張華瑩，符樂(lè)，王曉芳，王亞文

（河北省畜牧獸醫(yī)研究所，河北保定 071000）

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒感染所有品種和年齡的野豬和家豬的病毒性疾病， 該病的特征是高燒、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)嚴(yán)重出血、高死亡率和高傳染性。 以感染豬發(fā)熱、精神抑郁、食欲不振、便血和鼻出血為主要臨床特征； 以患病豬全身組織器官?gòu)V泛性出血和脾臟發(fā)黑、 異常腫大為主要病理變化[1]。 1921 年，非洲肯尼亞首次發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟，隨后，全球多個(gè)國(guó)家報(bào)告了非洲豬瘟疫情。2018 年8 月，中國(guó)沈陽(yáng)市首次發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟，經(jīng)檢驗(yàn)并確定其流行毒株為基因II 型，與俄羅斯流行的毒株在同一分支[2]。 首次暴發(fā)以來(lái)，截止現(xiàn)在， 非洲豬瘟幾乎在我國(guó)所有省份和地區(qū)都有發(fā)生， 并對(duì)我國(guó)的畜牧業(yè)造成了不可挽回的損失。 據(jù)估計(jì)，2018 年至2019 年有超過(guò)3000 萬(wàn)頭生豬被撲殺， 給全球生豬生產(chǎn)造成了約20 億美元的經(jīng)濟(jì)損失，截止到2022 年，非洲豬瘟造成的損失約為550 億～1300 億美元。

雖然近年來(lái)，非洲豬瘟的流行趨勢(shì)平緩，但是散發(fā)和亞臨床感染情況仍然存在， 我國(guó)的防控形勢(shì)依然不容樂(lè)觀。 由于沒(méi)有特效藥物和疫苗，因此，科學(xué)有效的檢測(cè)和早期診斷對(duì)于疫情控制至關(guān)重要， 發(fā)現(xiàn)并立即撲殺感染豬以及執(zhí)行嚴(yán)格的生物安全措施是我國(guó)目前防控非洲豬瘟的主要措施。 非洲豬瘟的實(shí)驗(yàn)室診斷主要分為兩類，一類為病原學(xué)診斷，主要為病毒和病毒核酸的檢測(cè)方法；另一類為血清學(xué)診斷，主要為診斷機(jī)體因抗原刺激而產(chǎn)生的抗體或因病毒感染而產(chǎn)生的抗原。 在非洲豬瘟暴發(fā)初期，普遍采用PCR 等病原學(xué)檢測(cè)以確診病例[3]。非洲豬瘟的血清學(xué)診斷在疫情監(jiān)測(cè)中也起著關(guān)鍵作用，幾種包被p72、p54、p30、p12 等蛋白的ELISA 已被證實(shí)可用于非洲豬瘟的流行病學(xué)調(diào)查[4]。 但是當(dāng)血清保存不良或使用血液代替血清時(shí)， 這些ELISA 的敏感性可能會(huì)降低。在非洲豬瘟呈地方流行趨勢(shì)后，特別是弱毒株的出現(xiàn)，加大了非洲豬瘟病毒的檢測(cè)難度， 病原學(xué)和血清學(xué)診斷的結(jié)合應(yīng)用對(duì)可疑豬只、 隱性感染豬只的確診更加有利。 本文重點(diǎn)討論了非洲豬瘟實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)的研究進(jìn)展， 以期為非洲豬瘟的防控工作提供有價(jià)值的參考。

1 非洲豬瘟的病原學(xué)診斷

非洲豬瘟因其發(fā)病快、病程短、死亡率高，臨床表現(xiàn)和病理變化與經(jīng)典豬瘟和豬繁殖與呼吸綜合征等豬病相似，主要包括高熱、大面積出血、呼吸和生殖障礙等，使得這三種豬病的鑒別診斷非常困難， 需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)室診斷進(jìn)一步區(qū)分[5]。

1.1 病毒的分離與紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)

病毒的分離和紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)是非洲豬瘟活病毒檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。 該病毒既可以在原代細(xì)胞如：豬外周血單核細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞等中增值， 又可以在傳代細(xì)胞系中增殖。 有研究報(bào)道， 非洲豬瘟病毒在肺泡巨噬細(xì)胞中的易感性比外周血單核細(xì)胞高近5 倍。 此外，該病毒可在感染細(xì)胞中產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)和紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象[6]，這是非洲豬瘟病毒感染細(xì)胞特有的現(xiàn)象，其他豬病毒無(wú)法引起單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞吸附紅細(xì)胞， 因此紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)可用于非洲豬瘟的診斷。 野外采集樣本的質(zhì)量與病毒生存成正相關(guān)， 由于樣本質(zhì)量不佳導(dǎo)致病毒分離難度加大。 還有研究發(fā)現(xiàn)，有些毒株不產(chǎn)生紅細(xì)胞吸附但是可以產(chǎn)生細(xì)胞病變， 導(dǎo)致了出現(xiàn)假陰性的結(jié)果，同時(shí)紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)鑒定過(guò)程相對(duì)較長(zhǎng)，無(wú)法滿足臨床的快速診斷。

1.2 病毒核酸檢測(cè)

1.2.1 PCR 及qPCR 檢測(cè)

病毒核酸檢測(cè)是病毒檢測(cè)最常用的方法之一，具有特異性良好、靈敏度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。 非洲豬瘟核酸檢測(cè)方法主要包括PCR、熒光定量PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增。其中PCR 和熒光定量PCR 是實(shí)驗(yàn)室診斷最常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)， 后者的靈敏度更高，速度更快，應(yīng)用也更廣泛。 寶梅英[7]等通過(guò)增加探針內(nèi)標(biāo)物及優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了非洲豬瘟病毒雙重?zé)晒馓结楶CR 檢測(cè)方法，該方法最低每微升可檢測(cè)28 個(gè)拷貝，高于PCR 方法40 倍以上，重復(fù)性、穩(wěn)定性和特異性較好，不于其他病毒核酸交叉反應(yīng)。 王彩霞[8]等利用CD2v 基因建立了非洲豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)方法，通過(guò)條件的優(yōu)化，確定該方法的R2=0.988，最低每微升可檢測(cè)到10 個(gè)拷貝,且該方法的重復(fù)性和特異性良好， 不于其他豬病發(fā)生交叉反應(yīng)， 為非洲豬瘟病毒檢測(cè)提供了新的檢測(cè)技術(shù)。

1.2.2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增是一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，具有快速、簡(jiǎn)便和高特異性等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛地應(yīng)用于病原微生物檢測(cè)和傳染性疾病診斷等領(lǐng)域， 對(duì)于疫病的現(xiàn)場(chǎng)診斷具有非常重要的意義。 雖然世界動(dòng)物衛(wèi)生組織推薦的非洲豬瘟診斷方法是熒光定量PCR， 盡管該技術(shù)已經(jīng)被廣泛驗(yàn)證，并且是檢測(cè)病毒有用工具，但是由于昂貴的儀器和專業(yè)的操作系統(tǒng)，仍然不方便。 另外，還有研究學(xué)者利用p72 基因，設(shè)計(jì)了3 對(duì)擴(kuò)增引物和1 條環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增探針引物， 建立了非洲豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法，該方法的靈敏度高，并且該方法與OIE 推薦的PCR 方法進(jìn)行比較，符合率高度一致[9]。

1.2.3 熒光抗體試驗(yàn)

免疫熒光試驗(yàn)可分為直接免疫熒光法和間接免疫熒光法，該方法特異性強(qiáng)、敏感性高，相對(duì)于紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)，免疫熒光試驗(yàn)更加省時(shí)、方便， 并且可對(duì)不能產(chǎn)生紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象的非洲豬瘟病毒進(jìn)行診斷。 該方法被OIE 列為非洲豬瘟的輔助診斷方法， 用于其他檢測(cè)試驗(yàn)的補(bǔ)充。 免疫熒光試驗(yàn)需要用熒光素對(duì)特異性抗體進(jìn)行標(biāo)記，但對(duì)熒光素的特異性要求較高，非特異性的熒光素染色會(huì)造成陽(yáng)性檢出率增高；并且對(duì)于急性ASF 檢出率較高， 對(duì)于亞急性和慢性的檢出率較低。 此外，該試驗(yàn)對(duì)檢測(cè)人員有較高的技術(shù)要求，結(jié)果判定需要借助熒光顯微鏡，不適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

2 ASF 的血清學(xué)診斷

2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）主要是依靠包被的抗原或抗體， 抓取待檢樣本中的特異性抗原或抗體， 再與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗原或抗體結(jié)合成抗原抗體復(fù)合物， 最后使底物和酶發(fā)生顏色反應(yīng)， 通過(guò)測(cè)定吸光度值即可對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定。 根據(jù)檢測(cè)方法的不同可分為間接ELISA[4]、阻斷ELISA[10]和夾心ELISA[11]等。ELISA檢測(cè)抗原的方法相對(duì)于PCR 檢測(cè)方法， 其檢測(cè)成本更低、操作便捷、可同時(shí)檢測(cè)大批量樣本。但是與PCR 相比，ELISA 檢測(cè)抗原的方法，特異性較差、靈敏性稍低，易于出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果。如果待檢樣品保存不當(dāng)， 如保存溫度較高或保存時(shí)間較長(zhǎng)均會(huì)對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性造成影響。ELISA 抗體檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、 敏感性高、重復(fù)性好和檢測(cè)速度相對(duì)較快等優(yōu)點(diǎn)， 因此非常適用于 “群體” 檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查， 此外ELISA 也是OIE 推薦的首選血清學(xué)檢測(cè)方法。

張文燕[4]等以截短p72 基因作為包被抗原，建立了非洲豬瘟抗體檢測(cè)的間接ELISA 方法，經(jīng)過(guò)條件的優(yōu)化， 最終確立該方法的包被濃度為每毫升0.5 微克，最佳待檢測(cè)血清做1∶100 稀釋，HRP 標(biāo)記的二抗最佳稀釋倍數(shù)為1∶5000，該方法不于其他抗體發(fā)生反應(yīng)， 且該方法與蛋白質(zhì)印跡的檢出率一致， 證明了建立的該方法可在非洲豬瘟的臨床檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查用有極大的應(yīng)用潛力。

2.2 免疫膠體金技術(shù)

免疫膠體金技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型膜檢測(cè)技術(shù)。 膠體金標(biāo)記的特異性抗原或抗體在毛細(xì)作用下，可以在硝酸纖維素膜中移動(dòng)， 與相應(yīng)的抗體或抗原結(jié)合，從而使膠體金顆粒大量聚集，而呈現(xiàn)出顯色反應(yīng)。 隨著各類新技術(shù)的發(fā)展，免疫膠體金技術(shù)也在不斷更新?lián)Q代，因其操作方法簡(jiǎn)便，不需要專業(yè)設(shè)備和人員進(jìn)行操作、快速、便宜且測(cè)試結(jié)果明確等特點(diǎn)在非洲豬瘟的檢測(cè)中有廣大的前景。張?chǎng)斡頪12]等建立了非洲豬瘟p54 抗體檢測(cè)膠體金方法，該方法的靈敏度較高、反應(yīng)時(shí)間較短（10 分鐘內(nèi)）。 張麗[13]等通過(guò)原核表達(dá)、純化獲得了非洲豬瘟病毒p54 蛋白， 制備了膠體金檢測(cè)試紙條， 與西班牙INGENASA 公司的試紙條的檢測(cè)限敏感性高10 倍。

2.3 化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)

化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)是基于抗原、抗體免疫反應(yīng)的原理， 結(jié)合化學(xué)發(fā)光而建立的一種免疫分析技術(shù)。 化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)是以化學(xué)發(fā)光作為指示系統(tǒng)， 使用相關(guān)的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記特異性抗體或抗原， 與待檢樣本特異性結(jié)合，再加入能使發(fā)光物發(fā)光的物質(zhì)，根據(jù)發(fā)光物發(fā)射光的信號(hào)強(qiáng)弱判定待檢樣本的濃度[14]。化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)具有靈敏度高、檢測(cè)范圍廣、反應(yīng)速度快、分析時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。 憑借其高靈敏度和特異性， 不斷促進(jìn)對(duì)科學(xué)技術(shù)和研究領(lǐng)域的新理解。 現(xiàn)如今，該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到疫病的臨床診斷中，

3 其他檢測(cè)技術(shù)

非洲豬瘟因發(fā)病快、傳播廣等特點(diǎn)，已成為當(dāng)今養(yǎng)豬業(yè)的首號(hào)威脅者，因此，建立特異、便捷、 快速的檢測(cè)方法對(duì)于非洲豬瘟的防控工作至關(guān)重要。 該病毒檢測(cè)技術(shù)的研究，可以為不同地區(qū)在特定非洲豬瘟疫情流行背景下選擇合適的診斷試劑提供參考， 促使各個(gè)領(lǐng)域的檢測(cè)技術(shù)迅速進(jìn)入動(dòng)物醫(yī)學(xué)行業(yè)。謝青云[15]等為了建立快速、敏感的現(xiàn)場(chǎng)診斷檢測(cè)方法，制備了基于量子點(diǎn)微球偶聯(lián)非洲豬瘟p30 蛋白的檢測(cè)用探針， 和量子點(diǎn)微球偶聯(lián)的兔抗雞的IgY 質(zhì)控探針，建立量子點(diǎn)免疫試紙條，該試紙條以豬的咽拭子為檢測(cè)對(duì)象，待檢液做2 倍稀釋，該方法的敏感性較好，且不于其他豬病交叉反應(yīng)，20 分鐘內(nèi)即可完成檢測(cè)，最早可在感染后6 天檢測(cè)出，為非洲豬瘟的早起診斷提供技術(shù)支持。 另外，岳懷寧[16]等建立了非洲豬瘟重組酶輔助擴(kuò)增和膠體金試紙條相結(jié)合的可視化檢測(cè)方法， 該方法通過(guò)反應(yīng)條件的優(yōu)化，確定在38℃下反應(yīng)20 分鐘即可完成該病的核酸檢測(cè)， 并且不與其他豬病發(fā)生交叉反應(yīng)，最低可檢測(cè)到48.75 個(gè)拷貝的病毒核酸，該方法操作便捷，反應(yīng)時(shí)間短，極適合非洲豬瘟的臨床快速診斷。

4 總結(jié)與展望

近期研究報(bào)道， 在中國(guó)豬體內(nèi)檢測(cè)到自然發(fā)生的基因I 型和基因II 型非洲豬瘟重組體，動(dòng)物試驗(yàn)也表明了， 這些病毒具有高度致命性和傳染性， 且以基因Ⅱ型病毒為基礎(chǔ)的減毒活疫苗不能對(duì)這些重組病毒提供保護(hù)， 非洲豬瘟對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成的危害進(jìn)一步增大，所以，檢測(cè)方法的研究對(duì)于非洲豬瘟病毒早期診斷至關(guān)重要。

PCR、 膠體金試紙條、ELISA 等檢測(cè)方法雖然方便、快捷，但是不同檢測(cè)方法的靈敏度和特異性不同。 國(guó)內(nèi)外多位研究學(xué)者報(bào)道了ASF 的檢測(cè)方法，可以對(duì)該病進(jìn)行有效的鑒別診斷，但是其中多數(shù)檢測(cè)方法屬于基礎(chǔ)性研究， 缺乏大量的臨床樣本應(yīng)用， 甚至有的檢測(cè)方法對(duì)檢測(cè)環(huán)境或檢測(cè)儀器設(shè)備有較高的要求， 很難在實(shí)際應(yīng)用中有效推廣。PCR 及qPCR 檢測(cè)方法需要對(duì)樣本進(jìn)行前處理才能進(jìn)行核酸提取和擴(kuò)增，整個(gè)流程時(shí)間較長(zhǎng)、 核酸提取和擴(kuò)增相關(guān)儀器價(jià)格昂貴，適合實(shí)驗(yàn)室診斷，不利于現(xiàn)場(chǎng)快速診斷。 ELISA 檢測(cè)技術(shù)需要儀器設(shè)備相對(duì)較少，檢測(cè)時(shí)間短， 一次可檢測(cè)大量樣本， 適合群體檢測(cè)。 但是，因?yàn)榭贵w產(chǎn)生的時(shí)間不同，很難通過(guò)抗體檢測(cè)篩查處于潛伏期的豬只。 膠體金試紙條檢測(cè)時(shí)間短，適合用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，但其敏感性和特異性還需要繼續(xù)優(yōu)化。

本文總結(jié)了非洲豬瘟不同檢測(cè)方法， 并對(duì)各檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)和不足進(jìn)行了總結(jié)。 針對(duì)這些存在的問(wèn)題，未來(lái)的研究應(yīng)集中于低成本、工業(yè)化、高通量、高性能等方向，分子學(xué)檢測(cè)方法在提高該病的檢測(cè)性能方面十分有效， 將分子學(xué)檢測(cè)方法與目前免疫學(xué)方法等相結(jié)合可以降低成本、提高檢測(cè)通量和靈敏度。 隨著非洲豬瘟不斷傳播及不同毒株的重組， 使得該病毒的危害不斷增強(qiáng)，因此，迫切需要開(kāi)發(fā)出敏感性高、特異性好，并且適合現(xiàn)場(chǎng)快速診斷檢測(cè)方法。

（基金項(xiàng)目： 河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系奶/肉牛綜合試驗(yàn)推廣站（HBCT2023180406）；河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)保定綜合試驗(yàn)推廣站（HBCT2023170404））