茆 駿

（安徽省馬鞍山市博望區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村水利局，安徽馬鞍山 243000）

奶牛乳房炎是一種常見的疾病，會給奶牛健康和產(chǎn)奶量帶來很大的影響，從而影響奶牛養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益。乳房炎不僅會導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量下降，乳品質(zhì)下降，甚至?xí)?dǎo)致奶牛提前淘汰。另外，由于乳房炎引起的乳房疼痛，可能會使奶牛的行為和情緒受到影響，導(dǎo)致生產(chǎn)性能下降。奶牛乳房炎的原因很多，其中細(xì)菌感染是主要原因之一，大腸桿菌、葡萄球菌等為常見致病菌。細(xì)菌感染可以通過許多途徑傳播，如乳房受傷、不合適的奶牛管理、不潔凈的生產(chǎn)環(huán)境等[1]。奶牛乳房炎的治療和預(yù)防需要首先確定病原菌的類型和數(shù)量，因此對奶牛乳房炎致病菌進(jìn)行檢測非常重要。

目前主要的檢測技術(shù)有細(xì)菌培養(yǎng)法、PCR 檢測法、激光流式細(xì)胞儀檢測、體細(xì)胞計數(shù)等，其中體細(xì)胞計數(shù)不能鑒定具體的致病菌，只能間接評估是否存在乳腺炎，激光流式細(xì)胞儀檢測需要專業(yè)實驗室和設(shè)備，成本較高；細(xì)菌培養(yǎng)法需要培養(yǎng)時間長并且可能會漏檢微生物且檢測誤差較大，因為一些微生物難以在培養(yǎng)基上生長，靈敏度較低。對于某些細(xì)胞難以培養(yǎng)或生長速度較慢的致病菌，該方法可能會漏診或誤診。病原體抗體檢測也是一種簡單的檢測方法，可以通過血清或乳汁樣本來檢測奶牛體內(nèi)的病原體抗體，以確定奶牛是否感染了特定的致病菌?？梢栽诟腥驹缙诰瓦M(jìn)行檢測，減少疾病的傳播。對于一些難以培養(yǎng)或者檢測的病原體，該方法可以提供補充診斷信息。但其缺點是病原體抗體檢測不能直接檢測致病菌，只能檢測感染后奶牛體內(nèi)產(chǎn)生的抗體，因此有一定的局限性。不能確定病原體的藥物敏感性，并且需要對不同致病菌進(jìn)行特定的抗體檢測，因此檢測成本較高，不適合大規(guī)模應(yīng)用。PCR 檢測技術(shù)準(zhǔn)確性高，非常快速，可以在數(shù)小時內(nèi)得出結(jié)果，靈敏度要高于細(xì)菌培養(yǎng)法[2]。因此本文采用多重PCR 技術(shù)以建立可靠的奶牛乳房炎致病菌的檢測方法，并用臨床乳樣進(jìn)行驗證，證明其檢測方法的靈敏與準(zhǔn)確，為早期診斷和臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、化膿性鏈球菌、肺炎克雷伯氏菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、產(chǎn)氣腸桿菌、巴氏桿菌、乳房鏈球菌和停乳鏈球菌，均由安徽省馬鞍山市某牧場提供。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

高純度耐熱DNA 聚合酶2×Taq Master Mix(Dye Plus)、DNA 標(biāo)準(zhǔn)品購買自南京諾唯贊生物科技股份有限公司、細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒購買自上海晶諾生物科技有限公司；4 種致病菌引物由北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行合成，瓊脂糖、MB 培養(yǎng)基及瓊脂糖凝膠電泳裝置均參照廣東環(huán)凱微生物科技有限公司說明書配制和使用。

1.3 儀器設(shè)備

實時熒光定量PCR 儀（伯樂CFX Opus Deepwell）購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；瓊脂糖水平電泳儀（DYCP-32A 型，中號）購自北京六一生物科技有限公司；超凈工作臺（SW-CJ-2FD）購自紹興上虞艾科儀器公司；立式壓力蒸汽滅菌器（MVS-63/63G）購自冰山松洋生物科技（大連）有限公司。

2 實驗方法

2.1 引物設(shè)計與合成

參考GenBank 中的大腸桿菌pho A 基因（位置501～1166）、金黃色葡萄球菌nuc 基因（位置88～564）、無乳鏈球菌tuf 基因（位置529～815）、以 及肺炎克雷伯氏菌khe 基因（位置185～393），使用Primer 6.0 軟件進(jìn)行特異性引物的設(shè)計，最終設(shè)計引物以15～30bp 范圍以內(nèi)，4種致病菌的引物設(shè)計分別為CGTTTCTACCGCAGAGTTG、GGGCAATACGCAAAGAGG、TGGT GTTCTTCTTCGTGGTG、AGAGCGATGAGGAA GAGTTCA（序列均為5'→3'），引物最終由北京擎科生物科技有限公司合成。

2.2 模板DNA 的制備

先取細(xì)菌培養(yǎng)液2mL，10000r/min 離心1min，吸走上清液，向下層菌體中加入200μL 的EDTA 緩沖液，震蕩懸浮，再加入20μL 蛋白酶K 溶液以及200μL EDTA 緩沖液，混勻震蕩15s后高溫70℃靜置10min，再加入無水乙醇震蕩15s，將所得溶液及絮狀物加入吸附柱中以12000r/min 離心30min 后棄置上清液，將吸附柱裝入收集管中，重復(fù)吸附柱收集過程直至得到足夠數(shù)量收集管，吸附膜中間加入200μL EDTA 緩沖液靜置5min，12000r/min 離心30s 得到模板DNA 溶液。

2.3 引物PCR 擴增和鑒定

以2.2 提取到的4 種細(xì)菌DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴增。具體使用Taq Master Mix 10μL、模板2μL、上下游的引物各1μL、最后使用超純水使反應(yīng)體系體積最終達(dá)到20μL。PCR 擴增反應(yīng)的條件設(shè)置為：93℃條件下預(yù)變性5min，以93℃40s、54℃40s、72℃30s 為一個循環(huán)，共設(shè)置35個循環(huán)，最終以72℃延伸10min。最后取0.5μL的擴增產(chǎn)物進(jìn)行葡聚糖凝膠電泳實驗進(jìn)行分析[3]。

2.4 特異性和靈敏度試驗

以2.2 獲得的4 種模板DNA 混合溶液作為模板，同時以不是這4 種菌株基因組DNA 的其他菌株基因組DNA 一級超純水作為對照，按2.3 方法進(jìn)行引物的PCR 擴增，以檢測PCR 擴增技術(shù)的特異性。用核酸蛋白定量儀對4 種DNA 模板溶液進(jìn)行濃度測定，并將這4 種濃度已知的致病菌的模板DNA 進(jìn)行梯度稀釋后，按2.3 方法進(jìn)行PCR 技術(shù)擴增，并觀察比較PCR 擴增靈敏度。

2.5 臨床乳樣的PCR 檢測應(yīng)用

從牧場提供的樣本中獲取15 份具有典型奶牛乳房炎臨床癥狀的乳樣，使用設(shè)計好的PCR 技術(shù)檢測方法進(jìn)行檢測，以及傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)法進(jìn)行檢測，對兩種方法的4 種致病菌陽性檢出率進(jìn)行比較，并根據(jù)式（1）計算檢測方法的共同符合率。

式（1）中，A 表示兩種方法都檢測到目標(biāo)致病菌的樣本數(shù)量；B 表示只有PCR 技術(shù)檢測到目標(biāo)致病菌的樣本數(shù)量；C 表示只有細(xì)菌培養(yǎng)法檢測到目標(biāo)致病菌的樣本數(shù)量；D 表示兩種方法都未檢測到目標(biāo)致病菌的樣本數(shù)量。

3 實驗結(jié)果

3.1 PCR 擴增結(jié)果

利用2.1 中設(shè)計的PCR 擴增引物擴增4 種菌株的特異基因片段，瓊脂糖凝膠電泳如圖1 所示，使用大腸桿菌pho A 基因特異性引物對大腸桿菌DNA 模板擴增出的片段長度約為660bp，使用金黃色葡萄球菌nuc 基因?qū)瘘S色葡萄球菌DNA 模板擴增出的片段長度約為475bp，使用無乳鏈球菌tuf 基因特異性引物對無乳鏈球菌PCR擴增出的片段長度均約為288bp，使用肺炎克雷伯氏菌khe 基因特異性引物對肺炎克雷伯氏菌PCR 擴增出的片段長度均約為210bp，3 次重復(fù)PCR 擴增實驗結(jié)果相同，大小與預(yù)期相符。

圖1 PCR 擴增片段瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。

3.2 特異性和靈敏度試驗結(jié)果

以4 種模板DNA 混合溶液作為模板，同時擴增4 種目標(biāo)菌株片段以及非目標(biāo)菌株片段（使用化膿性鏈球菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、蠟樣芽孢桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、巴氏桿菌、以及乳房鏈球菌），瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2 所示。PCR 擴增技術(shù)可以擴增出目標(biāo)菌株大腸桿菌的660bp 片段、無乳鏈球菌475bp 片段、金黃色葡萄球菌288bp 片段、肺炎克雷伯氏菌的210bp 片段的目標(biāo)條帶，而其他非目標(biāo)菌株均為擴增出相近的片段，證明本試驗中PCR 擴增技術(shù)對4 種目標(biāo)菌株的特異性強，準(zhǔn)確性高。敏感性試驗中，用核酸DNA 定量裝置對4 種DNA 模板溶液進(jìn)行濃度測定，結(jié)果顯示4 種致病菌的濃度分別是170.2、189.5、106.4、202.8ng/μL，將其稀釋不同倍數(shù)后進(jìn)行PCR 擴增，結(jié)果顯示四種致病菌的模板DNA 最低測出濃度分別為17.02、18.59、10.2、21.1μg/μL，證明PCR 擴增技術(shù)對目標(biāo)菌株DNA 的濃度要求不高，反映出PCR 檢測技術(shù)的高靈敏度。

圖2 PCR 擴增片段瓊脂糖凝膠電泳特異性結(jié)果

3.3 臨床乳樣檢測結(jié)果

對牧場提供的30 份疑似奶牛乳房炎的乳樣分別進(jìn)行PCR 檢測技術(shù)和傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)檢測技術(shù)檢測，結(jié)果如表1 所示。使用PCR 技術(shù)的乳樣4種致病菌檢出率為83.3%，而細(xì)菌分離培養(yǎng)法的致病菌檢出率為73.3%，兩種檢測方法同時檢測出4 中致病菌的符合率為92.4%。從結(jié)果看使用PCR 檢測技術(shù)要優(yōu)于細(xì)菌分離培養(yǎng)檢測技術(shù)。

表1 30 份乳樣使用PCR 技術(shù)和細(xì)菌分離培養(yǎng)技術(shù)樣品檢測結(jié)果

4 討論

乳房炎是奶牛最常見的疾病之一，是乳房組織感染引起的炎癥反應(yīng)。這種疾病嚴(yán)重影響了奶牛的健康和生產(chǎn)性能。奶牛乳房炎的主要癥狀是乳汁異常，如顏色、氣味和質(zhì)地的變化。奶牛乳房炎會導(dǎo)致乳汁質(zhì)量下降，含有更多的細(xì)胞、蛋白質(zhì)和脂肪，而牛奶的產(chǎn)量也會受到影響，使得奶牛養(yǎng)殖產(chǎn)生較大的經(jīng)濟(jì)損失。奶牛乳房炎會導(dǎo)致奶牛的乳房發(fā)炎、腫脹，甚至化膿，這會給奶牛帶來疼痛和不適。長期的乳房炎癥還可能引發(fā)其他疾病，如乳腺瘤、乳腺增生等。另外，奶牛乳房炎是由細(xì)菌等微生物引起的疾病，如果不及時處理和治療，細(xì)菌可能會擴散到奶牛的其他部位或者其他奶牛身上，從而導(dǎo)致更多的感染和疾病傳播，甚至影響人類的健康[4]。奶牛乳房炎的病因很多，包括細(xì)菌病毒真菌和寄生蟲等微生物感染。常見的細(xì)菌包括溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等[5]。

在奶牛乳房炎的診斷與治療過程中，準(zhǔn)確鑒定主要致病菌是至關(guān)重要的。目前PCR 檢測可以對多種致病菌進(jìn)行同時檢測，并能夠檢測出極少量的致病菌，并且可以通過PCR 技術(shù)對特定的致病菌進(jìn)行快速檢測，相較于傳統(tǒng)方法，可大大縮短檢測時間，提高檢測效率，PCR 技術(shù)的引物序列設(shè)計較為特異，能夠準(zhǔn)確區(qū)分不同的病原菌種類。但缺點是技術(shù)較為復(fù)雜，需要購買較為昂貴的試劑盒，需要高度的技術(shù)操作和嚴(yán)格的實驗控制，另外引物選擇有一定的局限性，需要根據(jù)病原菌的特異性進(jìn)行設(shè)計[6]。

本研究基于PCR 技術(shù)設(shè)計了一種病原菌鑒定方法。選擇了大腸桿菌pho A 基因、金黃色葡萄球菌nuc 基因、無乳鏈球菌tuf 基因和肺炎克雷伯氏菌khe 基因進(jìn)行檢測，以上4 種基因片段在許多細(xì)菌中存在，但是這些基因序列在不同菌株之間的變異程度非常小，在不同的細(xì)菌中有著高度相似的序列，且相對穩(wěn)定地保持著這種相似性。這使得這些基因能夠作為檢測不同菌株的工具，因為它們具有高度一致性，不易受到基因變異的影響。使用特異性引物擴增出的片段特異性良好，特異性試驗結(jié)果表明PCR 擴增技術(shù)對選定的4 種致病菌的模板DNA 特異性強，不會對其他菌株DNA 進(jìn)行擴增，因此PCR 檢測的準(zhǔn)確性得以保證。該方法用于細(xì)菌培養(yǎng)物或臨床樣本的檢測靈敏度較高，能夠準(zhǔn)確地鑒定病原菌，保證了PCR 檢測方法的靈敏性。對30 份臨床樣本的PCR 分子檢測驗證結(jié)果表明，該方法能夠在提取基因組DNA 后的一天內(nèi)檢測分析出奶牛乳房炎感染的致病菌，另外將檢測結(jié)果與細(xì)菌分離培養(yǎng)法進(jìn)行比較，可以發(fā)現(xiàn)PCR 檢測技術(shù)不僅檢測時間更快，病菌陽性檢出率高于細(xì)菌分離培養(yǎng)，2種檢測方法符合率答92.4%，證明PCR 檢測技術(shù)的更加高效迅捷。

5 結(jié)論

本試驗設(shè)計構(gòu)建了基于PCR 技術(shù)對奶牛乳房炎主要致病菌的檢測方法，通過瓊脂糖凝膠電泳試驗證明對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和肺炎克雷伯氏菌4 種致病菌的模板DNA的PCR 擴增成功，特異性試驗和靈敏度試驗證明該PCR 檢測方法對目標(biāo)細(xì)菌的檢測靈敏度以及準(zhǔn)確率都很高。最后對牧場提供的疑似牛乳房炎30份乳樣分別進(jìn)行PCR 技術(shù)和細(xì)菌分離培養(yǎng)技術(shù)檢測，PCR 技術(shù)對4 種致病菌的檢出率要高于細(xì)菌分離培養(yǎng)法，能快速精準(zhǔn)地檢測出致病菌，證明PCR 檢測技術(shù)可以實際應(yīng)用于臨床，滿足對奶牛乳房炎病菌檢測的實際需求，為提高奶牛規(guī)模場的動物健康管理和質(zhì)量把控提供新檢測方法和參考依據(jù)。