劉歡，崔球

（1 中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所，中國(guó)科學(xué)院生物燃料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266101； 2 山東能源研究院，山東 青島 266101； 3 青島新能源山東省實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266101）

微生物細(xì)胞工廠是綠色生物制造的重要基石，可助力實(shí)現(xiàn)“雙碳”目標(biāo)。在微生物菌株開發(fā)過(guò)程中，合成生物學(xué)的“設(shè)計(jì)-構(gòu)建-測(cè)試-學(xué)習(xí)”循環(huán)已成為示范流程，可加速菌種進(jìn)化工程。基于底盤細(xì)胞的理性或半理性改造來(lái)獲取多樣性突變文庫(kù)的技術(shù)已經(jīng)得到了長(zhǎng)足的發(fā)展［1］。然而，突變文庫(kù)中篩選目標(biāo)菌株的高通量策略的發(fā)展進(jìn)展緩慢，從而限制了其應(yīng)用。目前，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞代謝表型來(lái)篩選目標(biāo)基因型菌株是篩選突變文庫(kù)的一種直接且精準(zhǔn)的方法。但是，目前主流的細(xì)胞代謝表型篩選方法通常耗時(shí)耗力且效率低下，成為合成生物學(xué)發(fā)展中的“限速步驟”之一。

目前，基于細(xì)胞代謝表型的高通量篩選方法主要包括熒光標(biāo)記、拉曼光譜和質(zhì)譜技術(shù)。熒光標(biāo)記技術(shù)具有高靈敏度和特異性等優(yōu)勢(shì)，是目前應(yīng)用最為廣泛的細(xì)胞表型檢測(cè)技術(shù)之一［2］。它的通量可以高達(dá)107個(gè)/h［3］。然而，缺乏特異性熒光探針限制了該方法的使用范圍，此外，有些細(xì)胞可能會(huì)受到熒光標(biāo)記的影響，影響其自身的生物學(xué)特性，對(duì)于原位檢測(cè)也會(huì)造成困擾。拉曼光譜技術(shù)是一種高效的細(xì)胞表型識(shí)別技術(shù)，具有無(wú)損、非標(biāo)記、高通量和低成本等優(yōu)點(diǎn)［4］。然而，由于大多數(shù)細(xì)胞表型的拉曼信號(hào)較弱，拉曼檢測(cè)靈敏度較低，更難以進(jìn)行低濃度細(xì)胞表型的分析。此外，利用拉曼光譜技術(shù)可獲得細(xì)胞代謝組表型的總體光譜特征，但難以從分子水平上獲取胞內(nèi)單一種類分子的完整拉曼光譜特征。

質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）是一種強(qiáng)大的分析技術(shù)，通過(guò)檢測(cè)氣相離子來(lái)鑒定和定量化合物，并提供化合物分子量和化學(xué)結(jié)構(gòu)信息［5］。質(zhì)譜具備高特異性、高靈敏度、普適性、快速、微量和非標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)，因此在各個(gè)學(xué)科領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。其中，電離源作為質(zhì)譜的關(guān)鍵核心部分，能夠?qū)⒎肿与x子化。常用的電離源包括電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）源［6］、基質(zhì)輔助激光解吸/電離（matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI）源［7］、大氣壓化學(xué)電離源和大氣壓光電離源等，這些電離源往往需要在真空或負(fù)壓條件下分析較純凈的樣品。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography MS，GC-MS）和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatography MS，LC-MS）技術(shù)已成為現(xiàn)代分析化學(xué)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，可用于各種復(fù)雜樣品的分析［8］。例如，GC-MS可以用于靶向分析解脂耶氏酵母菌生物合成的終產(chǎn)物中鏈脂肪酸［9］。然而，細(xì)胞樣品的擴(kuò)大培養(yǎng)、復(fù)雜樣品制備和較長(zhǎng)時(shí)間的色譜分離使得這些技術(shù)的通量較低，限制了它們?cè)诰旮咄亢Y選中的應(yīng)用。

原位電離質(zhì)譜（ambient ionization MS，AIMS）是一組新型的分析技術(shù)，它可以直接解吸和電離天然樣品中的待測(cè)分子，無(wú)需分離或樣品預(yù)處理。這種技術(shù)突破了經(jīng)典電離方法的束縛，可以在大氣壓條件下實(shí)現(xiàn)固體樣品的實(shí)時(shí)、表面和原位檢測(cè)［10］。在過(guò)去的二十年中，AI-MS已經(jīng)發(fā)展出多種在大氣壓下工作的技術(shù)，并廣泛應(yīng)用于多個(gè)科學(xué)領(lǐng)域，如生物醫(yī)學(xué)、制藥和法醫(yī)學(xué)、植物科學(xué)、微生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)以及癌癥病理學(xué)等［11］。

本文旨在探討MALDI-MS和AI-MS在微生物菌株高通量檢測(cè)和篩選中的應(yīng)用（圖1）。首先介紹了經(jīng)典MALDI-MS和基于電噴霧、激光和等離子體的AI-MS的工作機(jī)制，以及它們?nèi)绾螌?shí)現(xiàn)對(duì)完整微生物細(xì)胞的直接檢測(cè)。其次，詳細(xì)介紹了質(zhì)譜技術(shù)在微生物突變文庫(kù)的高通量篩選和活菌落成像中的研究進(jìn)展。最后，探討了AI-MS在微生物菌株選育中的優(yōu)勢(shì)和不足，并展望了AI-MS在合成生物學(xué)領(lǐng)域未來(lái)的發(fā)展方向。

圖1 質(zhì)譜技術(shù)在微生物檢測(cè)中的應(yīng)用Fig. 1 Application of mass spectrometry in microbial detection

1 質(zhì)譜電離技術(shù)工作機(jī)制及表征完整微生物細(xì)胞

1.1 基質(zhì)輔助激光解吸/電離質(zhì)譜

MALDI-MS已經(jīng)發(fā)展成為一種快速可靠的微生物細(xì)胞分析技術(shù)［12-13］。自20世紀(jì)90年代起，MALDI-MS用于直接識(shí)別菌落中的蛋白質(zhì)［14-15］。在該技術(shù)中，將菌樣品和基質(zhì)混合，在樣品靶板上形成共結(jié)晶，然后將其放置于MALDI源中，在高真空條件下進(jìn)行檢測(cè)。這種方法能夠?qū)崿F(xiàn)約每秒1個(gè)樣品的分析通量?；|(zhì)的選擇直接影響到MALDI-MS的圖譜質(zhì)量。通常用于菌樣檢測(cè)的基質(zhì)包括α-氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA）、2，5-二羥基苯甲酸（DHB）和3，5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸（芥子酸）［12］?；|(zhì)溶液通常由水、有機(jī)基質(zhì)和強(qiáng)酸組成，具有穿透微生物細(xì)胞壁和提取細(xì)胞表型分子的能力。MALDI-MS可以直接獲取菌樣細(xì)胞表型分子的指紋圖譜，包括脂質(zhì)譜和蛋白質(zhì)譜等。這些譜圖可用于在屬、物種或亞群水平上鑒定細(xì)菌［13］。目前已有許多文獻(xiàn)對(duì)于MALDI-MS在細(xì)菌鑒定方面進(jìn)行了綜述［12-13，16-19］，因此此處不再贅述。

由于具有樣品制備簡(jiǎn)單、耐高鹽、化學(xué)覆蓋廣和高通量等優(yōu)點(diǎn)，MALDI-MS已成為成熟的高通量分析平臺(tái)，非常適合進(jìn)行大規(guī)模微生物樣品的快速篩選［20-22］。雖然MALDI-MS通量顯著提高，樣品處理步驟減少，但是目前基于真空采樣的MALDI技術(shù)可能受限于對(duì)不穩(wěn)定或揮發(fā)性小分子的檢測(cè)。此外，基質(zhì)的應(yīng)用和共結(jié)晶的異質(zhì)性可能會(huì)影響菌的表型定量，同時(shí)高豐度的背景峰可能會(huì)對(duì)小分子的檢測(cè)靈敏度產(chǎn)生影響［12］。此外，MALDI-MS適用于直接檢測(cè)革蘭氏陰性菌細(xì)胞，而對(duì)于革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞的檢測(cè)通常需要先制備全細(xì)胞裂解液或粗細(xì)胞提取物，然后再進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。

1.2 原位電離質(zhì)譜技術(shù)

AI-MS技術(shù)是由質(zhì)譜學(xué)家Cooks教授于2004年首次提出［10，23］。該技術(shù)在常壓條件下，無(wú)需或僅需極少樣品前處理過(guò)程，便可直接實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品待測(cè)組分的質(zhì)譜分析。AI-MS已成為質(zhì)譜科學(xué)和儀器研究的焦點(diǎn)，同時(shí)也催生了基于不同電離機(jī)制的原位電離技術(shù)。無(wú)需或僅需極少樣品前處理，AI-MS即可在常壓敞開條件下直接對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析，因此在完整微生物細(xì)胞的直接檢測(cè)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本文將重點(diǎn)介紹基于電噴霧、激光和等離子體的AI技術(shù)（表1），并詳細(xì)描述它們?cè)谖⑸锛?xì)胞檢測(cè)中的應(yīng)用。

表1 原位電離技術(shù)及在微生物檢測(cè)中的應(yīng)用案例Table 1 AI techniques and their application examples in microbial detection

1.2.1 基于電噴霧的原位電離技術(shù)

解吸電噴霧電離（desorption electrospray ionization，DESI）技術(shù)首次由Cooks團(tuán)隊(duì)提出，是一種基于電噴霧電離的AI技術(shù)。在DESI［圖2（a）］中，帶電溶劑在高速氣流的輔助下形成初級(jí)微滴，解吸和電離樣品表面的待測(cè)組分，隨后形成次級(jí)微滴，并在飛濺過(guò)程中被引入質(zhì)譜儀進(jìn)行分析［10，23，51］。DESI技術(shù)具有實(shí)時(shí)、表面和原位檢測(cè)固體樣品表面痕量組分的能力［51］。隨著AI-MS技術(shù)的不斷發(fā)展，DESI技術(shù)也得到了持續(xù)改進(jìn)和優(yōu)化，以適應(yīng)各種實(shí)際應(yīng)用領(lǐng)域［51-59］。本節(jié)將重點(diǎn)介紹DESI-MS在完整微生物細(xì)胞分析方面所取得的應(yīng)用進(jìn)展。

第一個(gè)應(yīng)用案例是Cooks團(tuán)隊(duì)［24］首次采用DESIMS技術(shù)對(duì)3種大腸桿菌菌株（DH10B，JM109和XL1-Blue）和2種鼠傷寒沙門氏菌菌株（TL212和LT1）的完整細(xì)胞進(jìn)行了分析。在DESI-MS實(shí)驗(yàn)中，首先將1 μL的新鮮細(xì)胞懸浮液均勻沉積（約0.5 cm2）在載玻片上。接下來(lái)，在室溫下將載玻片上的細(xì)胞懸浮液蒸干約1～2 min，以除去水分。然后，使用50%甲醇水溶液作為電噴霧試劑，對(duì)細(xì)胞中的分子進(jìn)行解吸和電離。同一平板上培養(yǎng)的2個(gè)菌落的分析時(shí)間間隔設(shè)置為5 min。該研究成功獲取了5種革蘭氏陰性菌活細(xì)胞的脂質(zhì)（主要為磷脂）指紋圖譜。通過(guò)主成分分析，可以區(qū)分不同的菌種和菌株。除此之外，DESI-MS還被用于表征革蘭氏陽(yáng)性菌枯草芽孢桿菌菌株生物膜的指紋圖譜［25］。這些指紋圖譜主要包含了枯草芽孢桿菌外泌的表面活性脂肽（C13、C14、C15等）的信息，可用于微生物的鑒定和表征。

第二個(gè)應(yīng)用案例是McLean團(tuán)隊(duì)［26-27］采用DESI-MS結(jié)合微孔膜支架方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)完整菌落細(xì)胞的分析。在實(shí)驗(yàn)中，微生物菌落被培養(yǎng)在瓊脂基質(zhì)的膜支架上，然后將膜從瓊脂中取出并貼在載玻片上，直接進(jìn)行DESI-MS檢測(cè)。DESIMS采樣和無(wú)監(jiān)督分割方法相結(jié)合，可以進(jìn)行微生物相互作用的空間化學(xué)分析［26］，以及微生物菌落的非定向分析［27］。需要注意的是，DESI-MS技術(shù)本質(zhì)上是一種表面分析技術(shù)，主要用于測(cè)量細(xì)胞外泌代謝物和與細(xì)胞膜相關(guān)的分子，很難提供細(xì)胞內(nèi)代謝物分子信息。

納解吸電噴霧電離（nano-DESI）技術(shù)是由Laskin團(tuán)隊(duì)首次提出的［圖2（b）］［28，30，60-61］。該技術(shù)利用初級(jí)熔融石英毛細(xì)管將溶液輸送到樣品表面，在距離質(zhì)譜口附近的自吸式納毛細(xì)管與樣品表面形成液橋（直徑為10～200 μm），溶解并提取樣品表面分析物，然后通過(guò)納毛細(xì)管將其輸送至質(zhì)譜口處進(jìn)行電離。nano-DESI技術(shù)實(shí)現(xiàn)了高度局部化采樣，通過(guò)減小液橋與樣品接觸面積可以提高空間分辨率，而增大液橋與樣品接觸面積可以提高質(zhì)譜電離效率。DESI和nano-DESI都屬于常壓下的液體萃取電離技術(shù)，它們之間的區(qū)別在于：DESI利用高速氣流輔助溶液霧化形成帶電液滴，對(duì)樣品表面分子進(jìn)行解吸和電離；而nano-DESI則通過(guò)每分鐘納升級(jí)的流速形成恒定液橋，無(wú)需氣流輔助，從而消除了樣品濺射現(xiàn)象，并提高了采樣效率。

使用nano-DESI技術(shù)可以溫和地對(duì)表面微生物進(jìn)行提取和分析，從而直接分析活菌落，也可以用于表征和鑒定微生物相互作用的分子特征（表1）［28，30］。Laskin團(tuán)隊(duì)［30］使用nano-DESI技術(shù)對(duì)瓊脂平板上共培養(yǎng)的2種細(xì)菌菌株鏈霉菌（Streptomyces coelicolorA3）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilisPY79）進(jìn)行分析，獲取它們的空間分子特征。通過(guò)利用nano-DESI-MS/MS數(shù)據(jù)建立細(xì)菌相互作用期間釋放的代謝物分子網(wǎng)絡(luò)，鑒定出1種新的枯草芽孢桿菌表面活性素類似物。同時(shí)，結(jié)合nano-DESI-MS與分子網(wǎng)絡(luò)分析，可以檢測(cè)到假單胞菌菌株（Pseudomonassp. SH-C52）中一種預(yù)測(cè)但尚未經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)的脂肽thanamycin。此外，該團(tuán)隊(duì)利用nano-DESI技術(shù)對(duì)瓊脂平板上的集球藻屬菌落（Synechococcussp. PCC 7002）進(jìn)行快速分析［29］，發(fā)現(xiàn)幾種未曾報(bào)道的單半乳糖基二?；视秃投肴樘腔；视头肿印Ｍㄟ^(guò)使用一維掃描獲取瓊脂上代謝物的化學(xué)梯度，成功鑒定出菌落釋放到瓊脂上的糖基甘油和蔗糖兩種代謝物。此外，nano-DESI實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明了代謝物擴(kuò)散與菌落的年齡存在相關(guān)性。

紙噴霧電離（paper spray ionization，PSI）技術(shù)是由Cooks團(tuán)隊(duì)首次提出的［圖2（c）］，不同DESI和nano-DESI技術(shù)，PSI技術(shù)是用紙作為樣品載體，具有電噴霧電離和原位電離的特點(diǎn)，可用于快速進(jìn)行復(fù)雜混合物的定性和定量分析［62-66］。在PSI源中，使用一片三角紙作為紙基，位于質(zhì)譜口的前端。通過(guò)一個(gè)銅夾施加高電壓（3～5 kV）到紙基上，然后將含有分析物的溶劑添加到紙基上形成離子，進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)［62］。PSI技術(shù)集成了樣品的收集、分析物的分離和分析物的電離三個(gè)步驟，具有低成本、易制備和易于進(jìn)行化學(xué)改性等優(yōu)點(diǎn)，在簡(jiǎn)單樣品處理和電離方面具有廣闊應(yīng)用前景。作者開發(fā)了一種PSI-MS結(jié)合同位素內(nèi)標(biāo)方法，用于快速分析土壤和沉積物中有機(jī)污染物四溴雙酚A［67］。在該方法中，將甲醇提取物和同位素內(nèi)標(biāo)加載到紙基上，然后通過(guò)在紙基上施加高電壓的方式，使得分析物在紙基尖端處被電離并引入質(zhì)譜。PSI-MS能夠在1 min內(nèi)完成單個(gè)樣品的檢測(cè)，其線性范圍為0.1～100 μg/L，檢測(cè)限為0.039 μg/L，是一種快速和有效的分析方法。Cooks團(tuán)隊(duì)［31］還利用PSI-MS技術(shù)，在無(wú)需樣品制備的情況下，快速區(qū)分了不同種類的細(xì)菌。在PSIMS中，將細(xì)菌菌落（約100 μg）涂抹在三角紙表面中間位置，滴加15 μL溶劑濕潤(rùn)紙基，并施加高電壓。在電場(chǎng)作用下，帶電液滴被引入質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。每個(gè)樣品的采集時(shí)間為1～2 min。PSIMS技術(shù)通過(guò)獲取細(xì)菌細(xì)胞膜的磷脂特征質(zhì)譜圖譜，并結(jié)合主成分分析和線性判別分析，成功區(qū)分了革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌的8個(gè)不同屬，共計(jì)16種不同物種。此外，該團(tuán)隊(duì)還使用PSI-MS技術(shù)直接對(duì)2種微藻菌株片劑Kyo-Chlorella和Nannochloropsisform中的極性脂質(zhì)進(jìn)行了表征［32］。

微滴撞擊誘導(dǎo)噴霧電離（microdroplet impactinduced spray ionization，MISI）技術(shù)由Basuri團(tuán)隊(duì)提出［圖2（d）］［33］，與PSI技術(shù)類似。在MISI技術(shù)中，通過(guò)在第一張紙基上施加高電壓，產(chǎn)生帶電微滴。這些帶電微滴沉積在第二張紙基上，該紙基含有流動(dòng)的分析物溶液。通過(guò)電荷轉(zhuǎn)移反應(yīng)，在紙基尖端產(chǎn)生攜帶分析物的二次帶電微滴，然后將這些微滴引入質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)。MISI技術(shù)最多可以串聯(lián)三個(gè)級(jí)聯(lián)噴霧源。由于高電壓沒(méi)有直接施加在分析物的紙基上，MISI可以作為一種非入侵方法，用于原位檢測(cè)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）和惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）中的脂質(zhì)分布，以區(qū)分不同種類的細(xì)菌。整個(gè)MISI分析過(guò)程可以在1～2 min內(nèi)完成，且細(xì)菌細(xì)胞在經(jīng)過(guò)多次MISI分析后仍保持89%的活力。與標(biāo)準(zhǔn)PSI相比，MISI在沒(méi)有直接施加高電壓到樣品上的方面更具優(yōu)勢(shì)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)活細(xì)菌樣本的無(wú)創(chuàng)原位檢測(cè)，并通過(guò)特征脂質(zhì)分布區(qū)分不同種類的細(xì)菌。

熱解吸-電噴霧電離（thermal desorptionelectrospray ionization，TD-ESI）質(zhì)譜由謝建臺(tái)團(tuán)隊(duì)提出，是一種通過(guò)熱輔助解吸細(xì)菌細(xì)胞分析物的電噴霧質(zhì)譜技術(shù)［圖2（e）］［34］。該方法涉及使用金屬探針采集培養(yǎng)皿中的菌落樣品，進(jìn)行溶劑提取。隨后，將探針插入到TD-ESI源中，進(jìn)行熱解吸分析物，并在氮?dú)獾妮o助下將解吸的分析物輸送到ESI噴霧中進(jìn)行電離。最后，進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。整個(gè)過(guò)程在1 min內(nèi)完成。TD-ESI-MS技術(shù)能夠同時(shí)獲得5種革蘭氏陰性菌和5種革蘭氏陽(yáng)性菌的脂質(zhì)譜圖，結(jié)合主成分分析（PCA）和層次聚類分析（HCA），通過(guò)脂質(zhì)譜圖差異性來(lái)區(qū)分不同細(xì)菌物種。該方法在細(xì)菌蛋白質(zhì)譜圖的MALDI-MS分析中也得到了驗(yàn)證。

簡(jiǎn)易環(huán)境聲波噴霧電離（easy ambient sonicspray ionization，EASI）技術(shù)由Eberlin團(tuán)隊(duì)于2006年引入［圖2（f）］［68-69］。不同于以上AI技術(shù)，該技術(shù)不需要使用加熱、高壓、激光、電暈放電或輔助氣體，僅依靠聲波噴霧生成密集的帶電液滴云，用于分析物的收集和電離。EASI技術(shù)是一種最簡(jiǎn)單、最容易實(shí)現(xiàn)的原位電離技術(shù)。在EASI技術(shù)中，通過(guò)聲速流動(dòng)的氮?dú)鈾C(jī)械破壞溶液中均勻分布陽(yáng)離子和陰離子，將溶液均勻分解成非常小的液滴。然后，這些帶有正負(fù)電荷的液滴流束擊中沉積有分析物的表面，實(shí)現(xiàn)液滴的萃取和分析物的電離過(guò)程。這些產(chǎn)生的分析物離子隨后會(huì)從液滴中釋放到氣相中，并進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)行進(jìn)一步分析［70］。EASI-MS已成功應(yīng)用于研究藍(lán)藻在不同生長(zhǎng)條件下的脂質(zhì)變化［35-36］。例如，劉虎威團(tuán)隊(duì)［36］利用EASI-MS研究了單細(xì)胞藍(lán)藻［聚囊藻（Synechocystis6803）和聚球藻（Synechococcus7002）］、絲狀藍(lán)藻［魚腥藻（Anabaena7120）］在不同生長(zhǎng)階段中脂質(zhì)硫酸喹諾糖二酰甘油（SQDG）和磷脂酰甘油（PG）的變化情況。研究發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)成分可用于確定藍(lán)藻的生長(zhǎng)狀態(tài)，進(jìn)一步了解藍(lán)藻細(xì)胞的生理狀態(tài)。結(jié)果顯示，這3種藍(lán)藻在不同培養(yǎng)時(shí)間下的SQDG/PG比例顯著降低，脂質(zhì)的不飽和水平也發(fā)生顯著變化。

張新榮團(tuán)隊(duì)開發(fā)了幾種微萃取結(jié)合電噴霧質(zhì)譜技術(shù)，用于單細(xì)胞中代謝物的分析，如探針電噴霧質(zhì)譜（probe ESI-MS，PESI-MS）［71］、尖端溶劑萃取質(zhì)譜（in-tip solvent microextraction MS，ITSME-MS）［37］、脈沖直流電噴霧電離質(zhì)譜（Pico-ESI-MS）［72］。其中，ITSME-MS是一種用于分析單個(gè)細(xì)胞脂滴中磷脂酰膽堿和甘油三酯分子的新方法［圖2（g）］［37］。該方法首先使用納米尖端吸入單個(gè)脂滴，然后在納米尖端內(nèi)注入脂質(zhì)提取溶劑，并進(jìn)行nanoESI-MS分析。在尖端區(qū)域形成梯度溶液體系，從水性緩沖溶液到疏水性的有機(jī)溶劑，依次分離和分析磷脂酰膽堿和甘油三酯分子。這種方法已成功應(yīng)用于分析HepG2細(xì)胞中的脂滴，并比較了不同脂滴的脂質(zhì)譜。

Sciex Echo-MS和微流體質(zhì)譜是具有高通量分析潛力的重要平臺(tái)。Echo-MS平臺(tái)利用聲學(xué)液體處理機(jī)器人，將納升級(jí)別的液滴從微孔板中噴射到開放端口接口（open-port probe，OPP）中。OPP攜帶流動(dòng)的溶劑流，在0.5～2 s的循環(huán)時(shí)間內(nèi)進(jìn)入ESI源進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)［73］。多重反應(yīng)檢測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）作為Echo-MS檢測(cè)技術(shù)，用于分析物的定量檢測(cè)［38］。該平臺(tái)適用于高通量分析微孔板中的細(xì)胞外上清液或粗細(xì)胞提取液［38，73］。微流體平臺(tái)具有產(chǎn)生微升級(jí)別水滴的能力，這些水滴可以分散在不相容的流體中，用于捕獲和培養(yǎng)單個(gè)細(xì)胞［39］。在培養(yǎng)完成后，這些水滴中的內(nèi)容物能夠以30滴/s的速率直接進(jìn)行在線ESI-MS檢測(cè)［74］，也可以將水滴點(diǎn)樣到樣品靶板上，以1個(gè)樣品/s的速率進(jìn)行離線MALDI-MS檢測(cè)［40，75］。微流體質(zhì)譜平臺(tái)適用于檢測(cè)培養(yǎng)液中細(xì)胞外泌的代謝表型分子［39］。

1.2.2 基于激光的原位電離技術(shù)

基于激光的原位電離技術(shù)通常利用紫外（ultraviolet，UV）或紅外（infrared，IR）脈沖激光，以有效促進(jìn)樣品燒蝕或解吸，然而激光光源的電離效率相對(duì)較低，導(dǎo)致在激光燒蝕或解吸過(guò)程中生成的大部分分子仍是中性的［76］。因此，大多數(shù)基于激光的AI-MS技術(shù)采用了耦合二次電離方法，如電噴霧輔助激光解吸/電離（electrospray assisted laser desorption/ionization，ELDI）、LAESI、MALDESI［76-82］。

激光燒蝕電噴霧電離（laser ablation electrospray ionization，LAESI）技術(shù)于2007年由Vertes團(tuán)隊(duì)提出［圖3（a）］，并詳細(xì)闡述了該電離源的構(gòu)造、電離機(jī)理及其實(shí)際應(yīng)用［42-43，83-90］。LAESI源利用中紅外脈沖激光（例如Er：YAG固態(tài)激光器，波長(zhǎng)2.94 μm）聚焦到樣品表面，通過(guò)燒蝕和解吸產(chǎn)生氣相分子羽流。隨后，在與正交電噴霧羽流相互作用的過(guò)程中，將這些分子電離并引入質(zhì)譜［76，91］。由于水分子中O—H鍵可強(qiáng)烈吸收中紅外光，因此，LAESI技術(shù)適用于在常壓下直接檢測(cè)含水樣品，例如細(xì)胞和組織［42，92］。與ESI相似，LAESI也適用于極性分子的分析。在LAESI的源構(gòu)造中，采用了類似于nanoESI源的配置，其中毛細(xì)管被用作噴霧發(fā)射器，無(wú)需氣動(dòng)輔助電離。激光燒蝕具有在受限區(qū)域內(nèi)進(jìn)行采樣的能力，同時(shí)具備高重復(fù)性和高通量性，因此適用于復(fù)雜樣品的質(zhì)譜成像研究［84］。在沒(méi)有對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理和不添加任何基質(zhì)的情況下，Vertes團(tuán)隊(duì)［41］利用LAESI-MS對(duì)細(xì)菌菌落的生長(zhǎng)、代謝和抗生素抑制進(jìn)行了分子成像研究。他們使用單脈沖激光（0.9 mJ）聚焦在大腸桿菌菌落上，產(chǎn)生直徑為150 μm、深度為25 μm的燒蝕坑，然后對(duì)菌落及瓊脂進(jìn)行分析，以獲取菌落內(nèi)源性代謝物和脂質(zhì)的分布情況。

圖3 基于等離子體和激光的原位電離技術(shù)示意圖Fig.3 Diagram of ambient ionization sources based on plasma and laser

激光輔助快速蒸發(fā)電離（laser-assisted rapid evaporative ionization，LA-REI）MS平臺(tái)由Takáts團(tuán)隊(duì)提出［圖3（b）］［44］，同樣不需要添加基質(zhì)即可原位檢測(cè)菌樣品。該平臺(tái)利用二氧化碳激光器促使樣品進(jìn)行熱解吸，并結(jié)合快速蒸發(fā)電離方法實(shí)現(xiàn)電離。LA-REI-MS可直接對(duì)瓊脂平板上菌落進(jìn)行分析。激光產(chǎn)生約500 μm光斑照射在菌落上，產(chǎn)生的蒸氣流通過(guò)PTFE管道運(yùn)輸?shù)劫|(zhì)譜口處進(jìn)行電離。整個(gè)菌落分析過(guò)程只需約8 s即可完成。LA-REI-MS被用于對(duì)具有臨床意義的15種微生物中的25個(gè)分離株進(jìn)行形態(tài)分析，使用隨機(jī)森林模型進(jìn)行留一法交叉驗(yàn)證，分類準(zhǔn)確率達(dá)到了97.2%。

基質(zhì)輔助激光解吸電噴霧電離（matrix assisted laser desorption electrospray ionization，MALDESI）技術(shù)于2006年由Muddiman團(tuán)隊(duì)引入［圖3（c）］［82，93］。該技術(shù)的解吸和電離機(jī)理與LAESI技術(shù)相似，使用337 nm UV或2.94 μm IR激光器蒸發(fā)樣品表面分子，形成氣相分子羽流，并與正交電噴霧羽流相互作用發(fā)生電離，引入質(zhì)譜。MALDESI使用內(nèi)源性水和外源冰作為基質(zhì)，以更好地從樣品表面解吸化合物［94-95］。MALDESI-MS可用于對(duì)單個(gè)細(xì)胞的脂質(zhì)進(jìn)行快速靈敏分析［45］。在這項(xiàng)研究中，無(wú)需提取和/或富集分析物，而是直接將HeLa細(xì)胞分散在載玻片上，MALDESI源對(duì)細(xì)胞分子進(jìn)行采樣和電離。該方法能夠檢測(cè)出45種主要為磷脂的脂質(zhì)物種。該研究結(jié)果證實(shí)了MALDESI-MS在快速脂質(zhì)組學(xué)分析中的可行性和有效性。

大氣壓激光電離質(zhì)譜（atmospheric pressure laserspray ionization mass spectrometry，AP-LSI mini MS）是由徐偉團(tuán)隊(duì)提出，并成功應(yīng)用于直接細(xì)菌分析［圖3（d）］［46］。在該研究中，首先將瓊脂平板上的細(xì)菌懸浮在甲醇水溶液中，濃度為2×107cfu/mL。然后，將5 μL基質(zhì)溶液和細(xì)菌溶液分別加載到樣品板上，在質(zhì)譜入口處進(jìn)行激光燒蝕解吸和電離，再引入質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。該方法每次質(zhì)譜掃描可檢測(cè)到約1000 cfu的細(xì)菌。該工作無(wú)需復(fù)雜的提取和制備步驟，即可獲得細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜中寡肽和脂質(zhì)等小分子的指紋譜，同時(shí)，結(jié)合監(jiān)督多變量統(tǒng)計(jì)方法正交偏最小二乘法，可在屬和種水平上區(qū)分出21種食源性細(xì)菌。

大氣壓基質(zhì)輔助激光解吸/電離（atmospheric pressure matrix-assisted laser desorption/ionization，AP-MALDI）技術(shù)由Laiko團(tuán)隊(duì)首次引入［96］。APMALDI可與多種MS儀配合使用，只需進(jìn)行少量改造，其小激光光斑尺寸使其具有更高的分辨率和更好的重復(fù)性。通過(guò)改善激光的聚焦直徑，可以在自然條件下實(shí)現(xiàn)1.4 μm的橫向分辨率［47］。Voorhees團(tuán)隊(duì)使用AP-MALDI-MS對(duì)瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的球狀芽孢桿菌（Bacillus globigii，BG）培養(yǎng)物進(jìn)行了分析，它們使用脈沖紫外激光照射基質(zhì)CHCA與完整的BG細(xì)胞共結(jié)晶樣品，并成功檢測(cè)到生物標(biāo)志物環(huán)狀脂肽［97］。

1.2.3 基于等離子體的原位電離技術(shù)

實(shí)時(shí)直接分析（direct analysis in real time，DART）技術(shù)于2005年由Cody團(tuán)隊(duì)首次提出，是第一個(gè)基于等離子體的AI技術(shù)，并且仍然是目前最常用的技術(shù)之一［圖3（e）］［98］。在DART源中，載氣（通常為氦氣、氬氣和氮?dú)猓┍┞队陔姇灧烹娽樦?，通過(guò)電暈放電的方式使氣體分子激發(fā)到亞穩(wěn)態(tài)。然后，亞穩(wěn)態(tài)分子與空氣中的水分子發(fā)生反應(yīng)，形成質(zhì)子化的水簇，從而對(duì)質(zhì)譜口處的樣品進(jìn)行解吸和電離。該方法通過(guò)加熱氣體來(lái)提高樣品表面分子的解吸效率，進(jìn)而提高靈敏度。DART技術(shù)適用于分析分子質(zhì)量小于1000 Da的揮發(fā)性化合物。DART源能夠解吸和電離樣品表面分子，但無(wú)法直接分析完整的細(xì)胞。Pierce團(tuán)隊(duì)［48］采用DART-MS分析細(xì)菌細(xì)胞中脂肪酸甲酯離子。他們將全細(xì)菌細(xì)胞懸浮液與甲基化試劑氫氧化四甲基銨混合，并沉積在毛細(xì)管底部。DART源提供500 ℃氦氣流與毛細(xì)管底部樣品接觸，使細(xì)菌細(xì)胞發(fā)生原位甲酯化和電離，并將離子引入質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。Cody團(tuán)隊(duì)［99］采用DART-MS表征脂肪酸來(lái)鑒定細(xì)菌，而無(wú)需進(jìn)行衍生化和樣品處理。DART源在進(jìn)行脂質(zhì)分析時(shí)，通過(guò)在熔融棒上提供350 ℃的氦氣流，對(duì)細(xì)胞脂質(zhì)提取液進(jìn)行處理，并鑒定其中的多種脂肪酸、甘油酯和磷脂。由于高溫氣流的作用，部分脂質(zhì)會(huì)發(fā)生熱分解反應(yīng)產(chǎn)生脂肪酸離子。因此，DART源并不適用于分析熱不穩(wěn)定的揮發(fā)性分子。

介質(zhì)阻擋放電電離（dielectric barrier discharge ionization，DBDI）和低溫等離子體（low-temperature plasma，LTP）是利用低溫等離子體進(jìn)行樣品分析的AI技術(shù)。DBD是通過(guò)在由絕緣屏障隔開的兩個(gè)電極之間施加高壓交流電來(lái)產(chǎn)生放電的技術(shù)。DBDI是張新榮團(tuán)隊(duì)在2007年首次提出的一種應(yīng)用該原理的離子化技術(shù)［100］。DBDI技術(shù)由針電極、銅電極和兩者之間裝有樣品的載玻片組成。針電極尖端產(chǎn)生等離子體會(huì)直接作用于載玻片上的樣品，引發(fā)其解吸和電離［圖3（f）］。Liu團(tuán)隊(duì)［49］采用nanoESI-DBDI源在單個(gè)植物細(xì)胞（洋蔥）和人體細(xì)胞（PANC-1）中檢測(cè)極性和非極性化合物 。在該實(shí)驗(yàn)中，他們使用內(nèi)徑為1 μm的毛細(xì)管插入細(xì)胞中進(jìn)行采樣，并使用nanoESI源對(duì)細(xì)胞中極性代謝物進(jìn)行直接電離；而DBDI則作為后電離源，用于電離細(xì)胞中的非極性代謝物。在nanoESI（3.5 kV）-DBDI（2.6 kV）模式下，他們成功檢測(cè)到洋蔥細(xì)胞中的49種化合物和PANC-1細(xì)胞中的73種化合物。這種串聯(lián)模式的應(yīng)用提高了細(xì)胞中不同極性代謝物的檢測(cè)范圍、電離效率和檢測(cè)限。通過(guò)結(jié)合nanoESI和DBDI技術(shù)，研究人員可以更全面地分析細(xì)胞中的代謝產(chǎn)物，提供了對(duì)細(xì)胞代謝的更深入了解。Liu團(tuán)隊(duì)［101］提出了一種基于活性毛細(xì)管DBDI-MS的高通量和無(wú)標(biāo)記單細(xì)胞分析方法。在該研究中，電離過(guò)程發(fā)生在與質(zhì)譜儀連通的毛細(xì)管內(nèi)，通過(guò)這種方式大大提高了穩(wěn)定性和離子傳輸效率。DBDI-MS平臺(tái)能夠同時(shí)分析單個(gè)細(xì)胞中多種代謝物，包括有機(jī)酸、羰基化合物、雜環(huán)化合物和脂質(zhì)等。通過(guò)該方法，研究人員能夠根據(jù)代謝譜中的特征，將不同的細(xì)胞類型進(jìn)行區(qū)分，如293T、PANC-1、CFPAC-1、HeLa和iBAs。這種單細(xì)胞分析方法的檢測(cè)通量約為38個(gè)細(xì)胞/min，實(shí)現(xiàn)了高通量分析的目標(biāo)。

LTP［圖3（g）］探針是DBDI技術(shù)的一種變體，利用DBD產(chǎn)生低溫等離子體［102］。LTP探針的結(jié)構(gòu)由一個(gè)玻璃管作為介電屏障，將內(nèi)部接地電極和外部帶電銅帶電極分隔開來(lái)。通過(guò)施加交流電壓，形成DBD等離子體，并直接與樣品相互作用，使樣品中的分子發(fā)生電離，并引入質(zhì)譜［102］。Zhang團(tuán)隊(duì)［50］使用LTP-MS技術(shù)對(duì)來(lái)自細(xì)菌樣品中的脂肪酸乙酯（fatty acid ethyl esters，F(xiàn)AEE）進(jìn)行了檢測(cè)。在實(shí)驗(yàn)中，他們選取了16種不同細(xì)菌（約109cfu/mL）懸浮在70%乙醇中。不需要進(jìn)行提取或其他樣品制備步驟，只需取1.5 μL樣品沉積在載玻片上，并等待其干燥后進(jìn)行LTP-MS分析。通過(guò)這種方法，成功獲得了16種細(xì)菌的特征FAEE質(zhì)譜圖。在這種方法中，利用LTP-MS技術(shù)獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，結(jié)合主成分分析方法，可以對(duì)細(xì)菌進(jìn)行區(qū)分和分類。然而，需要注意的是，作為表面分析技術(shù)，如DART、DBDI和LTP等，在對(duì)完整細(xì)胞進(jìn)行分析時(shí)存在一定的挑戰(zhàn)。

2 微生物突變文庫(kù)高通量篩選應(yīng)用案例

2.1 基質(zhì)輔助激光解吸/電離質(zhì)譜

MALDI-MS是一種成熟的高通量分析的平臺(tái)，非常適用于大規(guī)模微生物樣品的高通量篩選（表2）［21-22，103-104］。

表2 主要原位電離技術(shù)及在菌株篩選和成像中的應(yīng)用案例Table 2 Main AI techniques and their application examples in microbial strain screening and imaging

Zhao團(tuán)隊(duì)［22，104］多年來(lái)一直致力于開發(fā)無(wú)標(biāo)記的高通量細(xì)菌菌落MALDI-MS方法，用于酶突變文庫(kù)的高通量篩選。該團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種圖像引導(dǎo)質(zhì)譜方法，能夠在菌落、液態(tài)微滴等多種樣品類型中，識(shí)別和分析所選定位置的目標(biāo)，實(shí)現(xiàn)高通量分析［104］。這種方法在酵母脂肪酸合成酶突變體菌落的篩選中得到了應(yīng)用。通過(guò)該方法，發(fā)現(xiàn)了5個(gè)菌落的脂肪酸C16：1和C18：1比值的平均值為18.1±1.1，明顯高于其他菌落。進(jìn)一步的DNA測(cè)序驗(yàn)證了這5個(gè)菌株都是G1250S突變體。

此外，司同團(tuán)隊(duì)［103］采用無(wú)標(biāo)記質(zhì)譜的方法進(jìn)行定向進(jìn)化新酶的活性篩選。在這項(xiàng)研究中，他們通過(guò)位點(diǎn)飽和誘變和epPCR文庫(kù)在重組大腸桿菌中自動(dòng)創(chuàng)建和培養(yǎng)表達(dá)環(huán)二肽合成酶（CDPS）突變體，并提取和準(zhǔn)備樣品。采用MALDI-MS 對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)（每個(gè)樣品用時(shí)5 s），并通過(guò)自定義的計(jì)算方法處理獲取的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。使用多變量分析方法，對(duì)在115～373 Da范圍內(nèi)的190個(gè)可能的二酮類肽分子的108個(gè)理論質(zhì)荷比值進(jìn)行分析。通過(guò)這種方法，該研究在一周內(nèi)對(duì)4500個(gè)epPCR文庫(kù)菌株進(jìn)行了篩選，并成功鑒定出1個(gè)產(chǎn)生新環(huán)二肽產(chǎn)物（L-Phe-L-Val）的F186L CDPS突變體。這個(gè)發(fā)現(xiàn)揭示了先前未知的殘基F186在底物特異性上的顯著影響。此外，該團(tuán)隊(duì)還報(bào)道了在深圳合成生物學(xué)基礎(chǔ)設(shè)施的集成機(jī)器人工作單元上，羊毛硫肽突變體庫(kù)的自動(dòng)化高通量篩選流程［109］。該流程包括DNA文庫(kù)構(gòu)建、宿主轉(zhuǎn)化、肽生產(chǎn)、質(zhì)譜分析和瓊脂擴(kuò)散測(cè)定的活性篩選。其中，在對(duì)重組生產(chǎn)的Halα肽進(jìn)行的篩選中，該團(tuán)隊(duì)在數(shù)周內(nèi)完成了微孔板中380個(gè)單殘基突變體和大于1300個(gè)三重殘基組合突變體的序列活性關(guān)系的快速分析，并發(fā)現(xiàn)1種Halα突變體，該突變體相對(duì)野生型具有增強(qiáng)的特異抗菌活性。這項(xiàng)工作展示了高通量和自動(dòng)化篩選流程在羊毛硫肽突變體庫(kù)中的應(yīng)用，有助于發(fā)現(xiàn)具有改進(jìn)特性的突變體。

2.2 原位電離質(zhì)譜

DESI-MS和LA-REI-MS是可通過(guò)原位檢測(cè)活菌落來(lái)實(shí)現(xiàn)突變文庫(kù)高通量篩選的兩種典型原位電離質(zhì)譜技術(shù)，下面重點(diǎn)介紹它們?cè)诰旰Y選中的應(yīng)用案例。

Barran團(tuán)隊(duì)［107］開發(fā)一種無(wú)標(biāo)記篩選平臺(tái)，利用DESI結(jié)合離子淌度質(zhì)譜成像（mass spectrometry imaging，MSI）技術(shù)，在活菌落中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的分析（表2）。該平臺(tái)的操作步驟如下：首先，在瓊脂平板的尼龍膜上接種含有所需質(zhì)粒/文庫(kù)的大腸桿菌細(xì)胞；其次，對(duì)菌落進(jìn)行孵育、誘導(dǎo)表達(dá)和培養(yǎng)，在這個(gè)過(guò)程中，生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物被產(chǎn)生并積累在菌落中；最后，使用DESI-MSI技術(shù)，可以對(duì)菌落進(jìn)行分析，每個(gè)樣品用時(shí)約10 s。通過(guò)將特定產(chǎn)物的m/z值的離子強(qiáng)度與平板表面上的x-y物理位置相關(guān)聯(lián)，可以將數(shù)據(jù)處理成可視化的分子圖像。這樣，可以檢測(cè)到每個(gè)菌落在平板上的具體物理位置，并獲得與之相關(guān)的質(zhì)譜信息。在該平臺(tái)中，首先使用DESI-MSI技術(shù)檢測(cè)苯丙氨酸氨裂解酶（PAL）催化的苯丙酸氨加成反應(yīng)。該實(shí)驗(yàn)使用攜帶活性PAL的大腸桿菌細(xì)胞菌落，將其培養(yǎng)在含有底物苯丙酸的氨基碳酸鹽緩沖液中。通過(guò)DESI-MSI監(jiān)測(cè)，可以檢測(cè)到L-苯丙氨酸（m/z164）及其他生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的生成。此外，該團(tuán)隊(duì)還利用DESI-MSI技術(shù)研究了菌落中完整細(xì)胞表達(dá)的P450單加氧酶參與的二氯芬酸的羥基化反應(yīng)。DESI-MSI技術(shù)由于其原位直接取樣、標(biāo)記自由和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，在生物催化領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。這項(xiàng)工作結(jié)合了DNA信息和DESI-MSI分析結(jié)果，發(fā)揮了重要作用，特別是在文庫(kù)篩選中。

McLean團(tuán)隊(duì)［27］采用了微孔膜支架和非靶向DESI-MSI方法，對(duì)包括工程菌株及其生物合成產(chǎn)物在內(nèi)的細(xì)菌菌落進(jìn)行了多重代謝組學(xué)分析。該方法具有直接采樣、高通量和空間分辨能力。為了進(jìn)行這項(xiàng)工作，研究團(tuán)隊(duì)首先利用基因工程手段將具有不同表達(dá)受控游離脂肪酸（FFA）組成和鏈長(zhǎng)的硫酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶（TesA）轉(zhuǎn)移到大腸桿菌中。然后，通過(guò)在瓊脂基質(zhì)的膜支架上培養(yǎng)這些轉(zhuǎn)基因大腸桿菌，研究團(tuán)隊(duì)可以根據(jù)需要的時(shí)間點(diǎn)將膜取出并固定在載玻片上。使用DESIMSI技術(shù)，無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，可以直接采樣并分析膜上的大腸桿菌及其生物合成產(chǎn)物。在這些實(shí)驗(yàn)中，典型的DESI-MSI像素尺寸為50 μm×250 μm，可以在42 min內(nèi)完成對(duì)356個(gè)菌落的采樣。該研究利用靶向檢測(cè)生物合成產(chǎn)物脂肪酸的離子圖像定位特定菌落，并結(jié)合基因編輯的預(yù)測(cè)結(jié)果，確定了具有高產(chǎn)脂肪酸C12：0的TY05菌株和高產(chǎn)脂肪酸C8：0的NHL17菌株的位置。此外，研究還采用非靶向采集和無(wú)監(jiān)督分割的方法，根據(jù)其測(cè)量的代謝組成功地鑒定了4種產(chǎn)脂肪酸的大腸桿菌菌株。通過(guò)分析所有測(cè)量特征，可以確定脂肪酸之外的樣品類型之間的分子差異，例如氨基酸、小肽、脂質(zhì)和其他小分子，這有助于深入研究代謝途徑和菌株的代謝特征。

Gowers團(tuán)隊(duì)［108］利用自動(dòng)LA-REI-MS技術(shù)對(duì)瓊脂平板上的釀酒酵母菌落進(jìn)行了快速質(zhì)譜分析（表2）。在LA-REI-MS中，高功率CO2激光以0.8 cm2面積聚焦在菌落上，通過(guò)燒蝕細(xì)胞，產(chǎn)生含有代謝物、結(jié)構(gòu)性脂質(zhì)等生物分子的氣相離子氣溶膠。這些離子氣溶膠隨后被導(dǎo)入質(zhì)譜儀進(jìn)行分析，提供即時(shí)的半定量代謝物數(shù)據(jù)。該工作流程首先對(duì)瓊脂平板上的菌落進(jìn)行光學(xué)檢測(cè)，然后使用自動(dòng)化算法選取菌落，并利用機(jī)器人輔助激光對(duì)菌落進(jìn)行掃描，每個(gè)菌落的分析時(shí)間小于10 s，實(shí)現(xiàn)了數(shù)據(jù)的快速收集。為驗(yàn)證LA-REI-MS技術(shù)的可靠性，該研究首先對(duì)產(chǎn)生紫色素的釀酒酵母菌落進(jìn)行了檢測(cè)。研究團(tuán)隊(duì)使用了模塊化DNA克隆技術(shù)將紫色素生物合成過(guò)程中的5個(gè)異源基因組裝到一個(gè)CEN/ARS質(zhì)粒中，并將其成功轉(zhuǎn)化到酵母菌中。為了構(gòu)建一個(gè)含有32個(gè)酵母菌株的組合庫(kù)，作者利用了不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子進(jìn)行基因表達(dá)，并將這個(gè)組合庫(kù)涂于含有選擇性瓊脂的平板上，以形成單個(gè)菌落。作者利用LA-REIMS技術(shù)對(duì)這些菌落進(jìn)行篩選，從中獲取分析數(shù)據(jù)，并與平板上菌落圖像進(jìn)行比較以評(píng)價(jià)篩選方法的準(zhǔn)確性。接下來(lái)，該研究利用LA-REI-MS技術(shù)對(duì)酵母生物合成的白樺酸進(jìn)行檢測(cè)。為此，研究人員采用了模塊化組裝方法，將白樺酸合成酶基因（BPLO和AtLUS1）與提高甲烷基酮途徑通量的酶基因（tHMG1和ERG9）進(jìn)行組合，并使用不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子構(gòu)建了一個(gè)組合質(zhì)粒庫(kù)。然后，將這個(gè)質(zhì)粒庫(kù)轉(zhuǎn)化到一個(gè)包含P450還原酶酵素AtATR1的單倍體酵母菌株中，共得到了36個(gè)不同的酵母菌株。作者利用LA-REI-MS和LC-MS技術(shù)獲取了這些酵母菌落中白樺酸含量的數(shù)據(jù)，并發(fā)現(xiàn)兩種分析方法之間存在顯著的相關(guān)性。最后，利用LA-REI-MS技術(shù)對(duì)上百個(gè)菌落進(jìn)行了預(yù)篩選，成功地分離并驗(yàn)證了1種白樺酸產(chǎn)量提高了2.5倍的菌株。這些結(jié)果表明，LA-REI-MS技術(shù)對(duì)于有效篩選和鑒定白樺酸產(chǎn)量高的酵母菌株具有重要意義。該研究為通過(guò)代謝工程改造酵母菌來(lái)提高白樺酸產(chǎn)量提供了有益的數(shù)據(jù)和方法。

3 質(zhì)譜成像

質(zhì)譜成像（MSI）是一種能夠在單個(gè)實(shí)驗(yàn)中可視化復(fù)雜樣品表面大量化合物空間分布的分析方法［110］。MSI實(shí)驗(yàn)首先需要制備樣品切片，然后通過(guò)各種解吸/電離方法進(jìn)行掃描和電離，獲取每個(gè)樣品采樣點(diǎn)的質(zhì)譜圖。從每張質(zhì)譜圖中提取目標(biāo)質(zhì)荷比（m/z）下每個(gè)化合物的離子強(qiáng)度，并將其組合成熱圖，以顯示該化合物在整個(gè)樣品表面的相對(duì)分布。與傳統(tǒng)的標(biāo)簽探針光學(xué)成像方法相比，MSI無(wú)需標(biāo)記即可對(duì)多種化合物進(jìn)行非靶向成像。

3.1 基質(zhì)輔助激光解吸/電離質(zhì)譜成像

MALDI-MSI是一種無(wú)標(biāo)記新技術(shù)，可生成2D離子密度圖，能夠在單次成像運(yùn)行中確定數(shù)百種分析物的空間分布［13，105-106，111-113］。

Dreisewerd團(tuán)隊(duì)［105］通過(guò)UV-MALDI-MSI技術(shù)定位活菌落。與傳統(tǒng)基質(zhì)涂層方式不同，該研究使用2.94 μm波長(zhǎng)的脈沖IR激光對(duì)細(xì)胞進(jìn)行燒蝕，產(chǎn)生氣相分子/離子流。通過(guò)使用UV激光作為定位電離源，對(duì)這些氣相流進(jìn)行電離，可將小分子代謝物、糖脂和磷脂的離子產(chǎn)量提高到幾個(gè)數(shù)量級(jí)。該工作以銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的單一和共培養(yǎng)菌落作為示范細(xì)菌系統(tǒng)，通過(guò)對(duì)細(xì)胞特異性分子進(jìn)行質(zhì)譜成像，實(shí)現(xiàn)了定位菌株在菌落中的空間位置。

Sweedler團(tuán)隊(duì)［106］采用了MALDI-MSI和熒光成像的多模態(tài)成像方法來(lái)檢測(cè)枯草芽孢桿菌菌落生物膜表面代謝物分布和基因表達(dá)模式。在該研究中，使用MALDI-MSI方法對(duì)在MSgg瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的枯草芽孢桿菌菌落生物膜進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了2種同類相食的毒素，這些毒素在以前從未報(bào)道過(guò)。多模態(tài)成像方法對(duì)3種枯草芽孢桿菌菌株進(jìn)行表征，分別為野生型分離株NCIB3610和2種突變株（Δspo0A和ΔabrB），這些菌株的生物膜分別具有缺陷和增強(qiáng)性。研究觀察到，在關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子缺失后，生物膜形態(tài)、信號(hào)傳導(dǎo)、同類相食因子分布及與基質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)都發(fā)生了相應(yīng)的變化。

3.2 原位電離質(zhì)譜成像

AI-MS具有高靈敏度、快速和易操作的優(yōu)勢(shì)，因此在質(zhì)譜成像方面被廣泛應(yīng)用［114-121］。作為質(zhì)譜成像的一個(gè)重要分支，原位質(zhì)譜成像（ambient ionization mass spectrometry imaging，AI-MSI）技術(shù)已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。在AI-MSI中，化合物在環(huán)境條件下從樣品表面解吸，并通過(guò)帶電微滴、光子或等離子體等電離方式引入質(zhì)譜儀。目前，基于不同電離方法的AI-MSI技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)、疾病診斷、藥物代謝等實(shí)際應(yīng)用領(lǐng)域［114-119， 121-124］。

DESI-MSI通過(guò)對(duì)菌落進(jìn)行質(zhì)譜成像來(lái)篩選突變菌株的典型應(yīng)用案例已在文章2.2部分展現(xiàn)［36，107］，本章節(jié)不再詳述。

Laskin團(tuán)隊(duì)［61］開發(fā)了一種結(jié)合剪切力顯微鏡的nano-DESI-MSI方法，可用于對(duì)復(fù)雜生物樣品進(jìn)行化學(xué)和形貌成像。該方法利用剪切力探頭控制nano-DESI探針和樣品之間的距離，對(duì)瓊脂平板上枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilisATCC 49760）菌落在不同生長(zhǎng)時(shí)間下進(jìn)行形貌和化學(xué)成分的成像分析。在菌落生長(zhǎng)的1 d和7 d期間，平板上菌落的直徑范圍為10～13 mm，高度為0.2～0.8 mm。菌落表面特征脂肽的分布取決于菌落的年齡，其中在1 d菌落表面上分布均勻，而在7 d菌落上則主要分布菌落的“脊”區(qū)域上。

LAESI-MS是一種檢測(cè)、成像和深度剖析生物細(xì)胞和組織中代謝物的重要工具（表1）［41，125-126］。Vertes團(tuán)隊(duì)利用LAESI-MSI與離子淌度相結(jié)合，直接在瓊脂平板上對(duì)細(xì)菌（枯草芽孢桿菌和大腸桿菌）進(jìn)行2D和3D成像。通過(guò)脂質(zhì)分子的分布來(lái)區(qū)分瓊脂平板上生長(zhǎng)的大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的區(qū)域。在枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)區(qū)域，PE（16：0/17：1）和PE（16：0/17：1）的豐度更高，而在大腸桿菌覆蓋的區(qū)域，PE（31：1）、PE（18：1/18：1）和PG（34：1）的豐度更大。該研究還探討了抗生素（鏈霉素和青霉素）與細(xì)菌培養(yǎng)物的相互作用，通過(guò)將一維數(shù)學(xué)模型擬合到瓊脂平板上的抗生素和脂質(zhì)濃度，推斷抗生素的最小抑制濃度。

Anderton團(tuán)隊(duì)［127］采用金屬輔助激光解吸/電離（metal-assisted laser desorption/ionization，MetALDI）MSI和MALDI-MSI對(duì)枯草芽孢桿菌菌落生物膜進(jìn)行分析，并獲得不同的細(xì)胞分子物種的子集。MetA-LDI-MSI主要用于鑒定多種小分子和中性脂質(zhì)，而MALDI-MSI在檢測(cè)其他脂質(zhì)和表面活性蛋白質(zhì)方面更為容易。該研究表明MetA-LDIMSI能夠顯著提高微生物樣品成像的分子覆蓋范圍。

4 總結(jié)與展望

LC-MS和GC-MS已作為現(xiàn)代分析的“金標(biāo)準(zhǔn)”，廣泛應(yīng)用于各種實(shí)際應(yīng)用領(lǐng)域中復(fù)雜樣品的分析。在進(jìn)行質(zhì)譜定性和定量分析之前，需要對(duì)復(fù)雜樣品進(jìn)行提取、純化等前處理及色譜分離等步驟。在微生物菌株檢測(cè)和突變文庫(kù)篩選中，目前的主流實(shí)驗(yàn)方法基于細(xì)胞代謝表型，包括搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)、細(xì)胞破壁、分析物提取、純化、衍生化以及色譜分離等步驟。由于該過(guò)程耗時(shí)且效率低下，制約了微生物菌株的選育進(jìn)程。MALDIMS是微生物突變文庫(kù)篩選的成熟平臺(tái)之一，具有高通量、非標(biāo)記、高靈敏等優(yōu)點(diǎn)。該質(zhì)譜技術(shù)的樣品制備過(guò)程簡(jiǎn)單，只需要將細(xì)菌樣品與基質(zhì)共同沉積在樣品靶板上進(jìn)行共結(jié)晶。MALDI-MS需要在真空條件下完成細(xì)菌樣品的直接檢測(cè)，非常適合大分子量生物分子的分析。然而，MALDIMS仍有一些局限性。例如，在真空條件下采樣可能會(huì)限制不穩(wěn)定或揮發(fā)性小分子的檢測(cè)，同時(shí)基質(zhì)的應(yīng)用可能會(huì)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，這會(huì)影響表型分子的檢測(cè)。此外，MALDI-MS更適用于直接檢測(cè)革蘭氏陰性菌細(xì)胞膜或外泌代謝表型分子的分析。然而，對(duì)于直接檢測(cè)革蘭氏陽(yáng)性菌，需要提前對(duì)細(xì)菌細(xì)胞樣品進(jìn)行預(yù)處理，例如破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)或獲取全細(xì)胞裂解液。

AI-MS技術(shù)的發(fā)展突破了經(jīng)典電離方法中有關(guān)真空和負(fù)壓的限制。除了質(zhì)譜本身的優(yōu)點(diǎn)外，AI-MS在微生物菌株檢測(cè)和篩選中具有以下優(yōu)勢(shì)：①常壓敞開源，與真空電離源和常壓封閉源不同，AI-MS可在敞開的大氣壓環(huán)境中進(jìn)行原位、表面和實(shí)時(shí)采樣分析活菌落，并可現(xiàn)場(chǎng)提取DNA；②高通量性，無(wú)復(fù)雜樣品前處理和色譜分離，單個(gè)樣品分析時(shí)間短，分析過(guò)程快速直接；③非標(biāo)記的活體檢測(cè)，可作為通用工作流程，滿足許多不同生物催化反應(yīng)的篩選需求；④質(zhì)譜成像，可視化菌落細(xì)胞表型分子的空間分布，以有效確認(rèn)微生物菌株的身份。因此，AI-MS在合成生物學(xué)微生物菌株檢測(cè)和突變文庫(kù)篩選研究中具有重要作用。然而，AI-MS技術(shù)在微生物完整細(xì)胞分析方面存在一些局限性，這些局限性與AI源構(gòu)造和電離機(jī)制相關(guān)?；陔妵婌F的AI-MS技術(shù)本身是一種表面分析技術(shù)，適合直接檢測(cè)微生物細(xì)胞表面分子，如外泌分子、細(xì)胞壁或細(xì)胞膜上分子。然而，AI源的電離能不足以直接解吸和電離胞內(nèi)分子，這使得利用此技術(shù)難以進(jìn)行胞內(nèi)分子的直接檢測(cè)。同樣，基于等離子體的AI-MS技術(shù)由于電離能的限制也無(wú)法直接檢測(cè)微生物細(xì)胞。基于激光的AI-MS技術(shù)利用激光的能量來(lái)解吸細(xì)胞分子，并通過(guò)二次電離實(shí)現(xiàn)分子的電離。例如，LAREI-MS通過(guò)直接檢測(cè)細(xì)胞脂質(zhì)來(lái)篩選菌株，這些脂質(zhì)主要為磷脂，是細(xì)胞膜的主要成分之一。然而，基于激光的AI-MS技術(shù)在檢測(cè)微生物完整細(xì)胞時(shí)尚未能直接檢測(cè)胞內(nèi)代謝表型分子。因此，為了解決微生物突變文庫(kù)篩選中的共性技術(shù)問(wèn)題，需要通過(guò)提高細(xì)胞解吸和電離效率來(lái)改進(jìn)AI-MS技術(shù)，例如使用強(qiáng)有機(jī)試劑或高能量脈沖激光來(lái)高效釋放胞內(nèi)表型分子，并使用改進(jìn)的AI源來(lái)提高細(xì)胞表型的電離效率。這些改進(jìn)是AI-MS技術(shù)的發(fā)展方向。

目前，AI-MS技術(shù)已經(jīng)成為一種成熟的技術(shù)，在完整微生物細(xì)胞分析中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。然而，在微生物突變文庫(kù)高通量篩選研究領(lǐng)域，AI-MS仍處于發(fā)展階段，并且要實(shí)現(xiàn)高通量篩選的標(biāo)準(zhǔn)化、自動(dòng)化還需要進(jìn)一步的努力。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，需要打破專業(yè)技術(shù)壁壘，融合生物、化學(xué)、機(jī)械、計(jì)算機(jī)、信息學(xué)等多種學(xué)科，建設(shè)通用高通量篩選質(zhì)譜設(shè)備和方法體系，為微生物細(xì)胞工廠開發(fā)提供共性技術(shù)平臺(tái)。基于AI-MS的高通量篩選策略在未來(lái)的合成生物學(xué)研究中將發(fā)揮重要作用。