魏澤華，韋景平，殷克勇，馬宏偉，張騰帥，梁稼燁，王宏宇，韓慶安

（河北省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河北石家莊050035）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是一種感染豬的高度傳染性和高度致死性傳染病。 該病于1921 年首次在肯尼亞報(bào)道，之后陸續(xù)在多個(gè)國(guó)家流行， 并于2018 年首次在我國(guó)發(fā)生，給各國(guó)養(yǎng)豬行業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。 盡管目前已有很多關(guān)于非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）潛在疫苗株的報(bào)道，但尚未有商品化的疫苗可供選擇， 防制ASF 的主要手段仍然是非免疫方法。ASF 在臨床癥狀和病理變化上與經(jīng)典豬瘟（Classical swine fever，CSF）相似，臨床診斷難以區(qū)分。 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)可以很容易的區(qū)分ASF 和CSF，而且在感染豬表現(xiàn)出臨床癥狀之前即可檢測(cè)到ASFV， 是目前ASF 診斷的主要手段。 ASFV 的檢測(cè)方法主要包括病原學(xué)方法和血清學(xué)方法， 目前最常用的是實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）技術(shù)。 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法具有快速、靈敏、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，在ASF 的防控、監(jiān)測(cè)和疫情處置方面具有重要意義。

1 簡(jiǎn)介

ASF 是由ASFV 引起豬的一種急性、高度接觸性傳染病，致死率高，臨診特征以高熱、皮膚發(fā)紺以及內(nèi)臟器官和淋巴結(jié)嚴(yán)重出血為主，死亡率可達(dá)100%。 ASF 在臨診癥狀和病理變化上與CSF、PRRS、PDNS 等出血性疾病相似，臨診鑒別診斷難度較大，ASF 確診必須借助實(shí)驗(yàn)室手段。 ASFV 病毒分離必須在生物安全三級(jí)（Biological Safety Level 3，BSL-3）及以上生物安全實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行， 低級(jí)別生物安全實(shí)驗(yàn)室不具備分離ASFV 的條件，因此基于病毒分離的檢測(cè)方法無(wú)法廣泛應(yīng)用。 但是， 作為ASF 確診的必要流程，病毒分離在ASFV 防控工作中仍具有重要意義。 常用的熒光PCR 方法具有較高的靈敏性和特異性， 且能夠檢測(cè)出樣品中痕量的病毒基因組。但熒光PCR 相關(guān)的儀器設(shè)備價(jià)格高昂，對(duì)操作人員的專業(yè)水平要求較高， 這限制了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。 傳統(tǒng)ELISA 方法流程繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)。 試紙條化的診斷技術(shù)可以降低對(duì)設(shè)備的要求，且實(shí)驗(yàn)時(shí)間大幅縮短，但其敏感性和準(zhǔn)確率可能略低于傳統(tǒng)方法。 在實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)針對(duì)具體情況選擇適宜的診斷方法。

2 病原學(xué)診斷技術(shù)

2.1 病毒分離技術(shù)

體外培養(yǎng)時(shí)，ASFV 可在豬白細(xì)胞、 豬骨髓細(xì)胞、PK-15 等豬源傳代細(xì)胞和Vero、BHK-21等非豬源傳代細(xì)胞上增殖，并引起細(xì)胞病變，在感染細(xì)胞中可觀察到包涵體。用作ASFV 培養(yǎng)的通常是豬肺泡巨噬細(xì)胞， 但細(xì)胞制備面臨倫理問(wèn)題。 有研究表明利用腎源性初代巨噬細(xì)胞對(duì)ASFV 進(jìn)行培養(yǎng)也可取得很好的效果，且能夠避免倫理限制。 ASFV 可在雞胚卵黃囊中增殖，并引起雞胚死亡。感染ASFV 的單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞可以吸附豬紅細(xì)胞， 因此可用血細(xì)胞吸附試驗(yàn)鑒別ASFV 感染。熒光抗體試驗(yàn)亦可作為ASF診斷的一種輔助方法。

2.2 分子生物學(xué)診斷技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （Polymerase Chain Reaction，PCR）具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)，是目前ASFV 檢測(cè)最常用的方法。 常規(guī)PCR 是一種相對(duì)經(jīng)典的方法，由于步驟繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)， 已逐漸被熒光PCR 代替。 相比于熒光PCR， 常規(guī)PCR 的優(yōu)勢(shì)在于可以合成更長(zhǎng)的序列， 因此更適用于不同分離株的基因分型。B646L 是編碼p72 蛋白的基因， 對(duì)此基因3’末端進(jìn)行序列分析，可將ASFV 分為24 個(gè)基因型，是ASFV 基因分型的主要方法。

實(shí)時(shí)熒光PCR 比常規(guī)PCR 更省時(shí)、操作更簡(jiǎn)便、結(jié)果更直觀，各類基于水解探針?lè)椒ǖ纳唐坊噭┖袑映霾桓F。 一種基于水解探針的檢測(cè)方法可以將檢出限降低至6.91 copies/reaction，優(yōu)化后的反應(yīng)時(shí)間大約50 分鐘，相較于一般的熒光PCR 方法具有更高的敏感性和更快的檢測(cè)速度。 基于SYBR Green I 染料的可視化PCR 方法可以在35℃15 分鐘的條件下檢測(cè)ASFV。 此方法的最低檢出限為103copies/μl，根據(jù)反應(yīng)體系的顏色變化， 實(shí)驗(yàn)人員可以肉眼觀察結(jié)果，降低了對(duì)設(shè)備的要求。

結(jié)合了重組酶輔助擴(kuò)增（Recombinase-aided Amplification，RAA）技術(shù)和側(cè)向流試紙條的檢測(cè)方法可用于臨床樣本的快速檢測(cè)。 此種方法的基本原理是先利用RAA 技術(shù)擴(kuò)增樣品中的目的基因片段， 此過(guò)程中使用的一對(duì)引物在5’末端經(jīng)過(guò)特殊蛋白的標(biāo)記。 擴(kuò)增后的產(chǎn)物作為待檢樣品加入試紙條的樣品槽中， 樣品沿試紙條定向流動(dòng)， 經(jīng)過(guò)一個(gè)類似夾心ELISA 方法的反應(yīng)過(guò)程，產(chǎn)生最終結(jié)果。 此種方法適用于經(jīng)煮沸法提取核酸的豬血液樣本， 降低了對(duì)設(shè)備的需求，減少了工作時(shí)間，可用于臨床樣本的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、大批量樣本的初步篩查等。

借助CRISPR 技術(shù)開(kāi)發(fā)的ASF 診斷方法具有較高的靈敏度。 經(jīng)過(guò)CRISPR RNA 重新編程后，CRISPR-lwCas13a 可以特異性地結(jié)合靶RNA，之后lwCas13a 的側(cè)枝裂解功能被激活，進(jìn)而降解帶有標(biāo)記的RNA。 此方法理論上可檢出單拷貝的質(zhì)?；駻SFV 基因組DNA。 基于此方法研制的試紙條適用于檢測(cè)病毒載量較低的樣品，最低檢出限可達(dá)102copies/微升。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) （Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP） 是用于DNA 擴(kuò)增的單管技術(shù)， 使用兩套或三套引物和一種具有復(fù)制活性、高鏈置換活性珠聚合酶，可在15～60 分鐘，60℃～65℃的恒定溫度下擴(kuò)增靶序列，是一種更簡(jiǎn)便、快速、精確的擴(kuò)增方法。 該方法無(wú)需核酸提取，不依賴精密儀器，可避免因病毒的單個(gè)基因突變引起的假陰性問(wèn)題。

3 血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)

ELISA 方法適用于檢測(cè)樣品中的抗原或抗體，目前市場(chǎng)上已有針對(duì)ASFV 的商品化試劑盒可供選擇。 影響ELISA 實(shí)驗(yàn)效果的主要因素是包被的抗原或抗體，高特異性、互作效應(yīng)強(qiáng)、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的包被物可以提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確率和靈敏度。 目前，關(guān)于p30、p54 和p72 蛋白的相應(yīng)抗體檢測(cè)方法研究較多，但仍需要探索更多的ASFV抗原。

pB602L 作為一種晚期非結(jié)構(gòu)蛋白， 具有較強(qiáng)的抗原性， 可以使感染豬產(chǎn)生較高水平的抗體。 基于此蛋白建立的間接ELISA 方法可在稀釋6400 倍后的血清樣品中檢出ASFV 抗體，具有較高的靈敏度。 將重組結(jié)構(gòu)域缺失跨膜蛋白p22△TM 和p30 蛋白混合后作為抗原進(jìn)行包被， 由此建立的間接ELISA 方法具有較高的靈敏度和特異性。

一種通過(guò)納米等離子體生物傳感器建立的檢測(cè)方法可以快速檢測(cè)血清樣品中的p30 抗體。 此種方法是將納米金標(biāo)記在純化的p30 蛋白上，將蛋白與血清樣品混合后再滴加到96 孔板上，進(jìn)一步反應(yīng)后讀數(shù)分析。 與傳統(tǒng)ELISA 方法相比，此種方法不需要標(biāo)記抗體，因此拮抗劑和抗體的選擇范圍更廣。

P17 是一種位于ASFV 內(nèi)包膜上的跨膜蛋白， 對(duì)病毒膜前體向二十面體中間體的發(fā)展至關(guān)重要。 利用此蛋白建立的間接ELISA 方法可以檢測(cè)出1∶1280 稀釋后的ASFV 陽(yáng)性血清。

4 討論

本文對(duì)檢測(cè)ASFV 的基本檢測(cè)技術(shù)做了概述， 總結(jié)了一些新報(bào)道的具有不同特點(diǎn)的檢測(cè)技術(shù)。 目前較為常用的檢測(cè)方法仍是熒光PCR和ELISA，相應(yīng)的商品化試劑盒種類繁多，對(duì)操作人員的專業(yè)性要求也越來(lái)越低。 商品化試劑盒提高了檢測(cè)工作的效率， 但同時(shí)也在一定程度上阻礙了使用者對(duì)專業(yè)技術(shù)的深入了解。 便捷快速的試劑盒會(huì)讓操作人員不愿費(fèi)力了解實(shí)驗(yàn)技術(shù)的基本原理， 但實(shí)際上各種實(shí)驗(yàn)技術(shù)都有其優(yōu)勢(shì)和局限性。 例如，由于過(guò)長(zhǎng)的DNA 雙鏈本身會(huì)影響熒光信號(hào)的采集， 熒光PCR 要求靶序列的長(zhǎng)度盡可能短， 一般在50～150bp 之間。 這意味著熒光PCR 的產(chǎn)物可能不適用于測(cè)序分析，而常規(guī)PCR 則不受此限制，理論上可擴(kuò)增任意長(zhǎng)度的片段。 因此，時(shí)至今日，即使僅考慮病原檢測(cè)鑒定方面， 熒光PCR 技術(shù)仍不能完全取代常規(guī)PCR。

常用的各類檢測(cè)方法在靈敏度、特異性、檢測(cè)用時(shí)等方面各有特點(diǎn)，對(duì)于研發(fā)人員來(lái)說(shuō)，在開(kāi)發(fā)新的檢測(cè)方法時(shí)需要在各項(xiàng)指標(biāo)中尋找平衡點(diǎn)。 新的檢測(cè)方法往往比傳統(tǒng)方法具有一定的優(yōu)勢(shì)， 但從方法的提出到實(shí)際應(yīng)用仍需要很長(zhǎng)時(shí)間。