張 雪，佟玉良，夏天利，左 坤，于 浩，王 迪，張 寧，趙繼會，雷 霞

（1.佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007； 2.無錫市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇省中醫(yī)退行性骨關(guān)節(jié)病臨床醫(yī)學(xué)創(chuàng)新中心，江蘇 無錫 214071； 3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040； 4.湖南醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，湖南 懷化 418000）

六味地黃丸為滋陰補腎經(jīng)典名方，其中熟地黃、山茱萸、山藥為三補組分，有腎、肝、脾三臟同補的功效； 牡丹皮、茯苓、澤瀉為三瀉組分，有降相火、利水滲濕的功效［1］。前期報道，熟地黃成分以環(huán)烯醚萜苷類為主［2］，山茱萸成分以環(huán)烯醚萜類、多酚類為主［3］，山藥成分以甾體皂苷類、呋喃甾烷類為主［4］，茯苓成分以多糖類、萜類為主［5］，澤瀉成分以萜類為主［6］，牡丹皮成分以黃酮類、酚類、糖類為主［7］。臨床研究表明，六味地黃丸改善老年人學(xué)習(xí)記憶能力、抑郁障礙、焦慮障礙等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的效果良好［8］，并且近年來課題組開展了關(guān)于其增強學(xué)習(xí)記憶功能、減輕情感障礙方面的研究［9］。

由于藥物通過吸收入血進行體內(nèi)分布，大部分在到達靶器官后發(fā)揮藥效，故鑒定六味地黃丸入腦成分對確定其防治神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)至關(guān)重要。本實驗采用超高效液相色譜-線性離子阱/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜 （UPLC-LTQ-Orbitrap-MS） 法，對六味地黃丸給藥后吸收成分進行快速鑒定，并通過分析入血成分來確定入腦成分，以期為該制劑藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 SPF 級健康SD 大鼠12 只，雄性，3 ～4 月齡，體質(zhì)量（230±20） g，購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（遼） 2020-0001，無菌環(huán)境飼養(yǎng)，溫度 （21 ±1）℃，相對濕度（60±5）%，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，自由進食飲水。操作流程均符合實驗動物管理、保護的相關(guān)規(guī)定。

1.2 試劑與藥物 六味地黃丸（濃縮丸，北京同仁堂藥店佳木斯店）。甲醇為色譜純（北京迪馬歐泰科技發(fā)展中心）； 乙腈為色譜純（美國賽默飛世爾科技公司）； 甲酸為色譜純（美國Tedia 公司）。

1.3 儀器 UltiMate 3000 超高液相色譜儀、LTQOrbitrap 質(zhì)譜儀 （美國賽默飛世爾科技公司）；Milli-Q 純水器［密理博（上海） 貿(mào)易有限公司］；Mikro 200R 離心機（德國Hettich 公司）

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 藥液 取本品適量，研細，精密稱取5.45 g，超聲處理1 h，攪拌均勻，即得。

2.1.2 供試品溶液 取本品適量，研細，精密稱取0.500 g，加入50% 甲醇25 mL，加熱回流1 h，在-20 ℃下保存，使用時取0.5 mL，置于5 mL 量瓶中，70%甲醇定容，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.2 血漿、腦脊液采集 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后隨機分為空白組、給藥組，每組6 只，實驗前12 h禁食不禁水，空白組大鼠灌胃給予2 mL 雙蒸水，給藥組大鼠灌胃給予等量“2.1.1” 項下藥液，于0.5、1、1.5、2 h 眼框取血，置于肝素鈉離心管中，4 ℃、21.382×g離心10 min，取上層血漿，在-80 ℃下保存。取血后將大鼠頭部固定，輸液針從皮膚穿入，抵達小腦延髓池抽取腦脊液，4 ℃、21.382×g離心10 min，取上層清液，在-80 ℃下保存。

2.3 樣品處理

2.3.1 血漿 取空白、含藥血漿各300 μL，置于離心管中，加入2 mL 甲醇，30 μL 乙酸渦旋混合1 min，超聲處理1 min，4 ℃、21.382×g離心10 min，取上清液，氮吹后用150 μL 70% 甲醇復(fù)溶，過0.22 μm 微孔濾膜。

2.3.2 腦脊液 取空白、含藥腦脊液各200 μL，置于離心管中，加入800 μL 甲醇，按 “2.3.1”項下方法處理。

2.4 UPLC-LTQ-Orbitrap-MS 分析條件 同文獻［9-10］ 報道。

2.5 數(shù)據(jù)處理 采用Thermo Scientific Xcalibur 軟件。

3 結(jié)果

根據(jù)色譜保留時間、分子碎片峰、數(shù)據(jù)庫，將二級質(zhì)譜裂解碎片離子信息結(jié)合相關(guān)文獻進行比對，最終鑒定出38 種入血成分，包括環(huán)烯醚萜苷類、有機酸類、萜類、揮發(fā)油類、苯丙素類、苯丙胺類、呋喃類、酚酸類、糖苷類、酯類、酚類、其他類，其中29 種為原型成分，9 種為其代謝產(chǎn)物；鑒定出10 種原型入腦成分，其中沒食子酸、阿魏酸、5-羥甲基糠醛、原兒茶醛、纈草素、咖啡酸是首次發(fā)現(xiàn)，具體見圖1～4、表1～2。

表1 六味地黃丸入血、入腦成分鑒定結(jié)果Tab.1 Results of components migrating to blood and brain identification in Liuwei Dihuang Pills

圖1 六味地黃丸入血成分UPLC-LTQ-Orbitrap-MS總離子流圖Fig.1 UPLC-LTQ-Orbitrap-MS total ion current chromatograms of components migrating to blood in Liuwei Dihuang Pills

圖2 六味地黃丸入腦成分UPLC-LTQ-Orbitrap-MS總離子流圖Fig.2 UPLC-LTQ-Orbitrap-MS total ion current chromatograms of components migrating to brain in Liuwei Dihuang Pills

圖3 六味地黃丸入血、入腦成分提取離子流圖（正離子模式）Fig.3 Extracted ion current chromatogram of components migrating to blood and brain in Liuwei Dihuang Pills （positive ion mode）

圖4 六味地黃丸入血、入腦成分提取離子流圖（負(fù)離子模式）Fig.4 Extracted ion current chromatogram of components migrating to blood and brain in Liuwei Dihuang Pills （negative ion mode）

3.1 入血、入腦成分質(zhì)譜裂解分析

3.1.1 有機酸類 該類化合物在質(zhì)譜中容易丟失CO、CO2、-COOH、H2O 等，產(chǎn)生碎片離子峰。以化合物29 為例，在保留時間2.56 min （負(fù)離子模式） 處準(zhǔn)分子離子峰為m/z179.035 0 ［M-H］-，推測其分子式為C9H8O4； 二級質(zhì)譜中m/z107.83處可見碎片離子［M-H-CO2-CO］-，與數(shù)據(jù)庫、文獻［11］ 比對后確定為咖啡酸，二級碎片離子圖見圖5。

圖5 咖啡酸二級碎片離子圖Fig.5 Secondary fragment ion diagram for caffeic acid

3.1.2 環(huán)烯醚萜苷類 該類化合物是由單萜與糖結(jié)合成的糖苷，其糖苷鍵易斷裂，得到丟失一分子或幾分子糖的碎片離子，由于其結(jié)構(gòu)中常存在羥基，導(dǎo)致容易中性丟失H2O，產(chǎn)生質(zhì)量損失18 Da的碎片離子。以化合物25 為例，在保留時間4.82 min （負(fù)離子模式） 處，準(zhǔn)分子離子峰為m/z375.129 7 ［M-H］-，推測其分子式為C16H24O10；在高能碰撞離子作用下，主要二級碎片離子為m/z213.08 ［M-H-C6H10O5］-、169.08 ［M-H-C6H10O5-CO2］-、113.02 ［M-H-C10H14O5-H2O-CH2O］-，與數(shù)據(jù)庫、文獻［11］ 比對后確定為馬錢苷酸，二級碎片離子圖見圖6。

圖6 馬錢苷酸二級碎片離子圖Fig.6 Secondary fragment ion diagram for loganic acid

3.1.3 其他類 以化合物8 為例，在保留時間2.13 min （正離子模式） 處，準(zhǔn)分子離子峰為m/z127.039 0 ［M+H］+，推測其分子式為C6H6O3； 二級質(zhì)譜中依次失去H2O、CO，形成碎片離子m/z109.04 ［M+H-H2O］+、81.05 ［M+H-H2O-CO］+，與數(shù)據(jù)庫、文獻［10］ 比對后確定為5-羥甲基糠醛，二級碎片離子圖見圖7。

圖7 5-羥甲基糠醛二級碎片離子圖Fig.7 Secondary fragment ion diagram for 5-hydroxymethylfurfural

3.2 代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定 表2 顯示，大鼠血漿中鑒定出丹皮酚代謝產(chǎn)物2 個［12］，分別為硫酸化、羥基化； 沒食子酸代謝產(chǎn)物3 個［13］，分別為甲基化、葡萄糖醛酸化、硫酸酯化； 咖啡酸代謝產(chǎn)物2個［14］，分別為硫酸酯化、一分子葡萄糖醛酸結(jié)合；阿魏酸代謝產(chǎn)物2 個［14］，分別為硫酸酯化、一分子葡萄糖醛酸結(jié)合［13］。

表2 丹皮酚、沒食子酸、咖啡酸、阿魏酸在大鼠血漿中的代謝產(chǎn)物Tab.2 Metabolites of paeonol，gallic acid，caffeic acid and ferulic acid in rat plasma

4 討論與結(jié)論

雖然關(guān)于六味地黃丸及其體內(nèi)化學(xué)成分的分析已有許多報道［15-17］，但由于儀器的局限性或數(shù)據(jù)庫的不足，相關(guān)研究仍不夠深入。課題組前期從六味地黃丸給藥后大鼠血漿中鑒定出21 種入血成分，腦脊液中鑒定出4 種入腦成分［9］，但尚不全面，也未關(guān)注其體內(nèi)代謝情況。本實驗設(shè)計了4 個采血時間點，并根據(jù)UPLC-LTQ-Orbitrap-MS 的高效分離優(yōu)勢，所鑒定到的入腦原型成分增加了6 種。

六味地黃丸入腦、入血成分，甚至代謝產(chǎn)物都有可能是其活性化合物，也是其抗神經(jīng)損傷的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。前期報道，沒食子酸具有神經(jīng)保護作用，其作用機制可能是激活Nrf2/HO-1 通路，從而減輕氧化應(yīng)激對神經(jīng)元的損傷［18］； 阿魏酸可減輕氨基酸所致的神經(jīng)元損傷，發(fā)揮神經(jīng)元保護作用；咖啡酸對慢性鋁過負(fù)荷大鼠腦損傷有明顯的神經(jīng)保護作用，其機制可能與抑制5-LO、減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥和氧化應(yīng)激有關(guān)［19］； 纈草素可明顯降低大鼠血清皮質(zhì)酮的含量，其抗焦慮作用可能是通過調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺軸功能來實現(xiàn)的［20］； 原兒茶醛通過PLK2/p-GSK3β/Nrf2 途徑，從而對帕金森病具有治療作用［21］； 5-羥甲基糠醛可改善學(xué)習(xí)記憶能力，可能是通過提高其腦組織抗氧化酶SOD 活性、降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)實現(xiàn)的［22］； 5-羥甲基糠醛通過上調(diào)GCR 蛋白表達，上調(diào)了其下游蛋白BDNF、SGK 表達，調(diào)節(jié)P-synapsinⅠ蛋白表達，從而在延緩學(xué)習(xí)記憶功能退化中發(fā)揮作用［23］。因此，抑制神經(jīng)元凋亡、減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥和氧化應(yīng)激可能是六味地黃丸主要作用機制。

綜上所述，本實驗采用UPLC-LTQ-Orbitrap-MS法對六味地黃丸入血、入腦成分進行分析，共鑒定出38 種入血成分，其中29 種為原型，9 種為代謝產(chǎn)物，同時還鑒定出10 種原型入腦成分，可為該制劑后續(xù)質(zhì)量控制、藥效機制探索提供依據(jù)。