)48.6 g/L，相比原始菌其產(chǎn)量提高了73.6%。研究人員首先構(gòu)建熒光檢測系統(tǒng)：Pir1、Agα兩種錨定蛋白將熒光蛋白定位于酵母膜外表達(dá)，成功將胞外丙酮酸產(chǎn)量與熒光信號偶聯(lián)。再將光滑球擬酵母利用ARTP誘變處理獲得突變株文庫，利用FADS技術(shù)對細(xì)胞進(jìn)行包埋，孵育后進(jìn)入微滴檢測系統(tǒng)將丙酮酸分泌濃度信號轉(zhuǎn)化為熒光強(qiáng)度信號，最終完成細(xì)胞分選。

3.2.5 FADS應(yīng)用于酶定向進(jìn)化高通量篩選

缺乏途徑酶及酶催化活性低是利用合成生物學(xué)構(gòu)建人工合成途徑的瓶頸之一；而酶催化元件的有效設(shè)計(jì)是亟待解決的難題。定向進(jìn)化是在實(shí)驗(yàn)室模擬達(dá)爾文自然進(jìn)化，通過隨機(jī)突變和重組構(gòu)建庫容量龐大突變文庫，篩選出具有目標(biāo)性狀的蛋白質(zhì)?；诟咄亢Y選酶定向進(jìn)化策略，由于缺乏蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系，只能利用暴力破解方式篩選高催化活性蛋白質(zhì)。研究人員開發(fā)了一系列酶定向進(jìn)化的FADS篩選方法，以微液滴作為酶催化熒光反應(yīng)發(fā)生器，將酶活性信號轉(zhuǎn)化為熒光信號，利用FADS設(shè)備對單細(xì)胞直接讀取熒光信號并完成細(xì)胞分選。例如，D-阿洛酮糖是一種低熱量、高生理活性的蔗糖替代品，其通過酮糖3-差向異構(gòu)酶（KEases）催化合成。研究人員發(fā)現(xiàn)該酶在工業(yè)條件下表現(xiàn)出活性低、耐受性差等問題。為了解決此類問題，研究人員開發(fā)響應(yīng)D-阿洛酮糖轉(zhuǎn)錄因子生物傳感器，并結(jié)合FADS高通量篩選技術(shù)實(shí)現(xiàn)了合成D-阿洛酮糖的差向異構(gòu)酶的高效催化和耐受性［86］。杜文斌課題組［75］基于FADS篩選系統(tǒng)，從PET紡織廠廢水樣品中挖掘新型PET降解酶。該團(tuán)隊(duì)首先對PET紡織廠的廢水中的單個細(xì)胞進(jìn)行液滴包埋和細(xì)胞孵育。然后，選擇熒光底物熒光素二苯甲酸酯（FDBz）注射到細(xì)胞液滴中完成酶催化反應(yīng)，釋放綠色熒光單苯甲酸酯（FMBz）和熒光素，根據(jù)熒光信號變化進(jìn)行單細(xì)胞分選。最后，通過FADS高通量篩選技術(shù)成功獲得9株P(guān)ET降解微生物，并對挖掘的兩個PET降解新酶進(jìn)行異源表達(dá)，實(shí)現(xiàn)其PET降解活性的初步驗(yàn)證［75］。此外，研究者搭建工業(yè)產(chǎn)酶菌株FADS高通量篩選平臺，通過模擬實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證FADS篩選通量，并利用該平臺篩選了產(chǎn)α-淀粉酶地衣芽孢桿菌突變文庫，成功獲得出α-淀粉酶生產(chǎn)能力較高的突變體［89］。實(shí)驗(yàn)人員利用熒光素BODIPY標(biāo)記淀粉，當(dāng)α-淀粉酶水解淀粉時，熒光基團(tuán)被釋放增加熒光強(qiáng)度，進(jìn)而將α-淀粉酶水催化活性轉(zhuǎn)化為熒光信號實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分選［89］。

4 熒光信號檢測

FADS和FACS由于高通量、低消耗，是目前常用高通量篩選技術(shù)。在基于FADS的高通量篩選中，單細(xì)胞封裝并在單分散的皮升液滴內(nèi)培養(yǎng)，通過檢測孵育后的液滴熒光信號的變化激活電場從而分選所需的細(xì)胞。而FACS則通過捕獲細(xì)胞內(nèi)或膜偶聯(lián)熒光信號變化進(jìn)行高通量細(xì)胞分選。無論哪種技術(shù)，最重要的問題之一是如何將熒光信號與所需的表型偶聯(lián)。為了解決這一難題，已經(jīng)開發(fā)了幾種方法用于實(shí)現(xiàn)信號的檢測。

4.1 直接產(chǎn)品檢測

最理想的情況下，目標(biāo)產(chǎn)物本身具有熒光性，可直接應(yīng)用FADS高通量篩選。例如，研究者利用核黃素?zé)晒馓匦?，結(jié)合高通量篩選技術(shù)，獲得高產(chǎn)核黃素的解脂耶式酵母（Yarrowia lipolytica）和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）［16，90］。同樣，研究人員通過葉綠素自身熒光特性對微滴中的微藻和藍(lán)藻進(jìn)行無標(biāo)記分析和分類［88］，首次將葉綠素?zé)晒馓匦詰?yīng)用于測量藍(lán)藻種群之間生物量差異，并鑒定快速生長的菌株［88］。此外，研究者發(fā)現(xiàn)在488 nm激發(fā)光照射下，僅有β-胡蘿卜素在（535±25）nm可接收到信號并激發(fā)熒光。這一發(fā)現(xiàn)可排除番茄紅素中間產(chǎn)物造成的假陽性干擾響。將這種熒光檢測方法與FACS高通量篩序技術(shù)相結(jié)合，最終獲得β-胡蘿卜素產(chǎn)量增加53%～166%的9株突變菌［34］。雖然這種情況對于信號檢測而言顯然是理想的，但具有熒光特性的化合物稀缺，因此，幾乎所有其他應(yīng)用都需要一些手段將化學(xué)濃度轉(zhuǎn)化為可檢測的信號。以下主要介紹基于熒光信號檢測常用策略。

4.2 基于熒光染料/探針信號檢測

使用熒光染料/探針進(jìn)行篩選是一種常用方法，通常用于微生物內(nèi)或外分泌待測物自身特性無法滿足的檢測。FACS高通量篩選中，為了保證基因型-表型偶聯(lián)，需要將熒光產(chǎn)物截留在細(xì)胞內(nèi)以便后續(xù)檢測。利用細(xì)胞膜的選擇性，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞捕獲熒光產(chǎn)物［91］。具體而言，外部添加的小分子熒光標(biāo)記底物透過膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入細(xì)胞，酶促反應(yīng)后產(chǎn)生的熒光產(chǎn)物無法轉(zhuǎn)運(yùn)而滯留細(xì)胞內(nèi)富集引起熒光的積累，根據(jù)熒光信號的變化進(jìn)行篩選。例如，研究人員描述了一種基于FACS高通量篩選技術(shù)，用于唾液酸轉(zhuǎn)移酶的定向進(jìn)化，以提高其對不同熒光標(biāo)記的受體糖的催化效率［91-92］。實(shí)驗(yàn)中，熒光標(biāo)記底物和N-乙酰神經(jīng)氨酸（Neu5Ac）通過膜選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入細(xì)胞，并被唾液酸轉(zhuǎn)移酶CstⅡ轉(zhuǎn)化。唾液酸化的熒光產(chǎn)物無法被轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白識別，從而將熒光信號捕獲在胞內(nèi)。該方法也被用于巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶定向進(jìn)化的工作中，研究者基于細(xì)胞膜表面的半乳糖透酶對熒光標(biāo)記底物及產(chǎn)物通透性的差異實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)熒光信號的捕獲，結(jié)合FACS篩選技術(shù)實(shí)現(xiàn)高通量文庫的篩選［42］。此外，研究人員也通過將疏水性熒光標(biāo)記底物帶上電荷阻止其擴(kuò)散到細(xì)胞外實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)熒光捕獲［30，93］。

基于FADS高通量篩選中，微液滴區(qū)室化優(yōu)勢保障了細(xì)胞分泌待測物的表型-基因型連接。簡言之，F(xiàn)ADS熒光信號來源不局限于細(xì)胞自身。但是，熒光染料/探針的選擇在滿足良好的靈敏性和特異性的同時，需要考慮熒光染料/探針及其產(chǎn)物跨液滴水-油屏障擴(kuò)散和液滴間串?dāng)_因素［94］。對于疏水性較強(qiáng)的熒光基團(tuán)的衍生物，在液滴中的滯留性差，分子很快地?cái)U(kuò)散到油相，甚至在相近的液滴之間發(fā)生串?dāng)_。這種情況造成熒光背景增加，干擾篩選同時降低篩選的準(zhǔn)確性。為了解決這類問題，研究人員通過添加極性基團(tuán)增加熒光物的親水性，提高液滴中熒光信號的穩(wěn)定性［95-96］。

熒光底物與目標(biāo)酶分子直接反應(yīng)是高通量篩選常規(guī)方法［圖4（a）］。例如，利用熒光染料BODIPY標(biāo)記淀粉，當(dāng)α-淀粉酶水解淀粉，熒光基團(tuán)被釋放增加熒光強(qiáng)度，從而將α-淀粉酶水催化活性轉(zhuǎn)化為熒光信號實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分選，獲得高活性α-淀粉酶突變體［89］。然而，很多代謝產(chǎn)物無法直接進(jìn)行熒光測定或目標(biāo)酶分子缺乏直接催化的熒光標(biāo)記底物，都成為利用FADS技術(shù)進(jìn)行工業(yè)菌株篩選和酶定向進(jìn)化的瓶頸。而通過偶聯(lián)其他酶促反應(yīng)（即多酶級聯(lián)反應(yīng)）間接產(chǎn)生熒光信號變化，為解決該類問題提供有效策略［圖4（b）］［94］。具體而言，目標(biāo)途徑產(chǎn)生的副產(chǎn)物與熒光探針經(jīng)偶聯(lián)酶催化產(chǎn)生熒光信號，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)代謝物或酶分子信號偶聯(lián)。該方法多用于氧化還原反應(yīng)中氧化酶、脫氫酶和其代謝物的檢測［圖4（c）、（d）］。例如，胺分子經(jīng)過環(huán)己胺氧化酶（CHAO）催化產(chǎn)生亞胺和過氧化氫，后者與熒光染料Amlex UltraRed被辣根過氧化物酶（HRP）催化釋放熒光基團(tuán)。根據(jù)熒光信號變化，篩選高活性CHAO變體酶［67］。在具體實(shí)驗(yàn)中，將含有CHAO變體的菌株包埋于液滴中，孵育之后，與含有裂解試劑、反應(yīng)底物1-苯基-1，2，3，4-四氫異喹啉（PheTIQ）、偶聯(lián)酶HRP及熒光染料的液滴發(fā)生融合，同時在新形成液滴表面添加表面活性劑，防止熒光基團(tuán)擴(kuò)散，最終獲得酶活性提高960倍的CHAO酶變體［67］。

4.3 轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)生物傳感器

鑒于化學(xué)熒光染料和熒光探針價(jià)格昂貴且難以開發(fā)，而生物傳感器利用微生物自身遺傳調(diào)控機(jī)制響應(yīng)目標(biāo)產(chǎn)物，可被應(yīng)用于精準(zhǔn)監(jiān)測代謝物和酶分子?；谵D(zhuǎn)錄因子（transcription factor，TF）的生物傳感器是連接基因和表型的有用工具。簡而言之，工業(yè)菌株產(chǎn)物或者酶反應(yīng)底物和產(chǎn)物可以導(dǎo)致熒光蛋白基因表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)，最終形成熒光信號，從而將基因型和表型關(guān)聯(lián)?；谵D(zhuǎn)錄因子的生物傳感器可以分為：檢測細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子生物感受器；檢測細(xì)胞分泌代謝的全細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子生物傳感器。

4.3.1 內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子生物感受器

內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子生物感受器是指將異源轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)化到生產(chǎn)菌株中，以檢測生產(chǎn)菌株自身生產(chǎn)能力［圖4（e）］。例如，轉(zhuǎn)錄因子CcdR結(jié)合L-半胱氨酸，與啟動子PccdA上游DNA序列結(jié)合，RNA聚合酶激活下游基因表達(dá)?；谝陨显?，將胞內(nèi)L-半胱氨酸濃度轉(zhuǎn)化為熒光強(qiáng)度信號偶聯(lián)，實(shí)現(xiàn)對胞內(nèi)L-半胱氨酸濃度的檢測［31］。在實(shí)驗(yàn)中，研究人員通過轉(zhuǎn)錄因子代謝工程策略，對響應(yīng)L-半胱氨酸的轉(zhuǎn)錄因子生物傳感器的響應(yīng)靈敏度和響應(yīng)強(qiáng)度范圍做了改造和提升。同樣，為了獲得生理環(huán)境下高活性精氨酸脫亞胺酶（ADI）變體酶［97］，研究者開發(fā)了酶介導(dǎo)熒光蛋白調(diào)控生物傳感器Arg-LiMEx系統(tǒng)。其檢測原理如下：增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（eGFP）的熒光強(qiáng)度依賴于細(xì)胞內(nèi)精氨酸濃度，而細(xì)胞內(nèi)精氨酸濃度是由精氨酸脫亞胺酶（ADI）催化精氨酸的活性決定。啟動子與增強(qiáng)綠色熒光蛋白基因（eGFP）相連，在精氨酸存在下，與同源抑制子ArgR結(jié)合形成ArgR+精氨酸+ArgR復(fù)合體，復(fù)合體結(jié)合到argG啟動子區(qū)域阻止eGFP表達(dá)。精氨酸脫亞胺酶ADI與同源抑制子ArgR供體競爭細(xì)胞內(nèi)精氨酸，高活性ADI變體有效地耗盡細(xì)胞內(nèi)精氨酸，阻止精氨酸與ArgR形成復(fù)合體，啟動eGFP的表達(dá)。熒光信號越強(qiáng)說明細(xì)胞內(nèi)精氨酸濃度越低，從而分選出高活性ADI變體酶。經(jīng)過三輪迭代的隨機(jī)誘變和FACS篩選，鑒定出一種變體（M31），與野生型相比其催化活性提高了970倍［97］。

除了熒光蛋白外，基于熒光染料的轉(zhuǎn)錄子介導(dǎo)生物傳感器也被廣泛應(yīng)用于高通量篩選技術(shù)。通過轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的觸發(fā)熒光染料的釋放，從而增加熒光信號進(jìn)行細(xì)胞分選。利用莢膜紅桿菌的天然H2傳感系統(tǒng)，設(shè)計(jì)了一種篩選高產(chǎn)H2的固氮酶變體。在分子氫存在下，hup基因簇（HupUV、HupT、HupR）轉(zhuǎn)錄上調(diào)，最終誘導(dǎo)β-半乳糖苷酶表達(dá)。β-半乳糖苷酶催化熒光染料表達(dá)的底物熒光素二-β-D-半乳糖苷釋放熒光素，篩選高產(chǎn)氫氣固氮酶變體，獲得了一株氫氣產(chǎn)量增加10倍的突變菌［98-99］。

4.3.2 全細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子生物傳感器

全細(xì)胞生物感受器用于將轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)入到新的宿主中以產(chǎn)生功能性全細(xì)胞生物傳感器，其準(zhǔn)確反映生產(chǎn)菌分泌產(chǎn)物濃度的生物傳感［圖4（f）］。大腸桿菌菌株是最常用的全細(xì)胞生物傳感器宿主?；诳莶菅挎邨U菌轉(zhuǎn)錄抑制因子PadR可以特異性結(jié)合對香豆酸的原理，將PadR異源轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)，構(gòu)建全細(xì)胞生物感受器。將對香豆酸生產(chǎn)工程酵母突變株與大腸桿菌生物傳感細(xì)胞封裝在皮升液滴內(nèi)，并在微流體裝置中，使用熒光大腸桿菌生物傳感器信號快速分選含有酵母細(xì)胞的液滴，產(chǎn)生大量細(xì)胞外對香豆酸。MphR是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，可識別廣泛的大環(huán)內(nèi)酯類分子作為其配體［100-101］。大腸桿菌生物傳感器菌株和產(chǎn)紅霉素菌株在液滴中共培養(yǎng)，突變株產(chǎn)生紅霉素進(jìn)入大腸桿菌，與轉(zhuǎn)錄抑制因子MphR結(jié)合，促進(jìn)RNA聚合酶與啟動子區(qū)域結(jié)合，引起熒光蛋白GFP表達(dá)。紅霉素生成水平與綠色熒光強(qiáng)度呈正相關(guān)，并通過熒光激活液滴分選（FADS）進(jìn)行分選，可以篩選具有較高紅霉素產(chǎn)量的突變菌株。在很多工作中都證明全細(xì)胞生物傳感器-目標(biāo)產(chǎn)物生產(chǎn)菌株共培養(yǎng)策略在小分子篩選中的可行性［102-103］?；陧憫?yīng)赤蘚糖醇轉(zhuǎn)錄因子EryD的生物傳感器，當(dāng)酵母突變菌株產(chǎn)生赤蘚糖醇，與全細(xì)胞生物傳感器中的EryD結(jié)合，并激活下游集基因表達(dá)產(chǎn)生熒光用于快速篩選和表征赤蘚糖醇高產(chǎn)酵母菌株［102］。值得注意的是，這種全細(xì)胞生物感受器策略在應(yīng)用中存在一些局限性。最關(guān)鍵的問題是生物傳感器菌株和生產(chǎn)菌株在液滴中無法避免的競爭性。在有限液滴環(huán)境中大腸桿菌細(xì)胞與生產(chǎn)菌株在營養(yǎng)和生存空間方面競爭，致使生產(chǎn)菌生長受限。鑒于這種競爭生長原因，其他生長速率相對較低的模式菌株如谷氨酸棒狀桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌，在某些共培養(yǎng)應(yīng)用中可能是更好的替代生物傳感器宿主。另外，全細(xì)胞生物傳感器檢測熒光信號耗時長，并且需要在液滴篩選后將目標(biāo)生產(chǎn)菌株與傳感器細(xì)胞分離?；蚓幋a生物傳感器可以很好地解決這些問題。例如，響應(yīng)谷氨酸的iGluSnFR基因編碼生物傳感器，這是一種基于谷氨酸濃度熒光蛋白傳感器，用于可視化谷氨酸產(chǎn)量［85］。研究者將突變體細(xì)胞包埋生成微液滴，并在透氣的特氟龍管中孵育液滴。將谷氨酰胺和iGluSnFR的混合物皮升注射到細(xì)胞液滴中，對熒光強(qiáng)度高的液滴進(jìn)行分選。突變株產(chǎn)生谷氨酰胺酶，對添加的底物發(fā)生水解反應(yīng)生成谷氨酸。iGluSnFR結(jié)合谷氨酸，啟動發(fā)生熒光反應(yīng)。谷氨酸的濃度越高，熒光越強(qiáng)，從而獲得高產(chǎn)谷氨酰胺酶菌株［85］。

4.4 核糖體開關(guān)生物傳感器

核糖體開關(guān)（Riboswitch）是基于mRNA水平的一類基因編碼生物傳感器，是mRNA 5′端非編碼區(qū)的序列，該序列可折疊成具有一定構(gòu)象的二級結(jié)構(gòu)。典型的核糖體開關(guān)是由適配體結(jié)構(gòu)域和表達(dá)基因結(jié)構(gòu)域組成。該結(jié)構(gòu)能夠特異性地結(jié)合細(xì)胞內(nèi)小分子化合物，使其構(gòu)象發(fā)生改變，從而釋放核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS），激活下游基因的表達(dá)［圖4（g）］?；诤颂求w開關(guān)原理，研究人員設(shè)計(jì)了響應(yīng)色氨酸（Trp）生物傳感器生物［76，82］。其傳感原理為：當(dāng)缺乏細(xì)胞內(nèi)Trp時，核糖體開關(guān)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，阻止核糖體與核糖體結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，導(dǎo)致翻譯終止［76］；當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Trp過量時，Trp分子可以結(jié)合莖環(huán)并改變其結(jié)構(gòu)，釋放核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS啟動黃色熒光蛋白YFP表達(dá)［82］。研究人員利用色氨酸核糖體開關(guān)傳感器與FADS相結(jié)合，成功篩選出一種突變菌株，其Trp滴度提高了165.9%［76］。

5 展 望

微生物工業(yè)制造是以微生物細(xì)胞工廠為核心，利用低成本、可再生資源為原料，實(shí)現(xiàn)高附加值化合物的綠色生產(chǎn)。高通量篩選技術(shù)是實(shí)現(xiàn)微生物工業(yè)制造的有力工具。微孔板、自動化設(shè)備與機(jī)械臂相結(jié)合搭建篩選平臺，極大地降低了高通量篩選過程的人力勞動密度，并實(shí)現(xiàn)104克隆/天的篩選通量。熒光激活細(xì)胞分選和液滴微流控技術(shù)的發(fā)展加大了細(xì)胞篩選通量并降低了實(shí)驗(yàn)中試劑耗材成本。尤其是液滴微流控技術(shù)的開發(fā)和發(fā)展為自動化高通量微生物細(xì)胞工廠和酶定向進(jìn)化的篩選提供了新的解決方案。

微流控技術(shù)在高通量篩選中表現(xiàn)出巨大的潛力，其應(yīng)用范圍和篩選能力方面都在進(jìn)一步完善。大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的成功案例都是來源于單個實(shí)驗(yàn)室搭建的微流控組合裝置。一些公司已經(jīng)將微流體芯片技術(shù)商業(yè)化，用于液滴生成和分選。例如來自英國Sphere Fluidics公司研發(fā)的Cyto-Mine?，該設(shè)備將高分泌克隆包埋、篩選、分選、分離和復(fù)篩驗(yàn)證集成到一個全自動小型儀器中［104］。Cyto-Mine可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?，按需定制工作流程進(jìn)而實(shí)現(xiàn)利用微流控技術(shù)提高工作效率［105］。這樣的商業(yè)化單細(xì)胞分析裝置允許篩選通量105克隆/天。同時，該設(shè)備可實(shí)現(xiàn)自動化復(fù)篩，將初篩高活力菌株轉(zhuǎn)移到MTP中進(jìn)行培養(yǎng)檢測［104］。此外，包括美國TTP Labtech、Missionbio、SphereFluidics和On-chip biotechnologies在內(nèi)的幾家公司已經(jīng)開始將集成的臺式設(shè)備商業(yè)化。

我國在微流控技術(shù)設(shè)備研發(fā)方面也取得了一些成就。例如，清華大學(xué)化工系生物育種技術(shù)與裝備團(tuán)隊(duì)和天木生物公司合作研發(fā)微升級單細(xì)胞液滴篩選系統(tǒng)（MISS Cell），該設(shè)備允許在微升級液滴中進(jìn)行自動化、高通量的微生物單細(xì)胞培養(yǎng)和分選，通量可達(dá)104。這樣一個高度集成商業(yè)化設(shè)備已經(jīng)應(yīng)用于多個實(shí)驗(yàn)室工作中［84］。該公司還自主研發(fā)了基于FADS技術(shù)皮升級單細(xì)胞分選設(shè)備DREM cell，該設(shè)備具有體積小、通量高、無交叉污染等特點(diǎn)。DREM cell設(shè)備通過將待測細(xì)胞包埋成單細(xì)胞液滴，利用熒光信號檢測分選，實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞微生物的高通量分離、孵育、皮升注射、檢測篩選等操作。近年來，基于該設(shè)備的高通量篩選研究，充分證明該設(shè)備的可靠性［80，85-86］。除此之外，國內(nèi)科研機(jī)構(gòu)（如中科院微生物研究所、天津工業(yè)技術(shù)研究所等）也研發(fā)一些基于微流控技術(shù)的設(shè)備。例如杜文斌研究團(tuán)隊(duì)和黃力團(tuán)隊(duì)共同開發(fā)了一種新型的微流控界面納升注射設(shè)備（INJ），該設(shè)備可以完成在納升級體積的油包水微液滴生成，并與FACS高通量篩選技術(shù)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞分析和分選流程。隨著時間的推移，高通量篩選技術(shù)和設(shè)備的開發(fā)與應(yīng)用加速微生物細(xì)胞工廠構(gòu)建和測試的效率，并極大推動合成生物學(xué)的高速發(fā)展。