房文文，王海鳳，郭濤，姜艷芳，薛芳，張煥霞，張士永

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院濕地農(nóng)業(yè)與生態(tài)研究所/山東省水稻工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250100)

水稻是世界上的主糧作物之一，近一半的人口以稻米為主食[1-2]。 稻瘟病是水稻生產(chǎn)上最重要的病害，嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量和品質(zhì)[3-4]。 山東省一般5 年左右會(huì)暴發(fā)一次，發(fā)病田塊一般減產(chǎn)10%～30%，嚴(yán)重的甚至超過(guò)50%[5]。 山東屬黃淮海稻區(qū)，以粳稻為主，年均種植面積達(dá)13 萬(wàn)公頃[6]。 稻瘟病的發(fā)病條件為氣溫26 ～28 ℃、相對(duì)濕度90%以上，臨沂、日照等稻區(qū)水稻抽穗灌漿期的氣候特點(diǎn)符合其發(fā)生流行的條件，是山東省稻瘟病發(fā)生較重的地區(qū)[7]。 目前，選育和合理種植抗病品種是控制稻瘟病流行最經(jīng)濟(jì)有效的途徑[8-9]。 由于田間稻瘟病菌小種類型多樣，易發(fā)生變異，一些抗病水稻品種連續(xù)種植3 ～5 年后抗性就會(huì)喪失，田間表現(xiàn)為感病，從而造成減產(chǎn)[10]。

隨著水稻基因組學(xué)和測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，越來(lái)越多的抗稻瘟病基因被定位與克隆，目前已被定位的抗瘟基因有100 多個(gè)，已克隆的抗瘟基因超過(guò)30 個(gè)[11]。 抗瘟基因多為顯性基因，其作用方式多為通過(guò)與核苷酸結(jié)合位點(diǎn)-富含亮氨酸重復(fù)序列蛋白(NBS-LRR)結(jié)合，從而使病原菌失去侵染性[12-13]。 近年來(lái)，抗瘟基因分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)，主要為SSR、Indel、SNP 標(biāo)記，為高效檢測(cè)抗瘟基因奠定了基礎(chǔ)[14-16]。 張亞玲等利用35 個(gè)抗瘟基因標(biāo)記檢測(cè)了黑龍江省50 個(gè)水稻主栽品種，發(fā)現(xiàn)抗瘟基因Pish、Pi36、Pi33和Pi-CO39在供試品種中的出現(xiàn)頻率為100%，Pi63、Ptr、Pi37、Pi64、pi21、Pi9、Pi54、Pia、Pikp、Pi35、Pikm和Pik的出現(xiàn)頻率為50%～100%，Pita、Pib、Pii、Pi5、Piz-t、Pi50和Pi2的出現(xiàn)頻率為10%～50%，Pid2僅在2個(gè)品種中被檢測(cè)到，Pigm僅在1 個(gè)品種中被檢測(cè)到，而Pit、Pid3、Bsr-d1、Pi25、Pid3-A4、Pi56、Pi1、Pike和Pb1在供試品種中未檢測(cè)到[17]；楊林浩等利用一套稻瘟病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和特異性分子標(biāo)記相結(jié)合，檢測(cè)了吉林省68 個(gè)主栽水稻品種，發(fā)現(xiàn)Pita、Pia、Pish、Pita2、Pib和Pi9為吉林省主栽品種中出現(xiàn)頻率較高的抗瘟基因，推測(cè)所有品種可能不含有Pi2、Pi54、Pikm、Pi11和Pi12基因[18]。

山東省作為重要的粳稻產(chǎn)區(qū)，有著豐富的地方品種資源，但有關(guān)這些品種資源的抗瘟基因分布未見(jiàn)報(bào)道。 本研究利用Pita、Pita2、Pia、Pi9、Pigm、Pikm、Pi54、Pi5、Pii、Pib、Pish、Pi1共12 個(gè)抗瘟基因的分子標(biāo)記對(duì)78 個(gè)山東省地方品種進(jìn)行抗瘟基因檢測(cè)，以初步明確這些品種的抗瘟基因組成，為今后進(jìn)一步挖掘和利用抗瘟基因、培育持久廣譜抗瘟品種提供基因信息和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為78 個(gè)山東省地方水稻品種，見(jiàn)表1，均由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院濕地農(nóng)業(yè)與生態(tài)研究所種質(zhì)資源團(tuán)隊(duì)收集和保存，均以常規(guī)方法栽培。

表1 供試山東省地方水稻品種

試劑及儀器: 十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司；PCR 試劑，北京全式金生物技術(shù)(TransGen Biotech) 有限公司產(chǎn)品；EvaGreenqPCR 核酸染料，美國(guó)Biotium 公司產(chǎn)品。 SPX 智能型生化培養(yǎng)箱、RXZ-500C-LED 人工氣候培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠產(chǎn)品；BCD-290W 型立式冰箱，青島海爾股份有限公司產(chǎn)品；羅氏LightCycler96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，Roche 公司產(chǎn)品。

1.2 水稻DNA 提取

剪取3 段供試水稻品種的葉片(大小為2 mm×2 mm)于2 mL 離心管中，采用CTAB 法提取DNA。具體步驟如下:

(1)向裝有供試水稻葉片的離心管中加600 μL 65 ℃預(yù)熱的2×CTAB，然后65 ℃溫浴30 min；

(2)冷卻后加600 μL 氯仿-異戊醇溶液(氯仿和異戊醇體積比為1∶1)混勻，12 000 r/min 離心10 min，吸200 μL 上清液，加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻后于-20 ℃條件下沉淀30 min；

(3)12 000 r/min、4 ℃條件下離心15 min，棄上清液，加入600 μL 體積百分含量為70%的乙醇洗滌沉淀1～2 次，放入通風(fēng)櫥內(nèi)吹干；

(4)加入100 μL TE(10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA，pH 8.0)溶解DNA，使用核酸定量?jī)x測(cè)量DNA 濃度，并將濃度調(diào)整為約10 ng/μL，-20℃保存待測(cè)DNA。

1.3 抗瘟基因分子標(biāo)記

本研究選用抗瘟基因Pita、Pi9、Pikm、Pigm、Pia、Pi54、Pish、Pii、Pi1、Pib、Pita2、Pi5的分子標(biāo)記進(jìn)行試驗(yàn)，其PCR 特異性引物信息見(jiàn)表2。 所有引物均由華大基因有限公司合成。

表2 抗瘟基因的特異性引物

1.4 PCR 擴(kuò)增

熒光PCR 反應(yīng)體系:10×Taqbuffer(含20 mmol/L Mg2+)1 μL，250 μmol/L dNTP 0.2 μL，0.5 UTaqDNA Polymerase 0. 1 μL，20 × Evagreen 0.125 μL，10 ng/μL DNA 模板3 μL，0.1 mmol/L正、反向引物各0.2 μL，用ddH2O 定容至10 μL。熒光PCR 擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40 個(gè)循環(huán)。

普通PCR 反應(yīng)體系:2× ESTaqMaster Mix(Dye)7.5 μL，水稻DNA 3.0 μL，正、反向引物各0.5 μL，3.5 μL ddH2O。 PCR 反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ～60 ℃退火30 s(根據(jù)梯度PCR 的結(jié)果選擇最佳退火溫度)，72 ℃延伸0.5～1.5 min(由擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度決定)，32 次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.5 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

抗瘟基因Pish、Pii、Pib、Pita2、Pi5的擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，150 V 穩(wěn)壓電泳30 min，然后在凝膠成像系統(tǒng)中拍照。

1.6 HRM 檢測(cè)

抗瘟基因Pita、Pi9、Pikm、Pigm、Pia、Pi54、Pi1的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)熔解曲線(HRM)檢測(cè)。 分析程序:95 ℃變性15 s；60 ℃退火15 s；以0.07 ℃/s的速率升溫，10 reading/℃采集熒光信號(hào)，至90℃保持1 s，采用Light Cycler 96 software 軟件進(jìn)行熔解曲線分析。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和作圖。 采用NTSYS 2.10 軟件計(jì)算78 個(gè)品種間的遺傳相似系數(shù)，然后利用非加權(quán)類平均法(UPGMA)對(duì)遺傳相似系數(shù)進(jìn)行聚類分析，得到聚類樹(shù)形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻瘟病抗性基因的分子標(biāo)記檢測(cè)及在品種中的分布

本研究利用Pita、Pita2、Pia、Pi9、Pigm、Pikm、Pi54、Pi5、Pii、Pib、Pish和Pi1的功能標(biāo)記對(duì)78個(gè)山東省地方水稻品種進(jìn)行分子檢測(cè)，結(jié)果(表3)發(fā)現(xiàn)，有53 個(gè)品種含有Pi54，有39 個(gè)品種含有Pia，有23 個(gè)品種含有Pi5，有17 個(gè)品種含有Pikm，有16 個(gè)品種含有Pib和Pii，有13 個(gè)品種含有Pi1，有1 個(gè)品種含有Pi9、Pish和Pita2，所有品種中均未檢測(cè)到Pita和Pigm。 部分基因分子標(biāo)記的檢測(cè)結(jié)果如圖1、圖2 所示。

圖1 高分辨率熔解曲線檢測(cè)地方水稻品種的抗瘟基因

圖2 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)地方水稻品種的抗瘟基因Pi54、Pib、Pii

表3 山東省地方水稻品種抗瘟基因檢測(cè)結(jié)果

Pi54和Pia在供試品種中的分布頻率最高，分別高達(dá)67.95%和50.0%；其次是Pi5、Pikm、Pib、Pii和Pi1，分布頻率分別為29.49%、21.79%、20.51%、20.51%和16.67%；分布頻率較低的是Pi9、Pish和Pita2，均為1.28%；檢測(cè)品種中都不含有抗性基因Pita和Pigm(表3、圖3)。

圖3 12 個(gè)抗稻瘟病基因在山東省地方水稻品種中的分布頻率

2.2 不同地方水稻品種含抗瘟基因的數(shù)量分析

由表3 和圖4 可知，竹稈青-1、竹稈青-2、塘稻、明水米旱稻-1、明水香稻、紫稈旱稻等27 個(gè)品種檢測(cè)出2 個(gè)抗瘟基因，占檢測(cè)品種總數(shù)的34.62%，其中，有23 個(gè)品種檢出Pi54，有15 個(gè)品種檢出了Pia。 小黃稻、大青秸-3、小紅芒、旱稻子、秋白水稻、蔣莊1 號(hào)等19 個(gè)品種檢測(cè)出1 個(gè)抗瘟基因，占檢測(cè)品種總數(shù)的24.36%，其中，有8個(gè)品種檢測(cè)出Pi54。 粘旱稻-1、秋旱稻、高秸水旱稻-2、蓬萊稻-3、香稻、郯城野生稻等13 個(gè)品種檢測(cè)出3 個(gè)抗瘟基因，占檢測(cè)品種總數(shù)的16.67%。 另外，紫皮旱稻、水牛皮旱稻-1、青旱稻、蓬萊稻-1、葫蘆香稻等7 個(gè)品種檢測(cè)出4 個(gè)抗瘟基因，鐵耙子、八月芒、樂(lè)陵旱稻、短頂芒白米4 個(gè)品種檢測(cè)出5 個(gè)抗瘟基因，僅禿頭紅米稻檢測(cè)出6 個(gè)抗瘟基因，紅皮高麗旱稻-1、粘稻2 個(gè)品種檢測(cè)出7 個(gè)抗瘟基因。 而大青秸-1、汪稻、水牛皮旱稻-1、老旱稻-2、旱粘稻-2 共5 個(gè)品種未檢測(cè)到12 個(gè)抗瘟基因中的任何一個(gè)。

圖4 山東省地方水稻品種含抗瘟基因數(shù)統(tǒng)計(jì)

2.3 山東省地方水稻品種的聚類分析

基于遺傳相似系數(shù)，利用UPGMA 法對(duì)78 個(gè)山東省地方水稻品種進(jìn)行聚類分析，結(jié)果(圖5)顯示，在遺傳相似系數(shù)0.80 處，可將78 個(gè)供試材料分為四類。 第一類包括大青秸-1、汪稻及水牛皮旱稻-1 共3 個(gè)品種；第二類僅有高秸水旱稻-1；第三類包括大青秸-3、紫穎稻、粘旱稻-2 及白芒子共4 個(gè)品種；其余70 個(gè)品種均聚在第四類中。

圖5 78 個(gè)山東省地方水稻品種的聚類分析結(jié)果

3 討論與結(jié)論

水稻與稻瘟病菌存在協(xié)同進(jìn)化關(guān)系，一個(gè)抗病新品種在生產(chǎn)上使用幾年后，由于稻瘟菌變異而突破水稻的防御機(jī)制，使抗病品種的抗病能力下降甚至喪失，變?yōu)楦胁∑贩N。 因此，在改良水稻品種的稻瘟病抗性時(shí)，要首先弄清品種中的抗瘟基因(組合)，從而更好地利用不同的抗瘟基因組合對(duì)品種進(jìn)行改良。 有關(guān)我國(guó)現(xiàn)有水稻品種中抗瘟基因的分布情況，前人已進(jìn)行過(guò)一些研究，如豈長(zhǎng)燕等研究了抗瘟基因Pib、Pita、Pi5、Pi25和Pi54在我國(guó)124 份水稻微核心種質(zhì)中的分布[19]；范方軍等研究了Pib、Pita、Pi54和Pikm在江蘇省遲熟中粳稻預(yù)試64 份品系中的分布[20]。 本研究利用12 個(gè)抗瘟基因(Pita、Pita2、Pia、Pi9、Pigm、Pikm、Pi54、Pi5、Pii、Pib、Pish、Pi1)的分子功能標(biāo)記檢測(cè)了78 個(gè)山東地方水稻品種的抗瘟基因分布情況，結(jié)果表明，除Pita、Pigm未檢測(cè)到外，其余10 個(gè)基因均能在山東省地方水稻品種中檢測(cè)到。 其中，Pi54和Pia在供試品種中的分布頻率較高，達(dá)67.95%和50.0%；其次是Pi5、Pikm、Pib、Pii和Pi1，分布頻率分別為29.49%、21.79%、20.51%、20.51%和16.67%；Pi9、Pish、Pita2的分布頻率較低，僅為1.28%。 各品種含有抗瘟基因的數(shù)量為1～7 個(gè)不等，抗瘟基因組合種類豐富。

目前，培育持久廣譜抗病品種和合理布局抗病品種仍是控制稻瘟病最經(jīng)濟(jì)有效的途徑，而挖掘種質(zhì)資源中的抗瘟基因是重要基礎(chǔ)。 本研究結(jié)合山東省稻瘟病菌群體生理小種的變異動(dòng)態(tài)，挑選出可進(jìn)一步利用的抗瘟基因Pi54、Pia、Pi5、Pikm、Pib和Pii，下一步可作為目的基因利用到主栽品種中，這為育種家培育抗稻瘟病新品種提供了數(shù)據(jù)支持，助力了培育持久和廣譜抗稻瘟病水稻新品種。 但需注意有些抗瘟基因與不良性狀的“連鎖累贅”效應(yīng)，如Pigm與小粒性狀連鎖，以避免在提高抗病性的同時(shí)負(fù)向影響產(chǎn)量或品質(zhì)。

本研究?jī)H檢測(cè)了12 個(gè)抗瘟基因在78 個(gè)山東省地方水稻品種中的分布情況，但其他抗瘟基因的分布情況還有待進(jìn)一步研究；另外，地方品種中抗瘟基因數(shù)量與水稻品種稻瘟病抗性頻率間的關(guān)系也有待進(jìn)一步研究。