曾堅(jiān)，周潔薇，王舒婷，胡偉

(1. 韶關(guān)學(xué)院廣東省粵北食藥資源利用與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005；2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南 海口 571101)

脫落酸(abscisic acid，ABA)屬于六種植物激素之一，1963 年首次在脫落果實(shí)中被鑒定為生長抑制劑[1]，隨后發(fā)現(xiàn)其在種子休眠、萌發(fā)、氣孔開合、果實(shí)發(fā)育等多種生理過程中發(fā)揮著重要作用[2-4]，在水楊酸介導(dǎo)的生物脅迫以及高鹽、干旱和寒冷等非生物脅迫中也起著關(guān)鍵作用[3，5]。ABA 的代謝過程已有相關(guān)研究綜述進(jìn)行了詳細(xì)總結(jié)[6]。 ABA 合成過程主要涉及玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶(zeaxanthin epoxidase，ZEP)、9-順環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenases，NCEDs)、短鏈醇脫氫酶/還原酶(short-chain dehydrogenases/reductases，SDR)、ABA 醛氧化酶(abscisic aldehyde oxidase，AAO)[7]，其中AAO 參與ABA 合成途徑中的最后一步。 雖然ABA 合成相關(guān)基因的研究比較多[8]，但關(guān)于AAO基因的研究較少，目前只對少數(shù)幾個(gè)物種如擬南芥[9]、水稻[10]、小麥[11]等的AAO基因家族進(jìn)行了鑒定分析。 如:在擬南芥中，AtAAO3基因的突變會(huì)導(dǎo)致ABA 含量降低[9]；番茄ABA 缺陷型突變體中的AAO 活性遠(yuǎn)低于野生型的[12]，大麥中也存在類似的AAO 缺失或活性降低的現(xiàn)象[13]。

香蕉(Musassp.)是世界上重要的熱帶水果之一，也是重要的糧食作物之一[14]。 香蕉在生長過程中會(huì)遭受到低溫、干旱、香蕉枯萎病等不同逆境的影響，對其產(chǎn)量和最終果實(shí)品質(zhì)產(chǎn)生重要影響[15-16]。 ABA 在這些過程中都扮演著重要的角色，因此，研究香蕉AAO家族基因種類及其在不同逆境處理下的表達(dá)情況具有重要意義。 本研究從香蕉基因組中鑒定得到了AAO家族基因，并分析了它們的進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)域，同時(shí)分析了其在不同組織、果實(shí)發(fā)育和成熟的不同階段及對非生物/生物脅迫響應(yīng)的表達(dá)模式，以期為進(jìn)一步明確MaAAOs基因在香蕉生長發(fā)育和脅迫反應(yīng)過程中的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用口味優(yōu)良的香蕉品種粉蕉(MusaABB Pisang Awak，F(xiàn)J) 進(jìn)行試驗(yàn)。 將粉蕉組培苗種植于塑料盆中(無菌土壤)，培養(yǎng)于生長室(28 ℃，70%濕度，光周期為16 h 光/8 h 暗，光照強(qiáng)度為200 μmol·m-2·s-1)。 組培苗種植取樣周期為2015 年6 月—2016 年8 月。

1.2 試驗(yàn)處理與樣品采集方法

(1)不同組織樣品采集:組培苗種植約70 天后達(dá)到五葉期，此時(shí)選取葉和根；組培苗種植約10 個(gè)月開始開花，于開花后0 天(0 DAF)、20 DAF 和80 DAF 選取果實(shí)；組培苗種植12 ～13 個(gè)月后采收，選取采收后3 天(3 DPH)和6 DPH 的果實(shí)。 每個(gè)樣本進(jìn)行兩次生物學(xué)重復(fù)，用于分析基因在不同組織和果實(shí)發(fā)育不同階段的表達(dá)情況。

(2)非生物脅迫處理方法及取樣:分別用300 mmol·L-1NaCl 和200 mmol·L-1甘露醇灌溉五葉期香蕉幼苗，進(jìn)行鹽脅迫和滲透脅迫處理，處理7 d 后取樣；將五葉期香蕉幼苗置于4 ℃生長室(70%濕度，光周期為16 h 光/8 h 暗，光照強(qiáng)度為200 μmol·m-2·s-1)進(jìn)行冷脅迫處理，22 h 后取樣。 采集對應(yīng)處理時(shí)間后的葉片樣本進(jìn)行非生物脅迫處理下基因的表達(dá)分析。

(3)尖孢鐮刀菌侵染處理及取樣:將五葉期香蕉幼苗根部浸泡在F. oxysporumrace 4(Foc4)孢子懸液(106個(gè)分生孢子/mL)中2 h，以浸入無菌蒸餾水(ddH2O)中的為對照；然后移栽到裝有無菌土壤的塑料盆中，在生長室中培養(yǎng)(28 ℃，70%濕度，光周期為16 h 光/8 h 暗，光照強(qiáng)度為200 μmol·m-2·s-1)；培養(yǎng)2 d 后，采集根系樣品進(jìn)行基因表達(dá)分析。 每份樣本包含兩個(gè)生物重復(fù)樣本。

1.3 香蕉AAO 基因家族的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

利用擬南芥AtAAOs基因的序列構(gòu)建HMM模型，從香蕉A 基因組中搜索得到香蕉AAOs序列；利用得到的香蕉AAOs序列構(gòu)建新的HMM 模型，利用新的HMM 模型從A 基因組中搜索鑒定MaAAOs基因。 使用保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(http:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)和PFAM 數(shù)據(jù)庫(http:/ /pfam.sanger.ac.uk/)驗(yàn)證得到的MaAAOs基因。 利用下載得到的AtAAOs 和水稻OsAAOs 蛋白序列，以MEGA-X 中的MUSCLE 方法進(jìn)行序列比對，使用Neighbor-joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap 值設(shè)置為1 000。

1.4 香蕉AAO 基因家族的蛋白質(zhì)特性和序列分析

通過ExPASy 數(shù)據(jù)庫(http:/ /expasy.org/)對分子質(zhì)量和等電點(diǎn)等理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測。 利用MEME 軟件和InterProScan 數(shù)據(jù)庫對蛋白結(jié)構(gòu)域序列進(jìn)行鑒定。 采用GSDS 數(shù)據(jù)庫對基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析(http:/ /gsds.cbi.pku.edu.cn/)。

1.5 轉(zhuǎn)錄組分析

RNA 測序中的RNA 提取、文庫制備和測序等工作均由美吉生物技術(shù)有限公司(中國上海)完成。 RNA-seq 分析樣本的收集過程參考前人的研究[17]。 每個(gè)樣本包含兩個(gè)生物重復(fù)序列。測序平臺為Illumina GAII (Illumina， San Diego，CA， USA)。 FASTX(http:/ /hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/)和FastQC(http:/ /www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)用于刪除接頭序列和低質(zhì)量序列。 通過Tophat V.2.0.10 將粉蕉樣本的clean reads 與香蕉基因組進(jìn)行比對[18]，使用Cufflinks 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組組裝[19]。 基因的表達(dá)值使用FPKM 值表示。 使用DEGseq 工具鑒定差異表達(dá)基因(DEGs) (log2-based fold change＞1；log2-based fold change＜-1)。

2 結(jié)果與分析

2.1 MaAAOs 基因的鑒定

利用香蕉AAO基因序列的保守結(jié)構(gòu)域構(gòu)建HMM 模型，從香蕉A 基因組中鑒定得到了3 個(gè)MaAAOs基因，分別命名為MaAAO1、MaAAO2、MaAAO3(表1)，其氨基酸殘基數(shù)量分別為1 365、1 393、1 399 個(gè)，編碼蛋白的分子量范圍為15.05～15.26 ku，等電點(diǎn)范圍是6.59 ～6.62。 為分析MaAAOs 的進(jìn)化關(guān)系，分別下載了水稻和擬南芥AAO基因家族的蛋白質(zhì)序列(表1)，采用NJ 法構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。 可見，所有AAO 蛋白可以分成兩類，MaAAO2 和MaAAO3 與所有AtAAOs及大部分OsAAOs 聚在一個(gè)亞類，而MaAAO1 則與兩個(gè)OsAAOs 聚成一個(gè)亞類。

圖1 AAO 家族蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹

表1 AAO 基因信息

2.2 MaAAOs 基因家族的結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)分析

利用MEME 數(shù)據(jù)庫從MaAAOs基因中鑒定得到10 個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，并用InterPro 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了注釋。 由結(jié)果(圖2、表2)可見，3 個(gè)MaAAOs基因表現(xiàn)出類似的結(jié)構(gòu)域組成，僅MaAAO1缺少了Motif8；除了Motif7，其余9 個(gè)Motif 都含有結(jié)構(gòu)域IPR016208，其功能被注釋為醛氧化酶/黃嘌呤脫氫酶。 隨后對MaAAOs基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，MaAAO2和MaAAO3有類似的基因結(jié)構(gòu)，都有10個(gè)內(nèi)含子；而MaAAO1的內(nèi)含子則是14 個(gè)(圖3)。 表明相同聚類有類似的結(jié)構(gòu)域組成和基因結(jié)構(gòu)，與系統(tǒng)發(fā)育樹的分析結(jié)果相一致。

圖2 MaAAOs 基因結(jié)構(gòu)域

圖3 MaAAOs 基因的結(jié)構(gòu)分析

表2 MaAAOs 基因結(jié)構(gòu)域的注釋

2.3 MaAAOs 在粉蕉不同組織中的表達(dá)

如圖4A 所示，粉蕉根中MaAAO1和MaAAO3基因高表達(dá)(FPKM＞5)，葉中3 個(gè)MaAAOs基因都表現(xiàn)出高表達(dá)，而果實(shí)(80 DAF)中則只有MaAAO1表現(xiàn)出高表達(dá)。 3 個(gè)MaAAOs基因中，只有MaAAO1在粉蕉根、葉和果實(shí)中都呈現(xiàn)出高表達(dá)。

圖4 MaAAOs 基因在香蕉不同組織(A)、果實(shí)不同發(fā)育階段(B)、不同逆境處理(C)中的表達(dá)分析

2.4 MaAAOs 在粉蕉果實(shí)不同發(fā)育階段中的表達(dá)

為明確MaAAOs基因在香蕉果實(shí)發(fā)育過程中的功能，對其在不同發(fā)育階段果實(shí)中的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，結(jié)果(圖4B)顯示，只有MaAAO1在果實(shí)發(fā)育早期(0 DAF 和20 DAF)和后期(80 DAF、3 DPH)中表現(xiàn)出高表達(dá)(FPKM＞5)，且以3 DPH 果實(shí)中的表達(dá)量最高；MaAAO2在果實(shí)發(fā)育整個(gè)階段的表達(dá)都極低；MaAAO3在果實(shí)各發(fā)育階段的表達(dá)水平相比MaAAO2要高，但除20 DAF外均沒有達(dá)到高表達(dá)。 因此推測MaAAO1可能在果實(shí)發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。

2.5 MaAAOs 在不同逆境處理下的表達(dá)

為分析MaAAOs基因在粉蕉應(yīng)對逆境脅迫中的功能，設(shè)置生物和非生物脅迫處理，分析3 個(gè)MaAAOs基因在粉蕉植株根中的表達(dá)情況，結(jié)果(圖4C)顯示，在Foc4 處理下，MaAAO2基因表現(xiàn)出上調(diào)(log2-based fold change＞1)；在滲透脅迫下，MaAAO1和MaAAO2基因表現(xiàn)出上調(diào)；在冷和鹽脅迫下，3 個(gè)基因均未表現(xiàn)出明顯的上調(diào)表達(dá)；MaAAO3基因在所有逆境處理中都沒有表現(xiàn)出顯著變化。

3 討論

香蕉既是一種重要的熱帶和亞熱帶水果，也是全球130 多個(gè)國家的主糧，但其研究進(jìn)展相比其它作物要慢[20]。 ABA 在植物的生長發(fā)育和生物/非生物脅迫響應(yīng)中起著重要作用[21]，而AAO是ABA 合成途徑中的重要合成酶，但香蕉AAO基因家族的情況仍不清楚。 本研究從香蕉A 基因組中鑒定出3 個(gè)MaAAOs基因，保守結(jié)構(gòu)域分析證明這3 個(gè)基因?qū)儆贏AO家族，并根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹將其分為兩個(gè)亞類， 其中MaAAO2和MaAAO3聚為一類。 擬南芥的AAO基因數(shù)量是4個(gè)[9]，水稻中可能是5 個(gè)[10]，小麥中是3 個(gè)[11]，數(shù)量均較少，表明AAO 蛋白可能屬于小基因家族編碼的蛋白質(zhì)。

香蕉果實(shí)的發(fā)育和成熟過程決定著果實(shí)的品質(zhì)和產(chǎn)量[14]。 研究表明，ABA 信號參與了果實(shí)的生長發(fā)育并影響著果實(shí)的成熟過程和最終品質(zhì)；未成熟水果中的內(nèi)源ABA 含量通常較低，施加外源ABA 能促進(jìn)果實(shí)成熟及果肉軟化；果實(shí)成熟過程中ABA 合成相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致內(nèi)源ABA 大量積累[22]。 這些結(jié)果表明ABA 在水果成熟過程中發(fā)揮著重要作用。 在本研究中，不同MaAAOs基因在粉蕉果實(shí)不同發(fā)育階段表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式，MaAAO1基因在早期和晚期都表現(xiàn)出高表達(dá)，而MaAAO2和MaAAO3幾乎不表達(dá)；此外，MaAAO1在粉蕉葉、根、果實(shí)中均表現(xiàn)出高表達(dá)，推測MaAAO1基因在香蕉果實(shí)發(fā)育和成熟過程中可能具有重要作用。

香蕉生長過程中常會(huì)遇到干旱、鹽、寒冷以及枯萎病菌感染等非生物和生物逆境，對果實(shí)品質(zhì)及產(chǎn)量造成影響[15-16]。 在擬南芥中，AtAAO3和AtAAO1基因表達(dá)明顯受到干旱脅迫的誘導(dǎo)[9，23]；在擬南芥中過表達(dá)花生AhAAO2基因也能顯著提高植株抵抗干旱脅迫的能力[24]。 本研究發(fā)現(xiàn)，MaAAO1和MaAAO2基因受滲透脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，但受冷和鹽脅迫的影響很小；MaAAO3基因的表達(dá)在3 種脅迫下均無顯著變化。 表明MaAAO1和MaAAO2基因可能在香蕉響應(yīng)干旱脅迫中發(fā)揮作用。 香蕉的種植生產(chǎn)也受到香蕉枯萎病的嚴(yán)重影響。 有研究表明ABA 能負(fù)向調(diào)控水楊酸(SA)介導(dǎo)的病原體反應(yīng)，例如，提高植株中ABA 的含量，會(huì)顯著促進(jìn)細(xì)菌的生長[25]。 在本研究中，僅MaAAO2基因的表達(dá)顯著受到Foc4 處理的誘導(dǎo)，表明這個(gè)基因可能參與了響應(yīng)Foc4 侵染的過程。

4 結(jié)論

本研究從香蕉A 基因組中鑒定得到了3 個(gè)MaAAOs基因，經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育分析、蛋白結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)分析，確定屬于AAO基因家族。MaAAOs基因參與了香蕉的生長發(fā)育、果實(shí)成熟和對生物/非生物脅迫的響應(yīng)等過程。 其中，MaAAO1基因在果實(shí)發(fā)育早期和成熟階段都表現(xiàn)出高表達(dá)；MaAAO1和MaAAO2基因?qū)B透脅迫有響應(yīng)；MaAAO2基因的表達(dá)被Foc4 誘導(dǎo)，可能響應(yīng)該病菌的侵染。