馬翠，楊凡，張君泰，何凱

（1 中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院，廣東 深圳 518055； 2 深圳市精密工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518055）

目前生物分析技術(shù)正向高靈敏度、小劑量、高通量、多功能等趨勢(shì)發(fā)展，以微孔板為載體的多功能微孔板檢測(cè)儀是合成生物實(shí)驗(yàn)中的必備儀器。微孔板是一種高通量反應(yīng)容器，常用的96孔板每孔的容量大概是365 μL，單次檢測(cè)所需的溶液體積小且可多孔批量檢測(cè)，利用它可以提高檢測(cè)速度并降低檢測(cè)成本。微孔板讀板機(jī)、酶標(biāo)儀是針對(duì)微孔板的檢測(cè)儀器，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥檢測(cè)［1-4］。該類(lèi)儀器最早是由BioTek公司（現(xiàn)已歸入Agilent公司）生產(chǎn)研制，極大地提高了生化分析的工作效率。后來(lái)Molecular Devices、Tecan、PerkinElmer、Thermo Scientific等公司也逐漸推出了具有動(dòng)力學(xué)檢測(cè)功能、溫控功能、振板功能的酶標(biāo)儀和微孔板檢測(cè)儀，這些儀器可進(jìn)行吸光度檢測(cè)、熒光強(qiáng)度檢測(cè)、熒光偏振檢測(cè)、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)等，性能逐漸完善，功能也不斷擴(kuò)充。多功能微孔板檢測(cè)儀幾乎被這些國(guó)外知名儀器廠商所壟斷，典型的有Agilent Biotek的Synergy系列［5］、Molecular Devices公司的SpectraMax系列［6］、Tecan公司的Infinite系列［7］等。在儀器研制方面，國(guó)內(nèi)很多高校和研究機(jī)構(gòu)也開(kāi)展了相關(guān)方面的研究。如山東藥學(xué)科學(xué)院于學(xué)龍等［8］研制了多通道的吸光度檢測(cè)酶標(biāo)儀，12通道同時(shí)檢測(cè)，帶溫控功能；蘇州大學(xué)林學(xué)源等［9］增加參比光路，研制高分辨率酶標(biāo)儀；上海交通大學(xué)的朱家亮等［10］研制基于嵌入式系統(tǒng)的小型酶標(biāo)儀；浙江大學(xué)王宇等［11］研制熒光/發(fā)光檢測(cè)的多功能分析儀；華南理工大學(xué)的李強(qiáng)等［12］研制多功能熒光分析儀；杭州電子科技大學(xué)的周鵬飛等［13］研制了一套多功能微孔板分析儀樣機(jī)，包括吸光度、熒光、化學(xué)/生物發(fā)光檢測(cè)；中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所的耿旭輝團(tuán)隊(duì)［14-15］研發(fā)了小型高精度的熒光檢測(cè)模塊，達(dá)到同等儀器國(guó)際先進(jìn)水平。國(guó)內(nèi)的研究雖然取得了不少成績(jī)，但產(chǎn)業(yè)化的產(chǎn)品還不多。國(guó)內(nèi)公司生產(chǎn)的酶標(biāo)儀基本都只包含吸光度檢測(cè)功能，雖然也有相關(guān)的熒光PCR儀、發(fā)光分析儀等，但單機(jī)功能相對(duì)單一，自動(dòng)化水平不高。

合成生物學(xué)自動(dòng)化鑄造平臺(tái)將工業(yè)4.0的理念引入實(shí)驗(yàn)室，用自動(dòng)化機(jī)器代替人。通過(guò)集成軟硬件技術(shù)實(shí)現(xiàn)生物材料的自動(dòng)化合成，代替研究人員進(jìn)行海量的工程化試錯(cuò)實(shí)驗(yàn)，提升實(shí)驗(yàn)效率和操作精度［16］。微孔板檢測(cè)儀作為自動(dòng)化平臺(tái)中廣泛使用的一種檢測(cè)設(shè)備，需要能夠集成在自動(dòng)化控制系統(tǒng)中。進(jìn)口產(chǎn)品價(jià)格昂貴，操作復(fù)雜，且其控制指令自成體系，接口通常不開(kāi)放，不易集成；國(guó)內(nèi)已有設(shè)備儀器功能相對(duì)單一，同時(shí)也需要進(jìn)行改造才能集成應(yīng)用于自動(dòng)化鑄造平臺(tái)。

本研究面向合成生物學(xué)研究中對(duì)微孔板檢測(cè)儀的廣泛需求，研究高精度吸光度檢測(cè)和高靈敏度熒光檢測(cè)等關(guān)鍵技術(shù)，開(kāi)發(fā)具有吸光度檢測(cè)和熒光檢測(cè)功能的緊湊、經(jīng)濟(jì)型微孔板檢測(cè)儀，并自主開(kāi)發(fā)控制系統(tǒng)及采集分析軟件，使其易于接入合成生物自動(dòng)化鑄造平臺(tái)。

1 系統(tǒng)基本原理

作為合成生物自動(dòng)化鑄造平臺(tái)的組成部分，微孔板檢測(cè)系統(tǒng)必須實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)操作，包括進(jìn)樣的自動(dòng)化以及檢測(cè)的自動(dòng)化。系統(tǒng)發(fā)送指令，機(jī)械臂將待檢測(cè)微孔板放置在檢測(cè)平臺(tái)上，放置完成后機(jī)械臂收回，儀器蓋自動(dòng)關(guān)閉，系統(tǒng)自動(dòng)執(zhí)行檢測(cè)功能；當(dāng)檢測(cè)完成后儀器蓋自動(dòng)打開(kāi)，機(jī)械臂取出檢測(cè)完成的微孔板，進(jìn)行下一步操作。

按功能模塊設(shè)計(jì)，多功能微孔板檢測(cè)系統(tǒng)的硬件部分可以分為吸光度檢測(cè)模塊、熒光檢測(cè)模塊、控制模塊、光源模塊、電源模塊、儀器蓋自動(dòng)開(kāi)閉及微孔板進(jìn)給模塊，如圖1所示。其中，吸光度和熒光檢測(cè)模塊主要包括吸光度和熒光檢測(cè)的光路系統(tǒng)，包含光源、探測(cè)器、濾光片、準(zhǔn)直鏡、聚焦鏡等光學(xué)器件?？刂颇K需要完成微孔板機(jī)構(gòu)的運(yùn)動(dòng)控制、儀器蓋的自動(dòng)開(kāi)閉機(jī)構(gòu)運(yùn)動(dòng)、數(shù)據(jù)的采集與處理、信號(hào)的傳輸通信等。

圖1 微孔板檢測(cè)儀主要模塊Fig. 1 Main modules of microplate reader

2 系統(tǒng)開(kāi)發(fā)

微孔板檢測(cè)系統(tǒng)具有吸光度檢測(cè)、熒光檢測(cè)兩種模式，分別對(duì)應(yīng)不同的波長(zhǎng)種類(lèi)和不同的光學(xué)結(jié)構(gòu)，可獨(dú)立運(yùn)行。

2.1 光路結(jié)構(gòu)

2.1.1 吸光檢測(cè)模塊

微孔板吸光度的檢測(cè)與分光光度計(jì)類(lèi)似［17］，均是基于朗伯-比爾定律，當(dāng)一束單色光照射于介質(zhì)表面，通過(guò)一定厚度的介質(zhì)后，光會(huì)被吸收一部分，透射光會(huì)減弱。介質(zhì)的厚度和濃度越大，光強(qiáng)減弱就越明顯。吸光度或光密度OD（optical density）可以用公式表示如下：

式中，OD為光密度或吸光度；I0為入射光強(qiáng)；It為透射光強(qiáng)；T為透過(guò)率；K為摩爾系數(shù)或吸收系數(shù)；l為吸收介質(zhì)的厚度；c為物質(zhì)濃度。

光源模塊輸出的光經(jīng)過(guò)微孔板樣品后，進(jìn)入吸光度檢測(cè)光路。物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)的光具有不同的吸收能力，檢測(cè)吸收能力需要用單色光。單色光通常有兩種實(shí)現(xiàn)方法：一是單色儀分光，可以任意選擇波長(zhǎng)，波長(zhǎng)范圍寬準(zhǔn)確性高，但光能損失會(huì)較大；二是采用濾光片方式得到單色光，波段數(shù)量有限，但濾光片相對(duì)更便宜，光能損失小。不同的光學(xué)系統(tǒng)都有各自的優(yōu)點(diǎn)和局限，目前市面上的微孔板檢測(cè)儀均采用光柵單色儀或?yàn)V光片來(lái)實(shí)現(xiàn)。具有代表性的是Agilent BioTek公司提出了Hybrid混合技術(shù)［18］，將兩種光學(xué)系統(tǒng)結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)兩種方式的吸光度檢測(cè)，具有較高的靈活度。光路系統(tǒng)如圖2（a）所示，圖中黃色部分是濾光片光路系統(tǒng)，白色標(biāo)注部分是雙光柵的分光系統(tǒng)。該系統(tǒng)靈敏度高，不同光路系統(tǒng)對(duì)應(yīng)不同的應(yīng)用場(chǎng)景，應(yīng)用范圍廣，但結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜。

圖2 吸光度檢測(cè)原理Fig. 2 Principle of absorbance detection

這里我們研究緊湊、經(jīng)濟(jì)型微孔板檢測(cè)儀，僅采用濾光片方式，光路結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，要得到相同的靈敏度不需要很強(qiáng)的光源。結(jié)合濾光片輪得到多個(gè)單色光，目前包含4個(gè)濾光片（405 nm、450 nm、492 nm、630 nm），后續(xù)可擴(kuò)展。采用8路光路并行檢測(cè)來(lái)提高檢測(cè)速度，光源發(fā)出的光經(jīng)8條光纖束同時(shí)入射到8個(gè)樣品，經(jīng)樣品吸收后進(jìn)入檢測(cè)光路，被8個(gè)光電二極管同時(shí)接收。檢測(cè)前經(jīng)一組透鏡組進(jìn)行聚焦，避免多路信號(hào)的相互干擾，檢測(cè)光路示意圖如圖（2b）所示。圖2（c）是吸光度檢測(cè)的實(shí)物圖，光源選用Philips的12 V/24 W鹵鎢燈，光纖芯徑400 μm，8路探測(cè)器均采用濱松的S1133-01，光譜有效范圍320～1100 nm，感光面積2.8 mm×2.4 mm。透鏡組之間的間隔與探測(cè)器的排列尺寸對(duì)應(yīng)。

2.1.2 熒光檢測(cè)模塊

分子受到激發(fā)，吸收光子能量，從激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)返回基態(tài)時(shí)發(fā)射特定波長(zhǎng)光譜的現(xiàn)象稱(chēng)為熒光。熒光輻射比激發(fā)光能量低，發(fā)射的波長(zhǎng)比激發(fā)光的波長(zhǎng)要長(zhǎng)。熒光檢測(cè)技術(shù)具有靈敏度高、動(dòng)態(tài)范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，但也容易受環(huán)境的影響，如：熒光猝滅、光漂白等會(huì)對(duì)檢測(cè)產(chǎn)生較大的影響。不同的熒光物質(zhì)有不同的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，可用熒光對(duì)物質(zhì)進(jìn)行鑒別；同時(shí)在較低濃度下，熒光強(qiáng)度與樣品濃度存在線性變化關(guān)系，熒光檢測(cè)也可用于物質(zhì)的定量測(cè)定［19-20］。

熒光檢測(cè)系統(tǒng)中，由光源輸出光入射到微孔板樣品，激發(fā)的熒光信號(hào)進(jìn)入熒光檢測(cè)光路。光路主要包括激發(fā)光路和發(fā)射光路，激發(fā)光路是從光源輸出光照射到樣品，實(shí)現(xiàn)高效激發(fā)；發(fā)射光路用于檢測(cè)激發(fā)的熒光。熒光信號(hào)通常較弱，常用熒光檢測(cè)系統(tǒng)中，光源多采用大功率的氙燈，探測(cè)器采用高靈敏的光電倍增管PMT（photomultiplier），發(fā)射及激發(fā)光路均采用單色儀，可以實(shí)現(xiàn)光譜掃描。光路結(jié)構(gòu)如圖3（a）所示［21］，該系統(tǒng)波段范圍廣，可得到熒光光譜，但系統(tǒng)功率高且體積也較大。后來(lái)有研究人員研制出小型熒光檢測(cè)模塊，采用LED光源和光電二極管PD（photodiode）實(shí)現(xiàn)［22-25］，同樣具有較高的檢測(cè)靈敏度。特別是中科院大連化物所研制的高靈敏度小型熒光模塊［14］，結(jié)構(gòu)緊湊，精度高。這里我們采用類(lèi)似的光路結(jié)構(gòu)，集成小型熒光模塊，減小系統(tǒng)體積，光路結(jié)構(gòu)如圖3（b）所示。為保證激發(fā)光信號(hào)不會(huì)影響熒光信號(hào)，分別采用激發(fā)濾光片和發(fā)射濾光片來(lái)實(shí)現(xiàn)。光源經(jīng)激發(fā)濾光片得到窄波段的激發(fā)光源，經(jīng)二向色鏡反射到微孔板樣品，激發(fā)熒光后，熒光經(jīng)二向色鏡和發(fā)射濾光片到達(dá)探測(cè)器上，即可檢測(cè)熒光強(qiáng)度。光源采用300 mW的藍(lán)光LED，濾光片選擇480 nm和520 nm范圍的窄帶濾光片，探測(cè)器選用LSSPD-1.2。光路末端連接一個(gè)5 mm孔徑的光纖準(zhǔn)直鏡，避免光線發(fā)散造成較大的孔間干擾。同時(shí)，小型熒光模塊安裝在一維移動(dòng)機(jī)構(gòu)上，與微孔板的一維運(yùn)動(dòng)機(jī)構(gòu)組合實(shí)現(xiàn)二維空間掃描檢測(cè)。此外，鏡頭相對(duì)被測(cè)物的距離對(duì)檢測(cè)光強(qiáng)也有較大影響，結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)時(shí)增加距離可調(diào)部件用于實(shí)驗(yàn)時(shí)調(diào)節(jié)測(cè)試。熒光檢測(cè)部分的實(shí)物圖如圖3（c）所示，熒光光路封裝集成在一小盒子里，由于微孔板里的裝載樣品可能會(huì)有不同容量，所需的聚焦位置會(huì)不同，這里在底部增加一個(gè)準(zhǔn)直鏡使光線平行。后續(xù)也可考慮自動(dòng)聚焦系統(tǒng)，根據(jù)樣品溶液的高度調(diào)節(jié)聚焦位置。

圖3 熒光檢測(cè)原理Fig. 3 Principle of fluorescence detection

2.2 控制系統(tǒng)

控制系統(tǒng)基于ARM Cortex-M4內(nèi)核的主控器STM32F407芯片，包括電源轉(zhuǎn)換模塊、步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)模塊、數(shù)據(jù)采集模塊、串口通信等（圖4）。

圖4 控制系統(tǒng)主要功能Fig. 4 Functions of control module

2.2.1 電機(jī)驅(qū)動(dòng)控制模塊

系統(tǒng)共有4個(gè)電機(jī)，包括送板位置二維運(yùn)動(dòng)的兩個(gè)電機(jī)、濾光片輪控制電機(jī)以及自動(dòng)開(kāi)蓋的控制電機(jī)。這里均采用兩相步進(jìn)電機(jī)來(lái)實(shí)現(xiàn)，使用微控制器結(jié)合步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)芯片來(lái)驅(qū)動(dòng)電機(jī)。每個(gè)電機(jī)4個(gè)端子A+A-B+B-對(duì)應(yīng)控制端的4個(gè)端口，通過(guò)微控制器端口的電平高低控制電流的導(dǎo)通，通過(guò)導(dǎo)通順序控制轉(zhuǎn)動(dòng)方向。定時(shí)器的時(shí)鐘頻率控制速度，脈沖數(shù)控制運(yùn)行位置，細(xì)分部分可以提高位置控制精度。

每個(gè)電機(jī)均配有光電限位開(kāi)關(guān)，通過(guò)光電開(kāi)關(guān)判斷電機(jī)是否到達(dá)零點(diǎn)及限定位置。當(dāng)發(fā)生限位時(shí)產(chǎn)生外部中斷傳入微控制器，根據(jù)中斷信號(hào)進(jìn)行停止等操作。

2.2.2 數(shù)據(jù)采集模塊

光學(xué)信號(hào)的采集需要I/V轉(zhuǎn)換電路、前置放大、增益放大、信號(hào)調(diào)理、AD轉(zhuǎn)換電路等，還需與數(shù)字電路、功率電路進(jìn)行電氣隔離。吸光度檢測(cè)的是相對(duì)初始光強(qiáng)的比值，因此信號(hào)放大部分要求不是很高。熒光檢測(cè)的是發(fā)射熒光的強(qiáng)度，熒光信號(hào)通常較弱，要得到高的檢測(cè)靈敏度需要更大的放大倍數(shù)。STM芯片內(nèi)部有AD轉(zhuǎn)換功能，為了提高檢測(cè)精度，增加外置AD轉(zhuǎn)換模塊，特別是熒光溶液的檢測(cè)精度需要微伏級(jí)別，這里采用24位的高精度采集卡。

2.2.3 通信模塊

通信模塊負(fù)責(zé)發(fā)送接收指令和數(shù)據(jù)，這里采用串口總線接口設(shè)計(jì)，利用MAX3232電平轉(zhuǎn)換芯片實(shí)現(xiàn)單片機(jī)與上位機(jī)進(jìn)行通信。波特率采用19 200 bit/s，包含1個(gè)起始位、8個(gè)數(shù)據(jù)位、無(wú)校驗(yàn)位、1個(gè)停止位。指令主要分為三大類(lèi)：送板位置控制，吸光度檢測(cè)，熒光檢測(cè)。根據(jù)串口功能，可自定義串口指令格式（串口指令功能見(jiàn)表1），如：這里以十六進(jìn)制FA字符作為幀頭，功能碼自定義，ODOA字符結(jié)束。根據(jù)定義的指令格式，可與上位機(jī)PC端進(jìn)行通信控制，也可與自動(dòng)化鑄造平臺(tái)集成控制軟件進(jìn)行通信。

表1 串口指令功能表Table 1 Serial port instructions

2.3 軟件設(shè)計(jì)

2.3.1 下位機(jī)程序

下位機(jī)的控制程序在Keil uVision環(huán)境下編寫(xiě)，主要實(shí)現(xiàn)對(duì)電機(jī)驅(qū)動(dòng)控制、數(shù)據(jù)傳輸、串口通信等，涉及系統(tǒng)時(shí)針設(shè)置、定時(shí)器TIM設(shè)置及中斷函數(shù)、I/O配置、外部中斷函數(shù)、AD通道配置及DMA數(shù)據(jù)傳輸設(shè)置、串口指令功能等。

以電機(jī)驅(qū)動(dòng)控制為例，電機(jī)控制主要包括速度、位置、方向，這里我們通過(guò)在嵌入式程序里的定時(shí)器TIM時(shí)鐘頻率控制電機(jī)運(yùn)行速度，通過(guò)寫(xiě)入的脈沖數(shù)控制電機(jī)運(yùn)動(dòng)的位置，通過(guò)改變電機(jī)電磁繞組端子A/B/C/D的導(dǎo)通順序控制電機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)方向。驅(qū)動(dòng)控制的流程及主要函數(shù)如圖5所示。

圖5 電機(jī)的驅(qū)動(dòng)控制程序Fig. 5 Control program for stepping motor

2.3.2 上位機(jī)程序設(shè)計(jì)

上位機(jī)程序采用QT開(kāi)發(fā)，包括參數(shù)設(shè)置、吸光度和熒光檢測(cè)功能、數(shù)據(jù)處理分析、系統(tǒng)校準(zhǔn)，軟件主要功能如圖6。

圖6 軟件功能圖Fig. 6 Software function diagram

具體的操作界面如圖7。圖7（a）是軟件主界面，可以進(jìn)行參數(shù)設(shè)置、檢測(cè)控制。另外，還可在操作界面進(jìn)行以下操作：

圖7 軟件界面Fig. 7 User interface of software

（1）顯示/隱藏調(diào)試信息

點(diǎn)擊按鈕顯示/隱藏調(diào)試信息交替顯示。顯示調(diào)試信息，便于查看串口的傳輸數(shù)據(jù)。

（2）檢測(cè)數(shù)據(jù)的保存和顯示

檢測(cè)完成后數(shù)據(jù)自動(dòng)保存并顯示在界面的表格里。數(shù)據(jù)保存采用兩種方式：一種是CSV文件，方便用Excel隨時(shí)查看，文件名以當(dāng)前時(shí)間命名；另一種是數(shù)據(jù)庫(kù)文件，可以進(jìn)行查詢、修改等操作，數(shù)據(jù)庫(kù)這里選用SQLite小型數(shù)據(jù)庫(kù)，無(wú)需額外的安裝與配置。

（3）校準(zhǔn)菜單

校準(zhǔn)包括位置校準(zhǔn)、檢測(cè)值的校準(zhǔn)。圖7（b）顯示了位置校準(zhǔn)界面，位置校準(zhǔn)主要是送板位置的偏差校準(zhǔn)和濾光輪不同波長(zhǎng)位置的校準(zhǔn)，若存在位置誤差可根據(jù)偏差值補(bǔ)償在實(shí)際的運(yùn)動(dòng)中。檢測(cè)值校準(zhǔn)針對(duì)一些系統(tǒng)固定誤差進(jìn)行補(bǔ)償，不同波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)的檢測(cè)值誤差可能不同，具體的校準(zhǔn)方法將根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。

（4）質(zhì)控圖

對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算均值M和均方差S，確定圖形中心線、上下控制限、上下輔助線等。如圖7（c），根據(jù)檢測(cè)值的變化分布可以查看檢測(cè)值的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性等。按照統(tǒng)計(jì)學(xué)規(guī)律，檢測(cè)數(shù)值一般要遵循一些規(guī)律，如：95%的結(jié)果應(yīng)落在M±2S范圍內(nèi)；均值兩側(cè)的數(shù)據(jù)分布幾乎相同，不能有連續(xù)多次結(jié)果在均值的同一側(cè)，或連續(xù)多次數(shù)值漸升或漸降。如果準(zhǔn)確性變化，數(shù)值會(huì)出現(xiàn)向上或向下的總體趨勢(shì)性變化；如果精密度變化，會(huì)出現(xiàn)數(shù)值差異性增大的現(xiàn)象。

2.3.3 自動(dòng)化鑄造平臺(tái)的連接通信

微孔板檢測(cè)儀作為合成生物實(shí)驗(yàn)中常用的一種檢測(cè)儀器，需要集成在合成生物自動(dòng)化鑄造平臺(tái)中，并與集成控制軟件通信控制。該系統(tǒng)可以通過(guò)兩種方式通信：一種是通過(guò)串口進(jìn)行物理連接，直接使用表1中的串口指令進(jìn)行通信，這種方式不需要運(yùn)行微孔板檢測(cè)的上位機(jī)程序，但需要串口線連接，使用范圍有限制：另一種是通過(guò)TCP/IP協(xié)議進(jìn)行通信，可以遠(yuǎn)程控制，TCP（transmission control protocol）傳輸控制協(xié)議是一個(gè)用于數(shù)據(jù)傳輸?shù)膫鬏攲泳W(wǎng)絡(luò)協(xié)議，一般分為客戶端和服務(wù)端，即C/S（client/server）模型。這里微孔板檢測(cè)系統(tǒng)作為服務(wù)端，集成控制平臺(tái)作為客戶端，通過(guò)QT的QTcpSocket來(lái)讀取和寫(xiě)入數(shù)據(jù)。程序運(yùn)行時(shí)，客戶端需已知服務(wù)端的IP地址和端口號(hào)，先打開(kāi)服務(wù)端程序，服務(wù)端監(jiān)聽(tīng)客戶端發(fā)來(lái)的連接請(qǐng)求，等連接后可以讀取客戶端發(fā)來(lái)的數(shù)據(jù)報(bào)，也可發(fā)送數(shù)據(jù)報(bào)。表2是自定義的TCP通信指令，客戶端連接后可通過(guò)該指令進(jìn)行遠(yuǎn)程控制。圖8是編寫(xiě)的服務(wù)端和客戶端測(cè)試程序，圖8（a）是微孔板檢測(cè)儀程序上對(duì)應(yīng)的服務(wù)端，圖8（c）對(duì)應(yīng)自動(dòng)化平臺(tái)上的客戶端程序，經(jīng)測(cè)試兩部分程序可以進(jìn)行遠(yuǎn)程連接通信。

表2 TCP通信指令Table 2 Instructions of TCP communication

圖8 TCP通信測(cè)試Fig.8 TCP communication test program

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析

圖9（a）是樣機(jī)的外部實(shí)物圖，圖9（b）是打開(kāi)上面蓋子后的內(nèi)部結(jié)構(gòu)圖。吸光度檢測(cè)時(shí)，96孔板的一排8孔同時(shí)檢測(cè)，送板機(jī)構(gòu)只需要一維來(lái)回運(yùn)動(dòng)。熒光檢測(cè)是單點(diǎn)檢測(cè)，需要增加另一軸的掃描運(yùn)動(dòng)。為了減小儀器尺寸，設(shè)計(jì)熒光檢測(cè)模塊在另一方向來(lái)回運(yùn)動(dòng)，結(jié)合送板機(jī)構(gòu)的一維運(yùn)動(dòng)實(shí)現(xiàn)二維掃描。開(kāi)蓋部分設(shè)計(jì)為向上的推拉方式，方便機(jī)械臂從側(cè)面進(jìn)行微孔板的拿取和放下。

圖9 研制樣機(jī)Fig. 9 Prototype built

3.1 吸光度檢測(cè)

根據(jù)計(jì)量檢定規(guī)程JJG 861—2007的規(guī)定要求，采用中性密度濾光片對(duì)微孔板吸光度性能進(jìn)行重復(fù)性檢測(cè)［26-28］。實(shí)驗(yàn)中采用大恒光電的GCC系列中性濾光片。

由于環(huán)境、暗電流等影響，在沒(méi)有光照的情況下，探測(cè)器的檢測(cè)值通常不為0，故吸光度的計(jì)算［式（1）］表示為：

式中，Imin是沒(méi)有光照的情況下的檢測(cè)值；Imax是沒(méi)有檢測(cè)物的情況下測(cè)的光源強(qiáng)度。光源的穩(wěn)定性隨著時(shí)間可能會(huì)有變化，可以每次測(cè)量時(shí)先測(cè)量光源強(qiáng)度再進(jìn)行檢測(cè)，也可以事先測(cè)量光源強(qiáng)度保存相關(guān)值，定期對(duì)光源值進(jìn)行校準(zhǔn)。經(jīng)檢測(cè)，不同波長(zhǎng)光源的光強(qiáng)值差異較大，每個(gè)波段需要單獨(dú)保存用于計(jì)算。為了提高檢測(cè)速度，這里選用保存光源測(cè)量值、定期校準(zhǔn)光源的方式，吸光度整板檢測(cè)一次測(cè)量時(shí)間小于10 s。

3.1.1 重復(fù)性及準(zhǔn)確性測(cè)試

選擇不同波長(zhǎng)的光源，將標(biāo)稱(chēng)值OD=1.0的中性濾光片放在96孔架上，如圖10所示，在濾光片所在的中心孔位重復(fù)測(cè)量10次，計(jì)算多次測(cè)量OD值的平均值A(chǔ)VE和標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（表3）。

表3 不同波長(zhǎng)吸光度測(cè)量值Table 3 OD values at different wavelength

圖10 檢測(cè)中性密度濾光片的OD值Fig. 10 Neutral filter used for OD test

從上表可以看到，4個(gè)波長(zhǎng)的測(cè)量值標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于0.3%。測(cè)量準(zhǔn)確性方面，不同波長(zhǎng)的光源強(qiáng)度有些差異，測(cè)量誤差也有些不同，405 nm的示值誤差稍大，平均值與標(biāo)稱(chēng)值的差異為0.035，其他幾個(gè)波長(zhǎng)分別為0.008、0.006、-0.004。由于測(cè)量值的重復(fù)性較好，考慮補(bǔ)償方式校正示值誤差。測(cè)量誤差隨波長(zhǎng)不同有些變化，需對(duì)不同波長(zhǎng)測(cè)量結(jié)果分別校正。

除了同一孔位的重復(fù)性，不同孔位之間的差異也需要考慮。這里選取同一波長(zhǎng)同一濾光片，隨機(jī)移動(dòng)濾光片在96孔板上的位置，測(cè)量幾個(gè)不同孔位的重復(fù)性，不同孔位用微孔板兩個(gè)方向的序號(hào)代表，測(cè)量結(jié)果如表4，測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)偏差同樣小于0.3%。后續(xù)還需進(jìn)一步增加測(cè)量孔位，并在測(cè)量值的校準(zhǔn)中綜合考慮不同孔位的誤差。

表4 不同孔位吸光度測(cè)量值Table 4 OD values at different position

3.1.2 線性度測(cè)試

為更準(zhǔn)確地測(cè)量線性度，在中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院購(gòu)買(mǎi)橙黃G吸光度標(biāo)準(zhǔn)溶液［生化分析儀線性誤差校準(zhǔn)用溶液GBW（E）130767-130774］進(jìn)行線性度測(cè)試。不同濃度的溶液分別取100 μL加入透明微孔板的不同孔位，光源采用492 nm波段，吸光度測(cè)量值的平均值A(chǔ)VE及標(biāo)準(zhǔn)差RSD如表5。線性擬合曲線如圖11所示，擬合方程y=0.2739x+0.0434，擬合系數(shù)R2=0.9963。由于測(cè)量條件不一樣，使用的波長(zhǎng)及檢測(cè)工具不同，測(cè)量值與標(biāo)準(zhǔn)值數(shù)值差異較大，但擬合系數(shù)接近1，線性度較好。

表5 不同標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度測(cè)量值Table 5 OD values for different standard solutions

圖11 不同濃度溶液吸光度測(cè)量值的線性擬合Fig. 11 Linear fitting of different solutions OD test

3.2 熒光檢測(cè)

熒光素鈉安全無(wú)毒，這里我們采用熒光素鈉粉末（分子量376.27）配制熒光素溶液（圖12）測(cè)試熒光檢測(cè)精度，10 mmol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液作為稀釋溶液。主要的儀器工具包括高精度電子秤、移液槍、容量瓶、燒杯、滴定管等。為降低背景干擾，熒光檢測(cè)選用黑色的96孔板。

圖12 配制熒光素鈉溶液Fig. 12 Fluorescein solution

①配制0.5 mmol/L熒光素鈉溶液：用電子秤量取0.301 g熒光素鈉，與1600 mL的NaOH溶液融合。選擇該溶液作為母液，用NaOH溶液稀釋可得到所需濃度的溶液。

②配制pmol/L的熒光素鈉梯度溶液：首先將10 μL的0.5 mmol/L的熒光素鈉溶液與4990 μL的NaOH溶液混合得到1 μmol/L的溶液；再將10 μL 1 μmol/L的溶液與10 mL NaOH溶液稀釋得到1 nmol/L的溶液，此后再對(duì)半稀釋得到500 pmol/L、250 pmol/L、125 pmol/L、 62.5 pmol/L、 31.25 pmol/L、15.625 pmol/L、7.8125 pmol/L、3.9063 pmol/L的溶液。

③用移液槍量取100 μL的不同濃度的溶液分別滴入96孔板，連續(xù)測(cè)量5次計(jì)算平均值A(chǔ)VE和標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，測(cè)量結(jié)果如表6。根據(jù)測(cè)量的平均值進(jìn)行線性擬合，這里將稀釋所用的NaOH溶液作為對(duì)照樣本，其他濃度的溶液減去對(duì)照樣本的數(shù)值后再進(jìn)行擬合，如圖13，擬合系數(shù)R2=0.9967。當(dāng)濃度稀釋至3.9063 pmol/L時(shí)，檢測(cè)值與稀釋溶液NaOH的值接近，基本到達(dá)檢測(cè)限。

表6 熒光素鈉溶液檢測(cè)值Table 6 Detected values of fluorescein sodium

圖13 熒光檢測(cè)值線性擬合Fig. 13 Linear fitting of fluorescence detection

此外，為比較不同孔位的檢測(cè)重復(fù)性，用移液槍選取100 μL的相同濃度溶液分別加入96孔板的不同孔位。檢測(cè)結(jié)果如表7，可以看到檢測(cè)值的標(biāo)準(zhǔn)差相對(duì)表6明顯增加，機(jī)構(gòu)移動(dòng)時(shí)的定位誤差會(huì)影響光照位置，不同孔位的加樣過(guò)程也可能會(huì)引入部分誤差，均會(huì)影響檢測(cè)值。后續(xù)還需提高位置控制精度，另外，不同的檢測(cè)距離、溶液加樣量［29］等對(duì)測(cè)量結(jié)果都會(huì)有影響，還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證選取最佳參數(shù)。

表7 不同孔位的熒光檢測(cè)值Table 7 Fluorescence values at different position

3.3 自動(dòng)化鑄造平臺(tái)的控制測(cè)試

實(shí)驗(yàn)中采用自動(dòng)化鑄造平臺(tái)的集成控制軟件控制機(jī)械臂與微孔板檢測(cè)系統(tǒng)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)微孔板檢測(cè)系統(tǒng)的控制。首先，集成控制軟件根據(jù)IP地址和端口號(hào)連接設(shè)備；然后，機(jī)械臂運(yùn)動(dòng)到微孔板檢測(cè)儀所在的位置，如圖14（a）；接著，機(jī)械臂將96孔板送到檢測(cè)系統(tǒng)，如圖14（b）；最后，發(fā)送命令進(jìn)行操作并顯示當(dāng)前狀態(tài)。圖14（c）顯示集成控制軟件發(fā)送#Abs001#進(jìn)行吸光度檢測(cè)，目前狀態(tài)是吸光度檢測(cè)完成。

圖14 自動(dòng)化平臺(tái)遠(yuǎn)程控制Fig. 14 Remote controlled by automated integration platform

3.4 分析比較

本系統(tǒng)研制一種經(jīng)濟(jì)、緊湊型多功能微孔板檢測(cè)儀，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與部分國(guó)內(nèi)外儀器進(jìn)行性能比較。國(guó)外的多功能微孔板檢測(cè)儀種類(lèi)較多，功能也從單功能、雙功能到多功能。這里僅列舉兩種：SectralMax Mini作為一種經(jīng)濟(jì)型的多功能酶標(biāo)儀，主要用于檢測(cè)光吸收、熒光；BioTek Synergy H1多功能檢測(cè)儀，采用光柵和濾光片的獨(dú)特組合光路，可以檢測(cè)光吸收、熒光強(qiáng)度、熒光偏振、時(shí)間分辨率熒光、生物發(fā)光、熒光共振BRET等，功能強(qiáng)大。國(guó)內(nèi)的酶標(biāo)儀基本都只包含吸光度檢測(cè)，選取博科公司最新的BK-EL10D型號(hào)進(jìn)行對(duì)比。光吸收和熒光檢測(cè)性能比較如表8，可以看到國(guó)內(nèi)酶標(biāo)儀在吸光度檢測(cè)方面已經(jīng)接近國(guó)外水平，但功能相對(duì)單一，沒(méi)有集成熒光、發(fā)光檢測(cè)等功能。本系統(tǒng)研發(fā)的微孔板檢測(cè)儀，是一種緊湊、經(jīng)濟(jì)型檢測(cè)儀器，吸光度檢測(cè)精度在0～2.0范圍內(nèi)較好，熒光檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到pmol/L級(jí)別，與國(guó)外的經(jīng)濟(jì)型儀器指標(biāo)已比較接近，但在檢測(cè)范圍方面還有待提高。在自動(dòng)化兼容方面，僅BioTek Synergy系列提到可以與第三方兼容，其他型號(hào)無(wú)相關(guān)介紹；本系統(tǒng)研發(fā)設(shè)備的接口開(kāi)放，已實(shí)驗(yàn)測(cè)試可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化平臺(tái)的遠(yuǎn)程控制。因此，該系統(tǒng)研發(fā)儀器可以替代國(guó)外的經(jīng)濟(jì)型多功能酶標(biāo)儀用于合成生物自動(dòng)化平臺(tái)。

表8 微孔板檢測(cè)儀性能比較Table 8 Performance comparison of microplate readers

4 結(jié) 論

本課題組研制了一套經(jīng)濟(jì)、緊湊型的多功能微孔板檢測(cè)系統(tǒng)，包含吸光度檢測(cè)和熒光檢測(cè)功能，自主設(shè)計(jì)了控制系統(tǒng)和數(shù)據(jù)采集處理軟件，可以通過(guò)串口和TCP方式與自動(dòng)化平臺(tái)的集成控制系統(tǒng)進(jìn)行通信。實(shí)驗(yàn)測(cè)試驗(yàn)證了系統(tǒng)的可行性及檢測(cè)的準(zhǔn)確性。系統(tǒng)的主要優(yōu)點(diǎn)有：

①模塊化設(shè)計(jì)，吸光度模塊和熒光模塊均可獨(dú)立控制和運(yùn)行。吸光度同時(shí)檢測(cè)多路透射光，一維掃描實(shí)現(xiàn)96孔板的檢測(cè)，整板檢測(cè)只需10 s；熒光檢測(cè)激發(fā)光，單點(diǎn)高精度檢測(cè)，二維掃描實(shí)現(xiàn)整板檢測(cè)。

②系統(tǒng)結(jié)構(gòu)緊湊。熒光檢測(cè)時(shí)，通過(guò)微孔板的一維運(yùn)動(dòng)結(jié)合小型熒光檢測(cè)模塊的一維運(yùn)動(dòng)實(shí)現(xiàn)二維掃描，掃描機(jī)構(gòu)緊湊；另外，電機(jī)控制采用嵌入式微控制器和電機(jī)驅(qū)動(dòng)芯片，不需要外接驅(qū)動(dòng)器，節(jié)約成本及空間。

③多種接口通信方式，可串口連接調(diào)試控制，也可遠(yuǎn)程操作檢測(cè)。

該微孔板檢測(cè)系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)吸光度和熒光的檢測(cè)，功能基本實(shí)現(xiàn)，但目前還有待改進(jìn)的地方，也是后續(xù)工作的重點(diǎn)：

①完善軟件的數(shù)據(jù)處理和分析。目前只包含了基本的質(zhì)控分析，還需增加測(cè)量數(shù)據(jù)的曲線顯示、回歸計(jì)算、具體生化數(shù)據(jù)分析等。

②進(jìn)一步提高檢測(cè)精度。吸光度檢測(cè)中，當(dāng)透射率較小時(shí)測(cè)量誤差會(huì)有所增加，正在改進(jìn)數(shù)據(jù)采集模塊，提高數(shù)據(jù)的采集精度并提高吸光度的測(cè)量范圍。熒光檢測(cè)中，將進(jìn)一步進(jìn)行影響因素分析，如溶液量、檢測(cè)距離、放大倍數(shù)等，實(shí)驗(yàn)選取最佳參數(shù)。此外，機(jī)械運(yùn)動(dòng)誤差會(huì)增加不同孔位之間的檢測(cè)誤差，還要進(jìn)一步提高定位精度，減小整體系統(tǒng)誤差。

③便攜性設(shè)計(jì)。小型化、便攜性是檢測(cè)儀器發(fā)展的趨勢(shì)，本系統(tǒng)結(jié)構(gòu)緊湊但還有提升空間。如：a.減小儀器體積，開(kāi)蓋機(jī)構(gòu)目前采用向上推拉設(shè)計(jì)，增加了儀器高度和重量，后續(xù)考慮改進(jìn)孔板的進(jìn)樣機(jī)構(gòu)，讓孔板自動(dòng)向外伸縮，減小體積；b.輕量化設(shè)計(jì)，目前樣機(jī)外殼稍重，后續(xù)擬采用輕質(zhì)材料減小重量，并進(jìn)一步優(yōu)化結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，使其更便攜美觀。