黃惠敏，胡海圣，蔡傳旭，鄭佩燕，方艷婷，孫寶清

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，國(guó)家呼吸醫(yī)學(xué)中心，國(guó)家呼吸系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，廣州呼吸健康研究院，呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510120；2.深圳人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，深圳 518020）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種以氣流受限為特點(diǎn)的常見呼吸系統(tǒng)疾?。?-2］，其特點(diǎn)是持續(xù)的氣道阻塞性和氣道炎癥。COPD患者機(jī)體存在氧化/抗氧化系統(tǒng)失衡以及氣道非特異炎癥反應(yīng)加重。COPD 的反復(fù)急性加重導(dǎo)致患者肺功能和生活質(zhì)量下降、甚至死亡，給家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。

COPD的患病率在5%以上［3-4］，死亡率在美國(guó)排名第3位，每年造成120，000多人死亡［5］。隨著我國(guó)人口老齡化的不斷加劇，COPD 在我國(guó)的發(fā)病趨勢(shì)上升，成為目前主要的慢性呼吸系統(tǒng)疾病之一，多數(shù)患者伴有不同程度的肺功能損傷，甚至呼吸衰竭［6］。中國(guó)成人肺部健康研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)COPD 患者已經(jīng)高達(dá)1 億人，40 歲以上人群患病率13.7%，短短十余年間（2002-2015）患病率激增67%［7］。同時(shí)，COPD 病程長(zhǎng)，患者頻繁就診、常因急性加重而住院，并需要長(zhǎng)期治療（如輔助供氧治療、藥物治療），因此使用了大量醫(yī)療資源。研究顯示，中重度COPD 患者的免疫功能低下是導(dǎo)致其急性發(fā)作的重要原因，提高患者免疫功能可以控制患者病情的發(fā)展，減少急性發(fā)作的次數(shù)和減輕發(fā)作時(shí)的癥狀。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為冬蟲夏草為補(bǔ)益藥，可補(bǔ)肺氣以助其宣降，助腎陽(yáng)以漁腎納氣，滋肺腎之陰以降上炎虛火。百令膠囊是發(fā)酵蟲草菌粉，研究顯示百令膠囊有抗炎、抗氧化及雙向免疫調(diào)節(jié)作用，具有補(bǔ)肺益腎、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、止咳化痰和舒張肺支氣管平滑肌的作用，逐漸應(yīng)用于臨床治療慢性呼吸系統(tǒng)疾?。?-10］。

評(píng)估呼吸系統(tǒng)疾病的免疫功能主要集中在兩個(gè)方面：一是炎癥反應(yīng)的程度和特征；二是免疫細(xì)胞的活性和功能狀態(tài)。在COPD 患者中，持續(xù)的肺部炎癥是其顯著特征之一，這種炎癥涉及許多炎癥細(xì)胞、細(xì)胞因子以及炎性介質(zhì)的參與。研究發(fā)現(xiàn)，COPD 與某些MMP 亞型的活性異常存在關(guān)聯(lián)［11-12］，這些異常可能與氣道重塑和肺實(shí)質(zhì)破壞有關(guān)。此外，SAA 是一種急相蛋白，其水平在COPD 急性加重期常常升高，可作為炎癥活動(dòng)的指標(biāo)之一。SPD 是肺表面活性物質(zhì)的重要組成部分，它們?cè)诜蔚木植糠烙兔庖哒{(diào)節(jié)中起到關(guān)鍵作用。SPD不僅能增強(qiáng)固有免疫細(xì)胞對(duì)病原體的清除能力，還能調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生和炎癥反應(yīng)的程度。這些特性使得SPD成為評(píng)估肺部免疫功能的重要指標(biāo)［13］。此外，NE、PRG4 和LTB4 作為COPD 的生物標(biāo)記物均有研究報(bào)道［14-16］。在COPD 患者疾病進(jìn)展過(guò)程中，多種細(xì)胞因子的水平發(fā)生改變。IL-4、IL-6、IL-8、IL-1β 和GM-CSF的變化與COPD 的炎癥過(guò)程、氣道損傷和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，這些細(xì)胞因子可以吸引和激活炎癥細(xì)胞，加劇炎癥反應(yīng)［17-19］。

目前我國(guó)關(guān)于百令膠囊長(zhǎng)期治療COPD 患者的免疫功能改變的研究較少。本研究旨在觀察長(zhǎng)期應(yīng)用百令膠囊治療穩(wěn)定期的中重度COPD 患者，評(píng)價(jià)百令膠囊對(duì)COPD 患者的免疫功能改善情況，監(jiān)測(cè)免疫學(xué)指標(biāo)水平的變化，從而評(píng)估百令膠囊對(duì)COPD患者的免疫功能改善情況。

1 資料與方法

1.1 倫理批準(zhǔn)

本研究經(jīng)廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，批準(zhǔn)文號(hào)：GYFYY-2016-20。

1.2 研究對(duì)象

本研究為雙盲平行對(duì)照試驗(yàn)，隨機(jī)入組120 例COPD 穩(wěn)定期中重度患者，并分為60 例試驗(yàn)組，60例對(duì)照組。對(duì)照組和試驗(yàn)組因患者未按規(guī)定時(shí)間復(fù)診各脫落17 例和14 例，最終對(duì)照組完成研究43例，試驗(yàn)組完成研究46例，合計(jì)89例。

1.3 試驗(yàn)時(shí)間與研究終點(diǎn)

項(xiàng)目試驗(yàn)流程包括：篩選期1 周，治療期1 年（52 周），安全性隨訪4 周?；颊呓邮軡M52 周的分組干預(yù)后完成試驗(yàn)流程。

1.4 入選標(biāo)準(zhǔn)

（1）年齡：40～80歲，男、女不限。

（2）GOLD III-VI 級(jí)COPD：吸入沙丁胺醇400 μg后20分鐘測(cè)定，F(xiàn)EV1/FVC<70%且FEV1值≤50%預(yù)計(jì)值。COPD的診斷基于GOLD指南［20］。

（3）病人處于穩(wěn)定期，即近4周內(nèi)無(wú)COPD 急性加重。

（4）能夠進(jìn)行語(yǔ)言或文字交流，同意參加本研究并簽署知情同意書，有能力完成試驗(yàn)相關(guān)的檢查。

1.5 排除標(biāo)準(zhǔn)

（1）除COPD外的重大疾病。

（2）實(shí)驗(yàn)室檢查值顯著異常。

（3）臨床診斷肺癌、支氣管擴(kuò)張癥、塵肺或其它單純的限制性通氣功能障礙。

（4）有哮喘史、過(guò)敏性鼻炎史、或4 周內(nèi)血嗜酸粒細(xì)胞計(jì)數(shù)≥600/mm3（0.6×109/L）的患者。

（5）現(xiàn)患有活動(dòng)性肺結(jié)核。

（6）有危及生命的肺栓塞、或α1-抗胰蛋白酶缺乏、或囊性纖維化的病人。

（7）曾進(jìn)行肺切除術(shù)的患者。

（8）妊娠、哺乳或有懷孕可能的婦女。

1.6 分組干預(yù)

試驗(yàn)組：常規(guī)COPD 藥物治療，口服百令膠囊，每日三次，每次6 粒；連續(xù)使用52 周。百令膠囊：每粒裝0.5克，由杭州中美華東制藥有限公司生產(chǎn)。

對(duì)照組：常規(guī)COPD 藥物治療，口服百令膠囊模擬劑，每日三次，每次6 粒；連續(xù)使用52周。模擬劑外觀、氣味與百令膠囊一樣，由杭州中美華東制藥有限公司生產(chǎn)及提供。

為保證隨機(jī)雙盲法實(shí)施，對(duì)試驗(yàn)用藥進(jìn)行包裝，并由專人核對(duì)，包裝過(guò)程有記錄。并使用統(tǒng)一標(biāo)簽，外觀一致。

1.7 合并用藥與治療

COPD 急性加重，可以統(tǒng)一按照GOLD 指南用藥治療，一般不超過(guò)2 周。

1.8 樣本采集及分離

在治療前（V1）和52 周停藥時(shí)（V6）用紫頭管（內(nèi)含EDTA 抗凝劑）采集患者靜脈血2 ml，室溫放置至血漿析出后1000×g離心10 分鐘后，取上層血漿，放-20 ℃保存，以備檢測(cè)。

1.9 血液免疫學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

用 ELISA 方 法（DRG Instruments GmbH，Germany）檢測(cè)血漿中基質(zhì)金屬蛋白酶8（MMP8）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）、表面活性物質(zhì)蛋白-D（SPD）、去甲腎上腺素（NE）、白三烯B4（LTB4）、血清淀粉樣蛋白A（SAA）和蛋白聚糖4（PRG4）的水平。并用Meso Scale Discovery（MSD）電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)下列細(xì)胞因子：粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）、白介素1β（IL-1β）、白介素4（IL-4）、白介素6（IL-6）和白介素8（IL-8）。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。正態(tài)分布數(shù)據(jù)以進(jìn)行描述，非參數(shù)定量數(shù)據(jù)以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）來(lái)進(jìn)行描述，兩組間非配對(duì)計(jì)量資料差異采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，配對(duì)計(jì)量資料差異采用Wilcoxon檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者的基本情況

入組的患者中，男性85 例，女性4 例，年齡38～79歲，平均年齡（63.1±7.6）歲。對(duì)照組中男性41例，女性2 例，年齡41～79 歲，平均年齡（64.7±7.2）歲；試驗(yàn)組中男性44 例，女性2 例，年齡38～77 歲，平均年齡（61.6±7.7）歲。試驗(yàn)組與對(duì)照組在年齡和性別分布上沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。

2.2 治療前后兩組患者M(jìn)MP8、MMP9、SPD、NE、LTB4、PRG4和SAA水平的比較

治療前，試驗(yàn)組與對(duì)照組間MMP8、MMP9、SPD、NE、LTB4和SAA 水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），但對(duì)照組的PRG4 水平高于試驗(yàn)組［58.9（38.4，69.6）vs 46.6（28.3，58.0），Z=-2.123，P=0.034］；治療后，試驗(yàn)組與對(duì)照組間MMP8、MMP9、NE、LTB4、PRG4 和SAA 水平均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），但試驗(yàn)組SPD 水平高于對(duì)照組［7.9（5.6，18.1）vs 5.0（3.1，14.0），Z=-2.356，P=0.018］、如圖1所示。

圖1 治療前后試驗(yàn)組和對(duì)照組COPD患者各項(xiàng)生物標(biāo)記物水平比較

與治療前相比，試驗(yàn)組的MMP8［717.5（433.6，1366.1）ng/ml vs 384.2（198.3，717.5）ng/ml］和SAA［90.1（56.7，132.4）ng/ml vs 45.1（38.6，57.1）ng/ml］水平均有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-3.428，P<0.05；Z=17.305，P<0.05），但在對(duì)照組中，MMP8 和SAA 在治療前后沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。MMP9、SPD、NE、LTB4 和PRG4 在試驗(yàn)組和對(duì)照組中，治療前后水平變化均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），如表1所示。

表1 治療前后試驗(yàn)組和對(duì)照組COPD患者各項(xiàng)生物標(biāo)記物水平變化

2.2 治療前后兩組患者細(xì)胞因子GM-CSF、IL-1β、IL-4、IL-6和IL-8水平的比較

治療前及治療后，試驗(yàn)組與對(duì)照組間GM-CSF、IL-1β、IL-4、IL-6 和IL-8 水平均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），如圖2所示。

圖2 治療前后試驗(yàn)組和對(duì)照組COPD患者各項(xiàng)細(xì)胞因子水平比較

治療后，試驗(yàn)組和對(duì)照組的IL-8 均有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-4.612，P=0.000 和Z=-3.027，P=0.002）；試驗(yàn)組GM-CSF 水平治療后有所上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Z=-2.715，P=0.007），對(duì)照組治療前后的水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。IL-1β、IL-4和IL-6在試驗(yàn)組和對(duì)照組中，治療前后水平變化沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），如表2所示。

表2 治療前后試驗(yàn)組和對(duì)照組COPD患者細(xì)胞因子水平變化

3 討論

COPD 的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今尚未完全闡明，而多種免疫調(diào)節(jié)失衡在COPD 的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。臨床研究發(fā)現(xiàn)，約70%的COPD 患者存在某些反映系統(tǒng)性炎性反應(yīng)標(biāo)記物的異常，約16%的COPD 患者存在持續(xù)性系統(tǒng)性炎性反應(yīng)［21］。根據(jù)《慢性阻塞性肺疾病免疫調(diào)節(jié)治療專家共識(shí)》，中醫(yī)藥復(fù)方及蟲草制劑或可通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、提高免疫細(xì)胞活性改善COPD 穩(wěn)定期患者生活質(zhì)量，減少急性加重［22］。

本研究采用百令膠囊輔助治療穩(wěn)定期COPD 患者基于其抗炎、抗氧化和調(diào)節(jié)免疫的作用。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，COPD 屬肺氣不宣，肺腎陰虛所致上炎虛火，而百令膠囊是發(fā)酵蟲草菌粉，其主要活性成分為D-甘露醇和蟲草酸，具有補(bǔ)肺益腎、滋陰化火、抗炎平喘、增強(qiáng)免疫力的功效。試驗(yàn)組經(jīng)過(guò)百令膠囊輔助治療后，患者的MMP8和SAA水平均下降，但對(duì)照組中，治療前后MMP8 和SAA 水平?jīng)]有差異?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPS）是調(diào)節(jié)細(xì)胞基質(zhì)組成的主要酶類，是一種鋅依賴性內(nèi)肽酶，能夠切割一種或幾種細(xì)胞外基質(zhì)成分以及非基質(zhì)蛋白。MMPS 參與許多與COPD 相關(guān)的過(guò)程，包括生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和趨化因子活性調(diào)節(jié)；炎癥細(xì)胞遷移；細(xì)胞外基質(zhì)更新及組織重塑。MMP8是一種存在于大多數(shù)哺乳動(dòng)物結(jié)締組織中的膠原裂解酶，主要由中性粒細(xì)胞產(chǎn)生，儲(chǔ)存在細(xì)胞內(nèi)顆粒中，活化的MMP8可裂解天然蛋白如纖連蛋白、軟骨蛋白聚糖、絲氨酸蛋白酶抑制蛋白和多肽，與氣道損傷有關(guān)。此外，多項(xiàng)研究顯示，MMP8 與患者特應(yīng)性水平有關(guān)［23-25］，本研究中，試驗(yàn)組治療后的MMP8水平比治療前低，這意味著百令膠囊或能通過(guò)降低COPD 患者M(jìn)MP8 水平，降低COPD 患者特應(yīng)性引起急性發(fā)作的風(fēng)險(xiǎn)，但需要進(jìn)一步研究。SAA 是一種急性相蛋白并與血漿高密度脂蛋白（HDL）結(jié)合，由肝細(xì)胞產(chǎn)生并分泌到血清中，當(dāng)機(jī)體發(fā)生感染或損傷時(shí)，可在4-6小時(shí)內(nèi)迅速升高，是反映氣道炎癥的重要指標(biāo)。本研究中，試驗(yàn)組經(jīng)過(guò)治療后，SAA 的水平有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但對(duì)照組在治療前后沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。MMP8和SAA 的水平變化提示百令膠囊能在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上調(diào)節(jié)COPD 患者免疫生物標(biāo)記物水平，從而減輕COPD患者的氣道炎癥。

SPD 屬于鈣依賴性的膠原凝集素家族成員之一，主要在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞或無(wú)纖毛細(xì)支氣管上皮細(xì)胞內(nèi)合成和分泌［26］。在COPD 患者中，由于炎癥和氣流受限，肺部的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生了變化。由于炎癥和氣流受限導(dǎo)致肺部破壞，影響了SPD 的產(chǎn)生和功能。降低的SPD 水平可能導(dǎo)致肺泡表面張力增加，使肺泡更容易塌陷，增加呼吸困難和肺功能下降的風(fēng)險(xiǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，治療后試驗(yàn)組和對(duì)照組的SPD 均有所下降，雖然試驗(yàn)組和對(duì)照組治療前后水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但在治療后，試驗(yàn)組的SPD水平高于對(duì)照組，說(shuō)明在一定程度上，百令膠囊能減少或減緩SPD 的下降。PRG4（Proteoglycan 4）是一種蛋白質(zhì)聚糖復(fù)合物，也被稱為超大型蛋白質(zhì)4或潤(rùn)滑蛋白。COPD 患者的氣道和肺組織可能出現(xiàn)PRG4 表達(dá)的減少。這種減少可能與氣道黏液清除能力下降、氣道阻塞和炎癥加重有關(guān)。在本研究中，對(duì)照組的PRG4 水平高于試驗(yàn)組（P<0.05）。但治療后，試驗(yàn)組和對(duì)照組間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。試驗(yàn)組和對(duì)照組治療前后的水平變化也沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。PRG4可能是COPD 嚴(yán)重程度的生物標(biāo)記物，與COPD 患者1 年的最大肺活量下降有關(guān)［27］，但關(guān)于COPD 患者的PRG4水平目前了解有限，因?yàn)檠芯窟€在進(jìn)行中，尚未形成一致的結(jié)論。

本研究中，無(wú)論是試驗(yàn)組還是對(duì)照組，治療后患者的IL-8 水平均有所下降，IL-8 屬于與血小板因子4 有相似結(jié)構(gòu)的小細(xì)胞因子家族，由暴露于炎癥刺激（如IL-1 或腫瘤壞死因子）的吞噬細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，并激活中性粒細(xì)胞，誘導(dǎo)趨化、胞吐和呼吸爆發(fā)，是Th1 型免疫中的關(guān)鍵因子。劉笑然［28］等探討百令膠囊對(duì)穩(wěn)定期COPD 患者影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)患病組血清IL 8 的水平較對(duì)照組高，治療后IL-8水平明顯下降，與本文研究結(jié)果一致。促炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-8、TNF-α 等促進(jìn)COPD 氣道炎癥的進(jìn)展，評(píng)估細(xì)胞因子水平變化，可評(píng)估COPD 的病情進(jìn)展、轉(zhuǎn)歸和藥效監(jiān)測(cè)。GM-CSF 是一種由多種細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，包括T 淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞等。GM-CSF 的主要作用是促進(jìn)骨髓干細(xì)胞的分化和成熟，促進(jìn)粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的增生和分化。因此，GM-CSF 對(duì)于身體免疫防御具有重要的作用。但GM-CSF 的異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致過(guò)度的炎癥、疼痛和組織損傷，并促進(jìn)其他炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生［29］。GM-CSF 被認(rèn)為是哮喘和COPD 發(fā)病機(jī)制中的重要介質(zhì)，GM-CSF 在COPD 患者的痰和支氣管黏膜中表達(dá)增加［30］。本研究中，試驗(yàn)組的GMCSF 水平在治療后反而上升，與劉笑然［28］等人的研究結(jié)果相反，有可能是因?yàn)楸狙芯咳脒x的患者均處于穩(wěn)定期，GM-CSF 處于低水平狀態(tài)，還沒(méi)達(dá)到過(guò)度表達(dá)的水平。

綜上所述，百令膠囊輔助治療能改變COPD 患者免疫生物標(biāo)記物水平，在一定程度上減輕COPD患者氣道炎癥。我們需要進(jìn)一步提高對(duì)COPD 免疫發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，發(fā)現(xiàn)新的免疫調(diào)節(jié)治療靶點(diǎn)。