谷娟娟 丁 茹 周曉娜 周昌虎

非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）是全球較常見的慢性肝病，其發(fā)生和進(jìn)展與胰島素抵抗及遺傳易感密切相關(guān)[1]，其病理特征是除肝臟損傷及乙醇攝入外的因素導(dǎo)致的肝內(nèi)脂肪過度沉積[2]。研究報(bào)道亞洲人群的NAFLD 發(fā)病率高達(dá)27.4%，且呈逐年升高趨勢(shì)，嚴(yán)重危害了公共健康[3]。隨著NAFLD 患者的病情進(jìn)展，肝細(xì)胞出現(xiàn)損傷甚至壞死，引起肝細(xì)胞增殖及纖維結(jié)締組織增生，導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生，并可進(jìn)展為肝硬化[4-5]。在西方國(guó)家，NAFLD 正成為肝移植最常見的適應(yīng)證[6]。肝纖維化嚴(yán)重程度與NAFLD 患者的預(yù)后密切相關(guān)，因此早期診斷肝纖維化對(duì)于改善預(yù)后尤為重要[7]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）是一種相對(duì)穩(wěn)定的遺傳物質(zhì)，其參與調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄等過程。lncRNA 結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1 （CCAT1） 最初被視為促癌因子，其在結(jié)腸癌組織中呈高表達(dá)[8]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA CCAT1（以下簡(jiǎn)稱為CCAT1）也參與了卵巢癌、肝細(xì)胞癌等惡性腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的調(diào)控過程[9-10]。目前CCAT1 與NAFLD 關(guān)系的相關(guān)研究較少見，本研究探討了血清CCAT1 水平對(duì)NAFLD 患者肝纖維化及其程度的診斷價(jià)值，以期為NAFLD合并肝纖維化患者的診斷及治療提供參考。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2018 年2 月至2021 年12 月在樹蘭（杭州）醫(yī)院住院治療的256 例NAFLD 患者作為研究對(duì)象，男性143 例，女性113 例，年齡33～70 歲，平均年齡為（52.49±10.33）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）NAFLD 患者的診斷符合《非酒精性脂肪性肝病防治指南（2018 年更新版）》[11]中NAFLD 診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2） 經(jīng)肝臟穿刺活體組織病理檢查判斷纖維化程度； （3）患者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)： （1）合并肝硬化、病毒性肝炎等其他肝??；（2）有大量飲酒史（女性＞20 g/d，男性＞30 g/d）； （3）合并嚴(yán)重心、肺、腎功能不全；（4）合并其他臟器纖維化。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批號(hào)2018-1-016）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)血清CCAT1 水平 抽取受試者清晨空腹靜脈血3 mL，2 500 r/min離心15 min，取血清，使用TRIzol 試劑（購(gòu)自上海尚寶生物科技有限公司）提取血清中總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒（購(gòu)自上?；钌锟萍加邢薰荆┎僮鞑襟E反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用ABI 7500 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（購(gòu)自美國(guó)ABI 公司）進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 8 min；之后95 ℃變性30 s，56.5 ℃退火20 s，72.5 ℃延伸15 s，共40 個(gè)循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因CCAT1 的相對(duì)表達(dá)量。引物由生工生物工程 （上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.2 肝纖維化程度評(píng)估 所有患者均接受肝臟穿刺活體組織病理檢查，采用Metavir 評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行肝纖維化評(píng)估[12]。F0 期患者無肝纖維化，將其納入無肝纖維化組（100 例）；F1～F4 期患者存在肝纖維化，將其納入肝纖維化組（156 例）。F1～F2期患者為輕中度肝纖維化，將其納入輕中度肝纖維化組（112 例）；F3～F4 期患者為重度肝纖維化，將其納入重度肝纖維化組（44 例）。

1.2.3 臨床資料收集 收集患者的臨床資料，包括肝功能指標(biāo)ALT、AST、GGT、總膽固醇（TC）、總膽紅素（TBil），肝纖維化指標(biāo)——Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、Ⅳ型膠原（CⅣ）、層粘連蛋白（LN）、透明質(zhì)酸（HA），以及年齡、性別、身高、體重、既往病史，并計(jì)算BMI。實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)均由樹蘭 （杭州）醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 25.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。血清CCAT1 與肝纖維化指標(biāo)的相關(guān)性采用Pearson 法分析。采用ROC 曲線分析血清CCAT1 對(duì)NAFLD 患者肝纖維化及其程度的診斷效能。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝纖維化組與無肝纖維化組的臨床資料及血清CCAT1 水平比較

肝纖維化組的ALT、AST、GGT、PCⅢ、CⅣ、LN、HA 和CCAT1 水平均顯著高于無肝纖維化組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。2 組的年齡、性別、BMI、糖尿病患者占比、高血壓患者占比、肝病家族史患者占比、TBil 水平和TC 水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見表2。

表2 無肝纖維化組與肝纖維化組的臨床資料及CCAT1 水平比較

2.2 輕中度肝纖維化組與重度肝纖維化組的臨床資料及血清CCAT1 水平比較

重度肝纖維化組的ALT、AST、GGT、PCⅢ、CⅣ、LN、HA 和CCAT1 水平均顯著高于輕中度肝纖維化組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。2組的年齡、性別、BMI、糖尿病患者占比、高血壓患者占比、肝病家族史患者占比、TBil 水平和TC水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見表3。

表3 輕中度肝纖維化組與重度肝纖維化組的臨床資料及CCAT1 水平比較

2.3 NAFLD 合并肝纖維化患者的血清CCAT1 與肝纖維化指標(biāo)的相關(guān)性分析

Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，NAFLD 合并肝纖維化患者的血清CCAT1 水平與肝纖維化指標(biāo)血清PCⅢ、CⅣ、LN 水平均呈正相關(guān)（P均＜0.05）。見表4。

表4 血清CCAT1 與肝纖維化指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.4 NAFLD 患者的血清CCAT1 對(duì)肝纖維化的診斷效能

以有無肝纖維化為狀態(tài)變量（無肝纖維化＝0，肝纖維化＝1），以血清CCAT1 水平為檢驗(yàn)變量，繪制ROC 曲線，分析結(jié)果顯示NAFLD 患者的血清CCAT1 診斷肝纖維化的AUC 為0.742（（95%CI：0.684～0.795），最佳截?cái)嘀禐?.37，敏感度和特異度分別為55.57%和83.00%。見圖1。

2.5 NAFLD 合并肝纖維化患者的血清CCAT1 對(duì)肝纖維化程度的診斷效能

以肝纖維化程度為狀態(tài)變量（輕中度肝纖維化＝0，重度肝纖維化＝1），以血清CCAT1 水平為檢驗(yàn)變量，繪制ROC 曲線，分析結(jié)果顯示NAFLD合并肝纖維化患者的血清CCAT1 診斷重度肝纖維化的AUC 為0.795（95%CI：0.723～0.855），最佳截?cái)嘀禐?.43，敏感度和特異度分別為84.09%和63.39%。見圖2。

圖2 NAFLD 合并肝纖維化患者的血清CCAT1 診斷重度肝纖維化的ROC 曲線

3 討論

NAFLD 患者的肝臟組織病理特征是肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過度沉積，多數(shù)患者無過量飲酒史，是代謝綜合征的肝臟表現(xiàn)[13]。中國(guó)的NAFLD 發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)，是中國(guó)慢性肝病的常見類型[14]。脂肪在肝臟過度堆積可能會(huì)促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生和進(jìn)展，部分NAFLD 患者會(huì)合并不同程度的肝纖維化。研究發(fā)現(xiàn)肝纖維化的發(fā)生會(huì)使NAFLD 患者死亡風(fēng)險(xiǎn)增高[15]，因此早期診斷肝纖維化及其程度對(duì)于提高NAFLD 患者的生存率尤為重要。目前肝臟活體組織病理檢查仍被視為評(píng)估肝纖維化及其程度的金標(biāo)準(zhǔn)，但因其為有創(chuàng)性檢查且費(fèi)用較高，加之其易受醫(yī)生主觀因素影響，因此其作為早期診斷肝纖維化及其程度的方法應(yīng)用受到了限制[16]。血清學(xué)指標(biāo)取材較方便，檢測(cè)速度較快，為肝纖維化無創(chuàng)性診斷提供了新的方法。

lncRNA 是目前被研究得較為廣泛的血清學(xué)標(biāo)志物。近年來研究發(fā)現(xiàn)，功能性lncRNA 有潛力作為生物標(biāo)志物。CCAT1 最早在結(jié)腸癌組織中被發(fā)現(xiàn)，其在多種惡性腫瘤中起著促癌作用。魏旭靜等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，沉默CCAT1 表達(dá)可抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖。Cai 等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，CCAT1 可通過調(diào)節(jié)miR-490-3p/FRAT1 信號(hào)通路促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖和遷移。李蘭花[19]的研究發(fā)現(xiàn)，HBV 相關(guān)肝細(xì)胞癌患者的血清外泌體CCAT1 表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組。目前CCAT1 與肝纖維化關(guān)系的相關(guān)研究報(bào)道較少。

研究發(fā)現(xiàn)不同lncRNA 在肝纖維化進(jìn)程中的作用不同，一部分lncRNA 起著促進(jìn)作用，而另一部分lncRNA 則起著抑制作用，還有少數(shù)lncRNA 發(fā)揮著雙重作用[20]。本研究結(jié)果顯示，在NAFLD 患者中，肝纖維化組的血清CCAT1 水平顯著高于無肝纖維化組，肝功能指標(biāo)ALT、AST、GGT 和肝纖維化指標(biāo)PCⅢ、CⅣ、LN、HA 水平也均顯著高于無肝纖維化組，這提示CCAT1 可能參與調(diào)控NAFLD 患者肝纖維化的發(fā)生。ROC 曲線分析結(jié)果顯示，NAFLD 患者的血清CCAT1 診斷肝纖維化的AUC 為0.742，敏感度和特異度分別為55.57%和83.00%，當(dāng)血清CCAT1＞1.37 時(shí)，提示NAFLD 患者發(fā)生肝纖維化的可能性較大；Lu 等[21]的研究發(fā)現(xiàn)CCAT1 水平與急性腎損傷小鼠腎纖維化有關(guān)，這與本研究結(jié)果相似。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，重度肝纖維化組的ALT、AST、GGT、PCⅢ、CⅣ、LN、HA 和CCAT1 水平均顯著高于輕中度肝纖維化組，Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示NAFLD 合并肝纖維化患者的血清CCAT1 水平與肝纖維化指標(biāo)血清PCⅢ、CⅣ、LN 水平均呈正相關(guān)，上述結(jié)果提示CCAT1 可能參與調(diào)控NAFLD 患者肝纖維化的進(jìn)展。ROC 曲線分析結(jié)果顯示，NAFLD 合并肝纖維化患者的血清CCAT1 診斷重度肝纖維化的AUC 為0.795，敏感度和特異度分別為84.09%和63.39%，當(dāng)血清CCAT1 水平＞1.43 時(shí)，提示NAFLD 患者合并重度肝纖維化的風(fēng)險(xiǎn)增高。Huang 等[22]的研究結(jié)果顯示，CCAT1 在油酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞及L02 細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)，而沉默CCAT1 表達(dá)可抑制細(xì)胞中脂滴形成，CCAT1 在NAFLD 臨床樣本中的表達(dá)也顯著上調(diào)，這與本研究結(jié)果一致，提示CCAT1 可能通過促進(jìn)肝細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生和進(jìn)展。

綜上所述，NAFLD 患者中，有肝纖維化患者的血清CCAT1 水平高于無肝纖維化患者，且血清CCAT1 水平隨肝纖維化程度的加重而升高。血清CCAT1 對(duì)于NAFLD 患者肝纖維化及其程度的早期診斷具有一定價(jià)值。