丁亞新，吳鵬，趙雪伶，2*，陳誠(chéng)，2，林東海，2

（1 上海第二工業(yè)大學(xué) 能源與材料學(xué)院，上海 201209；2 上海先進(jìn)熱功能材料工程技術(shù)研究中心，上海 201209）

活性氧（ROS）是細(xì)胞中產(chǎn)生的活性陰離子或中性高度不穩(wěn)定小分子，主要包括過(guò)氧化物、·、·OH、H2O2、單線態(tài)氧（1O2）、烷基過(guò)氧化物（ROO）和一氧化氯（ClO）。ROS 是正常細(xì)胞系統(tǒng)中的重要組成部分，在調(diào)節(jié)生物體的各種生理功能中起著重要的作用［1］。低濃度時(shí)，ROS 作為信號(hào)分子參與正常細(xì)胞代謝的生理活動(dòng)［2］，但當(dāng)ROS 濃度不斷升高時(shí)，它會(huì)引起細(xì)胞損傷［3］導(dǎo)致癌癥、糖尿病、心臟病、腫瘤和一些神經(jīng)退行性疾?。?］，這一現(xiàn)象被稱為氧化應(yīng)激［5］。ROS 對(duì)環(huán)境科學(xué)、生命科學(xué)等領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究與應(yīng)用都有著重要影響，因此對(duì)ROS 的檢測(cè)與定量分析有著重要意義［6］。目前已經(jīng)存在許多用于定量測(cè)定ROS 的分析方法（如熒光法［7］、分光光度法［8］、高效液相色譜法［9］、電子自旋共振法［10］、質(zhì)譜法［11］、比色法［12］和電化學(xué)方法［13］），但在選擇分析方法與檢測(cè)手段時(shí)需要考慮以下問(wèn)題：（1）不同種類的ROS 具有不同的內(nèi)在特性（壽命、擴(kuò)散速率及生成源），這可能導(dǎo)致對(duì)其測(cè)量的不準(zhǔn)確和不一致；（2）一些檢測(cè)方案需要在細(xì)胞源上進(jìn)行檢測(cè)，還需要考慮所用傳感材料的生物相容性；（3）ROS 檢測(cè)需要成本低廉、穩(wěn)定性高、選擇性好和靈敏度優(yōu)異的檢測(cè)技術(shù)。

電化學(xué)技術(shù)因其高靈敏度、高選擇性、易于操作和直接定量等特點(diǎn)，已被證明是測(cè)定ROS 的有效工具。近年來(lái)，通過(guò)研究天然酶的結(jié)構(gòu)和催化特性，人們?cè)O(shè)計(jì)與合成了與天然酶活性相似的納米模擬酶來(lái)代替天然酶。納米模擬酶不僅比表面積大、生物相容性好、結(jié)構(gòu)性能穩(wěn)定，而且還具有化學(xué)與物理性質(zhì)易于控制、成本低等優(yōu)點(diǎn)。因此，納米模擬酶常被用于構(gòu)建生物電化學(xué)傳感器（如谷胱甘肽［14］、葡萄糖［15］、膽固醇［16］、·［17］、·OH［18］以及H2O2［19］等生物小分子傳感器）。本文主要總結(jié)了納米模擬酶在活性氧（·，·OH，H2O2）檢測(cè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展。

1 模擬酶

天然酶是在活細(xì)胞中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，對(duì)底物具有高度特異性和催化性能［20］，不僅在生物體中表現(xiàn)出催化特性［21］，還能催化外部反應(yīng)，模擬環(huán)境。由于這一特點(diǎn)，它們被廣泛應(yīng)用于疾病診斷、臨床治療、農(nóng)業(yè)工程和食品加工等各個(gè)領(lǐng)域［22］。然而，天然酶很容易失活，苛刻的pH 環(huán)境可能會(huì)使天然酶失去催化功能。此外，天然酶的提取和純化過(guò)程也會(huì)造成其損耗并增加成本。這些天然酶固有的缺陷大大阻礙了它們的實(shí)際應(yīng)用。

模擬酶是一種以主-客體化學(xué)［23］和超分子化學(xué)理論［24］為基礎(chǔ)發(fā)明的具有天然酶類似催化活性的非蛋白類物質(zhì)。主-客體化學(xué)的基本原理來(lái)源于酶和底物之間的相互作用，即主體和客體在結(jié)合部位的空間及電子排列的互補(bǔ)，這類似于酶與其所識(shí)別的底物的結(jié)合。超分子化學(xué)理論是根據(jù)酶催化反應(yīng)機(jī)理有效地模擬酶分子的催化過(guò)程［25］，通過(guò)研究尋找出能與底物分子產(chǎn)生分子間相互作用的主體分子。

納米模擬酶是具有酶活性的納米材料，因其成本低、表面易修飾、穩(wěn)定性強(qiáng)、活性可調(diào)等優(yōu)點(diǎn)而受到人們的廣泛關(guān)注。它能有效地克服天然酶成本高、穩(wěn)定性差、可重復(fù)性差等缺點(diǎn)，并保持天然酶催化活性高和選擇性好等特點(diǎn)。到目前為止，各種基于納米模擬酶的分析傳感器［26］已被用于檢測(cè)各種離子、生物小分子（如過(guò)氧化氫、葡萄糖、乳酸、膽固醇和乙醇）、生物大分子（如凝血酶和DNA）和其他生物分子（如細(xì)胞、細(xì)菌或病毒）。

1.1 傳統(tǒng)模擬酶

根據(jù)主-客體化學(xué)和超分子理論，已研究出了多種傳統(tǒng)模擬酶。傳統(tǒng)模擬酶不僅在耐酸堿、熱穩(wěn)定性方面優(yōu)于天然酶，而且價(jià)格便宜，可大量應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中。幾種常見(jiàn)的傳統(tǒng)模擬酶的介紹如下：

環(huán)糊精［27］是由多個(gè)葡萄糖單元組成的環(huán)狀低聚糖［28］。環(huán)糊精的外緣親水而內(nèi)腔疏水，因而它能夠像酶一樣提供一個(gè)疏水的結(jié)合點(diǎn)，并作為主體包絡(luò)各種適當(dāng)?shù)目腕w，如有機(jī)分子、無(wú)機(jī)離子以及氣體分子等。因此，它經(jīng)常被用作與其他材料結(jié)合的模仿酶的底物。

卟啉［29］是一類由四個(gè)吡咯環(huán)和四個(gè)內(nèi)消旋碳以不同的方式排列形成的大分子雜環(huán)化合物，所得的卟啉異構(gòu)體表現(xiàn)出非常不同的電子特性。研究表明，卟啉是一種具有豐富化學(xué)配位的多功能配體，它非常容易與所有金屬/準(zhǔn)金屬/非金屬形成絡(luò)合物。因此，卟啉長(zhǎng)期以來(lái)被廣泛用于材料科學(xué)、生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。

2020 年，F(xiàn)an 等［28］通過(guò)CoⅢ-PPIX 的CoⅢ和Py2CD 的吡啶N 之間的共價(jià)鍵實(shí)現(xiàn)了鄰甲基化環(huán)糊精二聚體與鈷原卟啉（CoⅢPPIX@Py2CD）的仿生組裝（如圖1 所示），開發(fā)了用于檢測(cè)H2O2的電化學(xué)傳感器。該傳感器檢測(cè)線性范圍較寬，檢測(cè)下限為2.47×10－7mol/L，為仿生載體的開發(fā)和生物的檢測(cè)分析提供了一些建設(shè)性的啟示。

在傳統(tǒng)模擬酶中除了上述提到的環(huán)糊精模擬酶和卟啉類模擬酶外，還有分子印跡聚合物模擬酶［27］。分子印跡聚合物模擬酶是通過(guò)分子印跡技術(shù)（molecular imprinting technology，MIT）將功能單體與分子印跡模板通過(guò)交聯(lián)劑聚合成分子印跡聚合物（molecular imprinted polymer，MIP），然后再將印跡分子從MIP 中除去，只留下具有特定分子特異性識(shí)別功能的分子結(jié)構(gòu)。分子印跡聚合物模擬酶在催化、固相萃取、傳感器和抗體等許多方面得到了迅速發(fā)展。分子印跡聚合物模擬酶具有良好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性、潛在的可重復(fù)使用性、簡(jiǎn)單的制備工藝以及易于與傳感器集成等優(yōu)點(diǎn)。

電化學(xué)方法靈敏度高，響應(yīng)速度快且不需要復(fù)雜的儀器，這些特性使其與分子印跡聚合物模擬酶的結(jié)合在分析研究中有廣闊的應(yīng)用前景。2019 年，Huang等［30］研究了一種用于檢測(cè)·OH 的分子印跡聚合物模擬酶?jìng)鞲衅鳎ㄈ鐖D2），該傳感器以吡咯為功能單體，通過(guò)簡(jiǎn)單的電化學(xué)方法在還原氧化石墨烯（rGO）上印跡2，5-二甲基苯甲酸（2，5-DHBA）。該方法改善了2，5-DHBA 的導(dǎo)電性和質(zhì)量傳輸，增加了2，5-DHBA 識(shí)別活性位點(diǎn)的可能性。

除了上述提到的幾種傳統(tǒng)模擬酶外，其他的如冠醚類、杯芳烴類也受到了人們的關(guān)注。冠醚是一種簡(jiǎn)單的環(huán)狀化合物，最常見(jiàn)的形式是環(huán)氧乙烷的大環(huán)低聚物［31］。其特征是可以通過(guò)不同的合成方法調(diào)節(jié)其空腔大小從而選擇性地結(jié)合陽(yáng)離子和中性物種［32］。胡偉等［33］發(fā)現(xiàn)雜氮冠醚化席夫堿鈷（Ⅱ）配合物對(duì)磷酸二酯（BNPP）水解具有很好的催化活性。杯芳烴是由苯酚基和亞甲基或類似基團(tuán)交替連接形成的環(huán)狀低聚物。與冠醚相似，杯芳烴也具有可調(diào)節(jié)的疏水空腔，可以對(duì)金屬離子和中性分子進(jìn)行包絡(luò)。Ozyilmaz等［34］通過(guò)將Fe3O4與杯芳烴的衍生物進(jìn)行結(jié)合制備了一種包封脂肪酶，并研究其催化活性與穩(wěn)定性。

相比天然酶，傳統(tǒng)模擬酶在耐酸、耐堿、熱穩(wěn)定性等方面都具有優(yōu)勢(shì)，而且價(jià)格便宜，能大規(guī)模用于實(shí)際應(yīng)用中。但是，傳統(tǒng)模擬酶也存在合成較為復(fù)雜、催化活性位點(diǎn)單一、催化效率低以及分離、回收和再生較困難等缺點(diǎn)。

1.2 納米材料模擬酶

納米粒子是一類大小在1～100 nm 之間、具有獨(dú)特的化學(xué)、電學(xué)、物理、力學(xué)性能的粒子［27］。由于納米粒子具有不同于常規(guī)材料的尺寸效應(yīng)、表面與界面效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、汽車工業(yè)、食品加工、藥物傳遞、電子產(chǎn)品、醫(yī)學(xué)成像、化妝品、分析檢測(cè)、建筑材料等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。近年來(lái)，隨著對(duì)納米材料的深入研究，大量文獻(xiàn)報(bào)道證實(shí)，納米材料可以模擬多種天然酶的活性。

金屬有機(jī)框架（metal-organic frameworks，MOFs）［35］材料是一類由金屬離子和多元有機(jī)配體通過(guò)共價(jià)鍵形成的新型晶體材料。研究人員已經(jīng)合成了不同類型的MOFs，并將其廣泛應(yīng)用于電分析領(lǐng)域。沸石咪唑框架（zeolitic imidazolate frameworks，ZIFs）作為一種常見(jiàn)的多孔MOFs 材料，具有化學(xué)穩(wěn)定性高、孔隙率均勻、比表面積大和結(jié)構(gòu)可調(diào)節(jié)等優(yōu)良特性。ZIFs可以作為模板和前驅(qū)體用于制備具有高導(dǎo)電性和熱穩(wěn)定性的多孔碳材料，通過(guò)不同的方式處理后可以作為類超氧化物歧化酶、類過(guò)氧化物酶、類氧化酶等。Wu 等［36］開發(fā)了一種新型的過(guò)氧化氫電化學(xué)生物傳感器。他們采用含鈷金屬有機(jī)骨架碳化工藝，制備了具有菱形十二面體形貌的納米碳復(fù)合材料（Co-NC RDCs）。Co-NC 是通過(guò)炭化ZIF-67 前驅(qū)體得到的產(chǎn)物，它具有多孔結(jié)構(gòu)、大的比表面積和高的電導(dǎo)率，且對(duì)過(guò)氧化氫具有獨(dú)特的電化學(xué)傳感性能。

金屬納米材料如金納米顆粒（AuNPs）、鉑納米顆粒（PtNPs）、銀納米顆粒（AgNPs），氧化鈰納米顆粒［37］（CeOxNPs）等被廣泛用于生物傳感領(lǐng)域。AuNPs 是一種海綿狀結(jié)構(gòu)，其有效表面積比相同體積的散裝金膜大數(shù)百到數(shù)千倍。AuNPs 同時(shí)還具有表面活性位點(diǎn)多、吸附力強(qiáng)、電子密度高等特點(diǎn)，能與多種生物分子結(jié)合而不影響其生物活性。因此，AuNPs 在生物傳感器中的應(yīng)用為提高傳感器性能和開發(fā)高效、新型生物傳感器提供了可能性。鈰離子可以在Ce3+和Ce4+之間可逆轉(zhuǎn)換，使得Ce 原子能夠快速且大幅度地調(diào)整其電子結(jié)構(gòu)（如產(chǎn)生氧空位或缺陷），以最佳的結(jié)構(gòu)適應(yīng)其周圍環(huán)境，從而使得CeNPs 具有優(yōu)異的催化特性，可以用于清除各種毒性活性氧物質(zhì)。2020 年，Duanghathaipornsuk 等［38］采用普魯士藍(lán)（PB）和Ce NPs 以及氧化石墨烯（GO）制備了CeNPs/GO 復(fù)合材料，將其作為電極材料構(gòu)建了用于檢測(cè)·OH 的電化學(xué)傳感器。該傳感器對(duì)·OH 的檢測(cè)限為60 μmol/L。該項(xiàng)工作為開發(fā)檢測(cè)·OH 的電化學(xué)傳感器提供了新思路。

與金屬納米酶相比，碳基納米材料［39］具有更高的生物相容性和可調(diào)節(jié)的酶活性。如石墨烯［40］作為一種碳基納米材料，由于其優(yōu)異的導(dǎo)電率、比表面積高和成本低，在電化學(xué)傳感方面具有非常大的應(yīng)用潛力。Cui 等［41］將錳（Ⅲ）四苯基卟啉（MnTPP）與電化學(xué)還原氧化石墨烯［42］（ERGO）復(fù)合得到具有超氧化物酶活性的MnTPP/ERGO 納米復(fù)合材料用于檢測(cè)·，檢出限為0.039 μmol/L。石墨烯非常容易聚集導(dǎo)致其性能受到影響，這極大地限制了它的應(yīng)用。將石墨烯羥基功能化可以解決它的團(tuán)聚問(wèn)題，通過(guò)增加含氧基團(tuán)（羥基、羧基、氧）的數(shù)量來(lái)增加它在溶劑中的溶解性和分散性，還可以增大電化學(xué)傳感器的活性表面積從而增強(qiáng)電化學(xué)性能。Aghamiri 等［43］制備了氧化還原蛋白（Cyt-c）固定在電聚合聚苯胺（PANI）/羥基化多壁碳納米管（cMWCNT）復(fù)合材料薄膜修飾在玻碳電極（GCE）上，并應(yīng)用于H2O2的痕量檢測(cè)。具有多孔結(jié)構(gòu)的cMWCNT 對(duì)蛋白質(zhì)具有極高的負(fù)載能力，通過(guò)cMWCNT 的石墨結(jié)構(gòu)與PANI 的芳香環(huán)之間的相互作用結(jié)合成cMWCNT/PANI。該材料具有良好的導(dǎo)電性和優(yōu)異的電荷轉(zhuǎn)移特性。Cyt-c/cMWCNT/PANI/GC 傳感器對(duì)H2O2的檢測(cè)靈敏度為97.6 nA/（μmol/L），檢測(cè)限為0.2 μmol/L，線性響應(yīng)范圍為2～600 μmol/L。

磷酸錳（Mn3（PO4）2）［44］是一種獨(dú)特的錳鹽，可通過(guò)歧化反應(yīng)從水溶液中快速地去除超氧化物。Mn3（PO4）2對(duì)·有極好的催化活性，并且生物兼容性好，因此Mn3（PO4）2可以作為納米模擬酶用于·的檢測(cè)。Ding 等［45］制備了一種基于石墨烯/脫氧核糖核酸/磷酸錳（Gr/DNA/Mn3（PO4）2）模擬酶的傳感器，該傳感器能快速、靈敏地檢測(cè)·。在該模擬酶中，利用π-π 將DNA 吸附在石墨烯上，一方面，在保持碳材料完整結(jié)構(gòu)的同時(shí)可以對(duì)其進(jìn)行功能化從而提高M(jìn)n3（PO4）2的催化性能；另一方面，將DNA 吸附在石墨烯上還可以促進(jìn)Mn3（PO4）2的均勻生長(zhǎng)。該傳感器成功檢測(cè)到了癌細(xì)胞中釋放的·，在生物傳感和生物醫(yī)療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

聚苯胺［46］（PANI）由于其高導(dǎo)電性和低成本，在眾多導(dǎo)電聚合物中受到極大的關(guān)注。這些獨(dú)特的性能使PANI 適用于許多的領(lǐng)域（如燃料電池、超級(jí)電容器、電化學(xué)傳感和生物傳感等）。Gabunada 等［47］通過(guò)濕法回流策略合成了基于磁鐵礦納米棒的聚苯胺/還原氧化石墨烯（Fe3O4@PANI/rGO）。該復(fù)合材料熱穩(wěn)定性好、活性表面積大、催化活性點(diǎn)多、導(dǎo)電性強(qiáng)。用Fe3O4@PANI/rGO 構(gòu)建的傳感器對(duì)H2O2的靈敏度為223.7 μA/（mmol/L·cm2），LOD 為4.45 μmol/L，檢測(cè)范圍為100 μmol/L～1.5 mmol/L。

通過(guò)一定的手段可以使上述提到的各種新型納米材料具有更好的電化學(xué)活性，從而作為不同種類的納米模擬酶與電化學(xué)技術(shù)結(jié)合，用于有效地檢測(cè)活性氧物質(zhì)，以促進(jìn)對(duì)生物過(guò)程的理解和監(jiān)測(cè)。

2 納米模擬酶在活性氧檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1 超氧陰離子（·）的檢測(cè)

Sadeghian 等［53］制備了一種三維納米金網(wǎng)電化學(xué)傳感器（圖3）。多孔金納米網(wǎng)（NPGM）上附著Cyt-c并與工作電極結(jié)合，來(lái)測(cè)量藥物誘導(dǎo)C2C12 細(xì)胞的·通過(guò)多孔膜的釋放速率。該傳感器對(duì)·的靈敏度為7.29 nA/（nmol/L·cm2），最低檢出限為70 pmol/L。該工作通過(guò)改變納米金的的形貌來(lái)增加比表面積，提高了該超氧化物傳感器的電化學(xué)性能。這項(xiàng)工作將為開發(fā)高靈敏度的分子電化學(xué)生物傳感器提供了一個(gè)平臺(tái)。

圖3 細(xì)胞外超氧化物的電化學(xué)檢測(cè)[53]（a）通過(guò)氧化還原蛋白（Cyt-c）與電極之間的氧化和直接電子轉(zhuǎn)移來(lái)實(shí)現(xiàn)的傳感機(jī)制；（b）細(xì)胞被界面連接功能化電極示意圖Fig.3 Electrochemical detection of extracellular superoxide［53］（a）sensing mechanism realized by oxidation and direct electron transfer between redox protein（Cyt-c）and electrode；（b）schematic diagram of functional electrode connected by cell interface

除了上述提到的Au NPs 以外，Pt NPs 也可作為·的催化劑與石墨烯相結(jié)合作為類超氧化物歧化酶。2019 年，Hu 等［54］通過(guò)電沉積將Pt NPs 沉積在三維石墨烯泡沫（3D GF）上構(gòu)建原位檢測(cè)·的三維傳感平臺(tái)。Pt@3D GF 具超強(qiáng)的電化學(xué)活性，能使電荷轉(zhuǎn)移電阻降低85%，且3D GF 是一個(gè)具有生物相容性的平臺(tái)，有較高的表面積且適合細(xì)胞附著/生長(zhǎng)。該平臺(tái)有明確的表面和界面特性，可實(shí)現(xiàn)從細(xì)胞中釋放的·的現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)。此外，研究發(fā)現(xiàn)，在3D GF 上沉積Pt NPs，減少了帶負(fù)電荷的·和電極表面之間的排斥力，使得3D GF 有更高的電子轉(zhuǎn)移速率和更好的電催化活性。

圖4 鈷納米復(fù)合材料的制備及其對(duì)· 檢測(cè)流程圖［55］Fig.4 Preparation of cobalt nanocomposites and its flow chart for · detection［55］

相比于MOFs 的不斷改進(jìn)，將磷酸錳與其他生物技術(shù)相結(jié)合應(yīng)用于對(duì)·的電化學(xué)傳感也是一個(gè)較好的方向。Wang 等［59］構(gòu)建了一個(gè)基于細(xì)菌纖維素@脫氧核糖核酸-磷酸錳（BC@DNA-Mn3（PO4）2）的絲網(wǎng)印刷電極的活細(xì)胞傳感界面?；罴?xì)胞被固定在BC@DNA-Mn3（PO4）2納米酶?jìng)鞲衅脚_(tái)上，以快速、可靠地檢測(cè)活細(xì)胞釋放的·。該類傳感器在小型化、生物相容性、成本低和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)方面具有巨大的潛力。這項(xiàng)研究進(jìn)一步表明，現(xiàn)有的構(gòu)建活細(xì)胞傳感界面的方法在未來(lái)的原位檢測(cè)技術(shù)和下一代智能生物芯片、疾病診斷方面具有十分廣闊的前景。

近年來(lái)，研究人員使用電化學(xué)技術(shù)將納米模擬酶與特定的傳感元件結(jié)合用于開發(fā)檢測(cè)·的電化學(xué)傳感器。將有機(jī)材料與無(wú)機(jī)材料相結(jié)合用于改善電化學(xué)傳感器的線性范圍窄、檢測(cè)限不夠低等缺點(diǎn)，并提高傳感器對(duì)·的選擇性、穩(wěn)定性。表1［41，45，53-59］展示了用于·檢測(cè)的不同修飾電極的性能比較。

表1 用于· 檢測(cè)的不同修飾電極的性能比較Table 1 Comparison of the analytical performance of different modified electrodes for detection of ·

表1 用于· 檢測(cè)的不同修飾電極的性能比較Table 1 Comparison of the analytical performance of different modified electrodes for detection of ·

2.2 羥基自由基（·OH）的檢測(cè)

·OH 在高級(jí)氧化過(guò)程（advanced oxidation processes）中作為主要氧化劑降解持久性污染物。但同時(shí)·OH 也會(huì)破壞碳水化合物、核酸、脂類和氨基酸等生物分子，并對(duì)生物體和人類造成極大危害?！H被認(rèn)為是生物系統(tǒng)中產(chǎn)生的最強(qiáng)大的具有潛在危險(xiǎn)的ROS，過(guò)量可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷［60］?！H 的濃度也與各種癌癥［61］、糖尿?。?2］和神經(jīng)退行性疾?。?3］（如阿爾茨海默病和帕金森?。┯嘘P(guān)，了解·OH 濃度與這些疾病之間的關(guān)系有助于更好地診斷和預(yù)防。因此，開發(fā)能夠快速分析·OH 的靈敏檢測(cè)方法是非常重要的。

Huang 等［64］通過(guò)構(gòu)建一個(gè)使用DNA 和6-巰基己醇（MCH）的生物傳感器，證明了DNA 氧化損傷的程度與·OH 的濃度有關(guān)。他們以氮摻雜的多孔碳材料和AuNPs 作為信號(hào)放大器，進(jìn)一步提高了電化學(xué)探針的靈敏度和最低檢出限。通過(guò)電化學(xué)探針［Ru（NH3）6］評(píng)估·OH 誘導(dǎo)的DNA 損傷。該傳感器具有良好的電導(dǎo)率，其檢測(cè)限為25.0 μmol/L。

盡管上述基于DNA 的生物傳感器很容易制備，但DNA 存在易降解等缺點(diǎn)，這極大地限制了它的實(shí)際應(yīng)用?？寡趸瘎┍徽J(rèn)為是防止自由基損傷的還原劑，Abdel-Hamid 等［65］將咖啡酸（CAF）作為抗氧化劑，通過(guò)清除自由基來(lái)防止·OH 的形成，這可以保護(hù)DNA 不被降解。為了研究雙鏈DNA（dsDNA）與咖啡酸（CAF）的相互作用并評(píng)估抗氧化性能，采用多壁碳納米管固定dsDNA 并作為玻碳電極修飾材料。在本研究中，同時(shí)研究了·OH 對(duì)DNA 造成的氧化損傷，并觀察到在加入CAF 后，由于其清除·OH 的特性，ds-DNA 受到保護(hù)。該項(xiàng)工作能夠構(gòu)建生物傳感器用于鑒定DNA 損傷，對(duì)癌癥、病毒感染等疾病的預(yù)防具有非常重要的參考意義。

除了通過(guò)直接的DNA 氧化損傷程度來(lái)檢測(cè)·OH的濃度外，還可以通過(guò)檢測(cè)其他·OH 捕獲物來(lái)間接檢測(cè)和判斷·OH 的濃度。Li 等［66］將羧基功能化石墨烯（CFG）通過(guò)自組裝單分子膜技術(shù)（SAMs）與乙二胺（NHCH2CH2NH）共價(jià)相互作用固定在玻璃碳電極（GCE）上，得到快速、靈敏檢測(cè)·OH 的CFGNHCH2CH2NH/GCE 電化學(xué)傳感平臺(tái)。在測(cè)定過(guò)程中，·OH 的濃度不是直接獲得的，而是采用4-羥基苯甲酸（4-HBA）作為·OH 捕獲物，間接測(cè)得·OH。

Duanghathaipornsuk 等［67］提出了一種超靈敏的電化學(xué)傳感器。該傳感器由超小氧化鈰納米團(tuán)簇（＜2 nm）電沉積在絲網(wǎng)印刷碳電極（SPCE）上構(gòu)筑而成。該電化學(xué)傳感器的檢測(cè)限（LOD）為0.6 μmol/L。此外，該納米氧化鈰電化學(xué)傳感器在體外成功檢測(cè)到新生小鼠骨組織的成骨細(xì)胞中存在·OH。為了最小化Ce NPs 的尺寸，從而最大限度地增加用于·OH 清除和檢測(cè)的Ce3+位點(diǎn)的數(shù)量（式（1），（2）為氧化鈰與羥基自由基反應(yīng)原理），該團(tuán)隊(duì)采用表面有機(jī)金屬化學(xué)（SOMC）合成策略來(lái)獲得納米級(jí)的CeOx，通過(guò)控制有機(jī)金屬前體的負(fù)載來(lái)調(diào)整CeOx納米團(tuán)簇的大小和分散性。超靈敏電化學(xué)傳感器有望應(yīng)用于醫(yī)療診斷、燃料電池技術(shù)以及食品和化妝品行業(yè)。

在活性氧檢測(cè)領(lǐng)域，對(duì)·OH 的檢測(cè)相對(duì)偏少，這是因?yàn)椤H 具有較高的化學(xué)反應(yīng)性，壽命極短（在生物系統(tǒng)中約為15 s），且難以在模型系統(tǒng)中進(jìn)行檢測(cè)并研究其與DNA 損傷的關(guān)系。在眾多研究中Ce NPs 對(duì)·OH 具有極高的選擇性，這為·OH 的檢測(cè)提供了新思路。另外還可以通過(guò)直接判斷DNA 的損傷程度來(lái)檢測(cè)·OH 濃度或通過(guò)·OH 捕獲物間接檢測(cè)·OH。表2［38，64，66-67］展示了用于·OH 檢測(cè)的不同修飾電極的性能比較。

表2 用于·OH 檢測(cè)的不同修飾電極的性能比較Table 2 Comparison of the analytical performance of different modified electrodes for detection of ·OH

2.3 H2O2的檢測(cè)

H2O2是一種簡(jiǎn)單、重要且功能強(qiáng)大的氧化劑，廣泛應(yīng)用于化工、臨床應(yīng)用、藥物分析、食品制造和環(huán)境保護(hù)等多個(gè)領(lǐng)域。它不僅在化學(xué)和工業(yè)過(guò)程中產(chǎn)生，而且是人體中多種氧化代謝途徑的副產(chǎn)物。為了保證生物功能的正常，H2O2濃度必須低于100 nmol/L［68］，高于此濃度會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的氧化應(yīng)激和損傷［69］從而導(dǎo)致嚴(yán)重疾?。?0］（如癌癥、糖尿病、阿爾茨海默病和帕金森病等），甚至加速衰老。因此，實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)H2O2至關(guān)重要。以下介紹幾種用于檢測(cè)H2O2的電化學(xué)傳感器：

MOFs 對(duì)H2O2的氧化表現(xiàn)出獨(dú)特的電催化活性。Sherino 等［71］制備了一種以己二酸（adipic acid）為連接劑和哌嗪（piperazine）為載體的鎳金屬有機(jī)材料（APNi-MOF），并將其用作檢測(cè)H2O2的電極材料（AP-Ni-MOF/CPE）。AP-Ni-MOF具有1.28×10－3S·cm－1的高電導(dǎo)率，對(duì)H2O2的檢測(cè)具有很高的電化學(xué)活性。AP-Ni-MOF/CPE 檢測(cè)范圍是0.004～60 nmol/L，檢測(cè)限為0.0009 nmol/L。AP-Ni-MOF/CPE 電極在H2O2的實(shí)際樣品檢測(cè)（透鏡清潔劑溶液）中表現(xiàn)出了良好的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和選擇性。Liu 等［72］開發(fā)了一種新型的卟啉鐵金屬有機(jī)框架（pFeMOF）修飾的有序介孔碳（OMC），用于檢測(cè)活細(xì)胞釋放的H2O2。該pFeMOF/OMC 復(fù)合材料是通過(guò)簡(jiǎn)單的一步水熱法制備而成，F(xiàn)e（Ⅲ）離子與卟啉基團(tuán)的羧酸鹽具有很強(qiáng)的配位作用，可以使合成的MOFs 更加穩(wěn)定。pFeMOF可以模擬過(guò)氧化物酶特性，獲得良好穩(wěn)定的電化學(xué)信號(hào)。此外，通過(guò)引入了OMC 提高pFeMOF 的導(dǎo)電率，同時(shí)OMC 可以有效地控制pFeMOF 晶體生長(zhǎng)。這一策略改善了pFeMOF 團(tuán)聚從而使得更多的活性位暴露，提高了該復(fù)合材料的電化學(xué)活性。

在各類納米金屬與不同材料相結(jié)合的功能結(jié)合型材料中，除了金屬框架的MOF 外，碳基金屬材料的導(dǎo)電性能也非常優(yōu)異。Zhang 等［73］將一維金納米粒子（AuNPs）組裝在磁性氮摻雜碳納米管（NCNTs）上，再與細(xì)胞色素c（Cyt-c）結(jié)合制備出基于Cyt-c/NCNTs@Fe3O4@Au 的傳感器。其引入的AuNPs 不僅不會(huì)破壞Cyt-c 的天然結(jié)構(gòu)，還能增強(qiáng)Cyt-c 在電極表面的電催化特性。該傳感器用于檢測(cè)H2O2，其檢測(cè)限低至0.3 μmol/L。

與同為碳基材料的碳納米管相比，石墨烯具有更大的比表面積與穩(wěn)定性，Zhao 等［74］報(bào)告了一種快速制備銀納米粒子錨定激光誘導(dǎo)石墨烯（LIG@Ag）電極的方法，并用于H2O2檢測(cè)。通過(guò)偏焦激光燒灼方法，銀納米粒子可以均勻分布在具有缺陷和微孔的層狀結(jié)構(gòu)的LIG 納米片上，LIG 可以抑制銀納米粒子的尺寸增加，同時(shí)銀納米粒子也可以防止石墨烯納米片的團(tuán)聚。Ag NPs 和LIG 納米片的協(xié)同效應(yīng)使LIG@Ag 電極在許多方面呈現(xiàn)出優(yōu)異的電化學(xué)性能。該傳感器具有良好的穩(wěn)定性、重復(fù)性、選擇性，對(duì)H2O2的檢測(cè)限約2.8 μmol/L，靈敏度為28.6 μA（mmol/L·cm2）。由于LIG@Ag 電極具有優(yōu)異的導(dǎo)電性、機(jī)械靈活性和輕質(zhì)等特點(diǎn)，該方法為大規(guī)模制造智能傳感設(shè)備提供了一種新思路。

H2O2檢測(cè)已經(jīng)在工業(yè)領(lǐng)域和生物研究中獲得了廣泛的應(yīng)用。在各種H2O2檢測(cè)策略中，電化學(xué)因其高精確度和可靠性、良好的靈敏度和選擇性、低檢測(cè)限、快速反應(yīng)和小型化引起越來(lái)越多的關(guān)注。隨著納米材料的快速發(fā)展，各種納米材料被作為納米模擬酶應(yīng)用于生物傳感領(lǐng)域。表3［36，43，47，71-74］為用于H2O2檢測(cè)的不同修飾電極的性能比較。

表3 用于H2O2檢測(cè)的不同修飾電極的性能比較Table 3 Comparison of the analytical performance of different modified electrodes for detection of H2O2

3 總結(jié)與展望

納米酶已成為廣泛用于各種領(lǐng)域的熱門材料。特別是在生物傳感領(lǐng)域，與天然酶相比，納米模擬酶因其獨(dú)特的催化活性，在檢測(cè)活性氧的生物傳感器的構(gòu)建及應(yīng)用中發(fā)揮著重要作用。部分納米模擬酶作為電化學(xué)活性材料對(duì)一些特定的活性氧物質(zhì)具有獨(dú)特的催化性能，受到研究者的廣泛關(guān)注。

隨著與納米模擬酶有關(guān)的研究迅速增加，納米模擬酶應(yīng)用于ROS 檢測(cè)的研究也取得了一定的進(jìn)展，但在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程種還存在著一些問(wèn)題，具體如下：

（1）目前的研究大多集中在通過(guò)調(diào)節(jié)納米模擬酶的尺寸、形貌和結(jié)構(gòu)來(lái)優(yōu)化納米模擬酶對(duì)ROS 的催化性能，對(duì)納米模擬酶中活性位點(diǎn)的研究還很缺乏。

（2）對(duì)納米模擬酶與活性氧的催化機(jī)理的研究還不夠深入，因此了解其催化機(jī)制對(duì)設(shè)計(jì)新型納米酶和調(diào)節(jié)其活性具有重要意義。

（3）納米模擬酶在應(yīng)用過(guò)程中可能會(huì)與細(xì)胞內(nèi)成分如蛋白質(zhì)、核酸和小生物分子等發(fā)生相互作用，而導(dǎo)致其正常的生理功能的破壞。因此，有必要提高納米模擬酶的生物相容性，以開發(fā)出新型電化學(xué)生物傳感器，用于原位或?qū)崟r(shí)檢測(cè)ROS。

本文總結(jié)了納米模擬酶在不同種類活性氧的電化學(xué)生物傳感器方面的最新進(jìn)展，討論了其在當(dāng)前研究中的不足之處，為今后的研究提供參考。我們期望對(duì)新型的納米模擬酶進(jìn)行進(jìn)一步的研究開發(fā)，以提高其性能，加快發(fā)展納米模擬酶在ROS 檢測(cè)和分析中的應(yīng)用。