王世鵬，高子荑，孫永強，陳建華，董勝君，劉權(quán)鋼

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院/遼寧省森林培育重點實驗室，遼寧 沈陽 110866)

西伯利亞杏(Prunus sibiricaL.)又名山杏，為薔薇科(Rosaceae)李屬(Prunus)植物[1]，適生于我國溫帶、暖溫帶地區(qū)[2]。 西伯利亞杏是集生態(tài)、經(jīng)濟、社會效益于一身的優(yōu)良鄉(xiāng)土樹種[3]，生態(tài)適應(yīng)性強，能在干旱、瘠薄、寒冷、風沙大等惡劣條件下正常生長，具有防風固沙、涵養(yǎng)水源等改善生態(tài)環(huán)境的功能[4]；此外，杏仁富含豐富的蛋白質(zhì)、維生素、苦杏仁苷等多種營養(yǎng)及藥用成分，具有較高經(jīng)濟價值和藥用價值[5]。 目前，我國西伯利亞杏種質(zhì)資源開發(fā)和育種工作已取得很大進展，培育出了“山杏1 號”等一批高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)新品種[6]。 但在實際生產(chǎn)中，西伯利亞杏一直處于自然落種的野生、半野生狀態(tài)，苗木品質(zhì)參差不齊，即使是人工經(jīng)營的林地，也處于“有種就摘，有苗就栽”的粗放管理狀態(tài)，經(jīng)濟效益并不可觀，嚴重阻礙了西伯利亞杏產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[3]。 因此，如何快速推廣具有高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)特性的優(yōu)良品種成為西伯利亞杏產(chǎn)業(yè)發(fā)展的當務(wù)之急。

組織培養(yǎng)技術(shù)作為一種成本低、效率高、生產(chǎn)周期短的無性繁殖技術(shù)，是種質(zhì)資源收集與創(chuàng)新、良種工廠化育苗的有效手段[7]，已成為越桔屬[8]、繡球?qū)賉9]、槭屬[10]等經(jīng)濟林植物擴繁的重要手段，被廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源保護、遺傳育種和無性系苗木的商業(yè)化生產(chǎn)中。 組織培養(yǎng)技術(shù)與基因工程、原生質(zhì)融合等育種方法緊密結(jié)合，在種質(zhì)資源創(chuàng)新和新品種選育中發(fā)揮著越來越重要的作用[11]。 植物種子具有便于儲藏、取材不受季節(jié)制約的優(yōu)勢[12]，近年來很多學(xué)者以香椿[13]、柳杉[11]、珙桐[14]等樹木種子為初代培養(yǎng)材料獲得無菌苗并建立了組培快繁體系。 目前關(guān)于杏組織培養(yǎng)方面的研究已有報道，主要以下胚軸、子葉、莖尖、葉片等作為外植體材料，進行組培幼化效果[15]、愈傷組織誘導(dǎo)[16]、不定芽誘導(dǎo)[17]和生根誘導(dǎo)[18]等研究。 總體而言，杏植株再生相對困難，受外植體類型、激素配比和培養(yǎng)條件等多種因素的制約[12]，目前缺乏相對高效、完善的離體快繁體系。

本研究以西伯利亞杏種子和莖段為外植體材料，利用GA3處理快速打破西伯利亞杏種子休眠機制，篩選適用于不同外植體的最佳消毒方法、種子無菌苗培養(yǎng)最適條件及莖段腋芽誘導(dǎo)、增殖、生根的最適培養(yǎng)基，以期建立西伯利亞杏種子和莖段離體快繁體系，為實現(xiàn)西伯利亞杏的規(guī)?；a(chǎn)、加速良種化進程提供理論與技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

西伯利亞杏種子于2021 年6 月采自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)喀左縣山杏國家林木種質(zhì)資源保存庫。 收集成熟果實，去除果肉，杏核清洗后在室溫下風干2～3 d，經(jīng)選種、凈種后儲存在4 ℃冰箱中備用。莖段采自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)科研基地10 a 生西伯利亞杏母樹，6 月上旬采集生長良好的一年生枝條，用保鮮盒帶回實驗室備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體消毒方法篩選 種子:選取飽滿度一致的種子，去除核殼后用1.0 g/L GA3溶液浸泡6 h，然后流水沖洗1 h；在超凈工作臺中將其放入75%乙醇中消毒30 s，用無菌水沖洗3～4 次，再分別用2% NaClO、5% NaClO 和0.1% HgCl2進行滅菌處理，滅菌時間設(shè)置為8、10、12 min，共9 個處理。 浸泡過程中不斷用玻璃棒輕微攪拌，使種子充分消毒。 消毒結(jié)束后用無菌水沖洗3 ～4 次，去除種皮，接種到MS 基本培養(yǎng)基中。 每個處理接種30 粒種子，重復(fù)3 次，14 d 后統(tǒng)計萌發(fā)率和污染率。

莖段:將莖段放置到燒杯內(nèi)，流水沖洗1 h，在超凈工作臺中將其放入75%乙醇中用玻璃棒攪拌30 s，然后用無菌水沖洗3 次，再用0.1% HgCl2或2% NaClO 進行滅菌處理，滅菌時間設(shè)置為1.0、1.5、2.0 min；取出，用無菌水沖洗3 次，放置在無菌濾紙上吸干水分，然后將莖段剪成1 cm 長帶有一個芽點的小段，接種到MS 培養(yǎng)基，每個處理接種30 個，重復(fù)3 次，14 d 后統(tǒng)計存活率和污染率。

1.2.2 種子無菌苗培養(yǎng)條件的優(yōu)化 為了獲得西伯利亞杏種子萌發(fā)和生長的最佳培養(yǎng)條件，分別設(shè)置不同基本培養(yǎng)基(MS、1/2MS、WPM)和不同濃度(0.5、1.0、1.5 g/L)GA3溶液處理。 每處理接種30 粒消毒種子，重復(fù)3 次。 置于(24±2) ℃組培室內(nèi)進行遮光培養(yǎng)。 14 d 后統(tǒng)計種子萌發(fā)率，測量根長，稱量根鮮重，然后將根放入玻璃培養(yǎng)皿中置于烘箱中，105 ℃殺青20 min，80 ℃烘干至恒重，稱重。

1.2.3 莖段腋芽誘導(dǎo) 將消毒后的西伯利亞杏莖段接種到添加不同濃度IBA(0、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L)的MS 啟動培養(yǎng)基上，研究不同濃度IBA 對其腋芽誘導(dǎo)的影響。 每個處理接種40 個外植體，重復(fù)3 次。 接種后觀察并記錄腋芽生長狀況，21 d 左右統(tǒng)計誘導(dǎo)率。

1.2.4 腋芽增殖培養(yǎng) 將啟動培養(yǎng)基中誘導(dǎo)獲得的長勢一致且健壯的無菌西伯利亞杏芽苗分別接種到5 種增殖培養(yǎng)基上:MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA、MS+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA、MS+0.2 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA、WPM+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA、WPM+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA。 每個處理接種40 個芽苗，重復(fù)3 次。 觀察并記錄幼苗生長狀況，30 d 左右統(tǒng)計增殖系數(shù)。

1.2.5 生根培養(yǎng) 選擇增殖培養(yǎng)獲得的2 cm 左右叢生芽，剪取單芽接種至分別添加0.2、0.5、0.8 mg/L IBA 或NAA 的1/2MS 培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)。 上述每處理接種10 個芽，重復(fù)3 次，接種后觀察并記錄幼苗生根狀況，30 d 左右統(tǒng)計生根率。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Microsoft Excel 2021 軟件進行數(shù)據(jù)的記錄和整理；使用SPSS 26.0 軟件進行統(tǒng)計分析。 計算公式如下:萌發(fā)率(%)＝(萌發(fā)種子數(shù)/接種種子數(shù))×100；污染率(%)＝(污染外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100；莖段腋芽誘導(dǎo)率(%)＝(萌發(fā)莖段數(shù)/接種莖段數(shù))×100；增殖系數(shù)＝增殖芽數(shù)/接種芽數(shù)；生根率(%)＝(生根苗數(shù)/接種苗數(shù))×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外植體的最佳消毒處理篩選

2.1.1 種子消毒 由表1 可知，不同消毒處理對西伯利亞杏種子萌發(fā)率和污染率具有顯著影響。5% NaClO 消毒不同時間的污染率均為零，但種子萌發(fā)受到顯著抑制，萌發(fā)率較低，且消毒時間越長萌發(fā)率越低。 2% NaClO 與5% NaClO 的消毒效果相比，種子的萌發(fā)率(≥80%)顯著升高，尤以消毒10 min 的萌發(fā)率最高，達到91.67%，其次為消毒8 min，兩者間差異不顯著。 比較0.1%HgCl2和2% NaClO 的消毒效果發(fā)現(xiàn)，西伯利亞杏種子的萌發(fā)率均表現(xiàn)為隨著滅菌時間的延長先升高后降低，滅菌10 min 的萌發(fā)率最高，分別為80.00%和91.67%。 綜合分析，用2% NaClO 消毒10 min 對種子進行消毒的效果最佳。

表1 不同消毒處理對西伯利亞杏種子的消毒效果比較 %

2.1.2 莖段消毒 由表2 可知，2% NaClO 處理的莖段污染率整體高于0.1% HgCl2處理，且存活率整體低于0.1% HgCl2處理；隨著處理時間的延長，兩種消毒劑處理的莖段污染率均降低，而存活率均先升高后降低。 其中，0.1% HgCl2消毒1.5 min 處理(處理2)的莖段存活率最高，為61.67%，污染率為12.22%；0.1% HgCl2消毒2 min 處理的莖段污染率最低，為零，但存活率僅為27.78%，極顯著低于處理2。 綜上，莖段最佳消毒處理為0.1% HgCl2消毒1.5 min。

表2 不同消毒處理對西伯利亞杏莖段的消毒效果比較 %

2.2 不同濃度GA3、培養(yǎng)基類型對西伯利亞杏種子無菌苗培養(yǎng)的影響

2.2.1 不同濃度GA3對種子萌發(fā)和生長的影響不同濃度GA3對西伯利亞杏種子的萌發(fā)和生長有顯著影響(表3)。 隨著GA3濃度的升高，種子萌發(fā)率及根長、根鮮重、根干重均表現(xiàn)出先增長再降低的規(guī)律。 GA3濃度為1.0 g/L 時，種子萌發(fā)率最高，無菌苗長勢最好，種子萌發(fā)率、根長、根鮮重、根干重分別為91.67%、29.93 mm、83.00 mg、9.67 mg，均顯著高于其他處理。 綜上，選用1.0 g/L GA3浸泡種子，對西伯利亞杏種子萌發(fā)和無菌苗生長的效果最好。

表3 不同濃度GA3對西伯利亞杏種子萌發(fā)和生長的影響

2.2.2 不同培養(yǎng)基類型對種子萌發(fā)與生長的影響 在明確最佳消毒方法和GA3濃度的基礎(chǔ)上，進一步篩選最佳培養(yǎng)基類型。 結(jié)果表明，種子接種在MS 培養(yǎng)基上5 d 后開始萌動，長出下胚軸；接種在1/2MS 和WPM 培養(yǎng)基上的種子則均在8 d左右才有萌動反應(yīng)。 由表4 可知，處理1(MS)的種子萌發(fā)率最高(91.67%)，極顯著優(yōu)于處理2(1/2MS)和處理3(WPM)，處理2 的種子萌發(fā)效果最差(31.67%)。 從無菌苗根的生長狀況看，MS 培養(yǎng)基中無菌苗的根長、根鮮重和根干重極顯著優(yōu)于1/2MS 和WPM，分別達到29.93 mm、83.00 mg、9.67 mg。 綜上，MS 培養(yǎng)基是最適合西伯利亞杏種子萌發(fā)與生長的培養(yǎng)基。

表4 不同培養(yǎng)基類型對種子萌發(fā)與生長的影響

2.3 不同濃度IBA 對西伯利亞杏莖段腋芽誘導(dǎo)的影響

不同濃度IBA 對西伯利亞杏莖段腋芽的誘導(dǎo)率達35.00%～85.83%，隨著IBA 濃度的升高呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(表5)。 其中，在0.2 mg/L IBA 處理下，腋芽誘導(dǎo)率最高(85.83%)且萌發(fā)早，接種6 ～9 d 芽點即開始萌動，至20 d 左右形成2～4 cm 小綠梢，葉片自然舒展，生長狀況良好(圖1A、B)。 IBA 濃度過高(＞0.2 mg/L)會導(dǎo)致腋芽誘導(dǎo)率顯著降低，腋芽長勢較差，節(jié)間不易伸長。 因此，西伯利亞杏莖段腋芽誘導(dǎo)的最佳IBA濃度為0.2 mg/L。

圖1 西伯利亞杏腋芽誘導(dǎo)(A 和B)、增殖(C)和生根培養(yǎng)(D 和E)

表5 不同濃度IBA 對西伯利亞杏腋芽誘導(dǎo)的影響

2.4 不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基類型及激素濃度對腋芽增殖的影響

由表6 可以看出，當6-BA 濃度為0.5 mg/L時，西伯利亞杏腋芽的增殖系數(shù)較低，叢生芽葉片彎曲，節(jié)間無法伸長(圖1C、圖2A)。 當6-BA 濃度增至1.0 mg/L 時，腋芽的增殖系數(shù)顯著增加，處理3(MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA)增殖系數(shù)較高，為3.68，叢生芽的葉片舒展，節(jié)間能夠伸長(圖2B)；處理5(WPM+0.1 mg/L NAA +1.0 mg/L 6-BA)增殖系數(shù)最高，但叢生芽基部產(chǎn)生大量愈傷組織，葉片無法展開(圖2C)。 綜上，MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA 為腋芽增殖的最適培養(yǎng)基。

圖2 不同增殖培養(yǎng)基中叢生芽的生長狀態(tài)

表6 不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基類型及激素濃度對腋芽增殖的影響

2.5 不同生長素種類及濃度對生根的影響

1/2MS 培養(yǎng)基添加不同濃度NAA 或IBA 均可以誘導(dǎo)生根。 從接種后3 d 起，添加NAA 處理的莖段基部處開始膨大形成愈傷組織，隨著培養(yǎng)時間延長，愈傷組織不斷增大增多；培養(yǎng)兩周后，愈傷組織處開始有乳白色的根長出，但無側(cè)根分化。 添加IBA 處理的莖段底端形成的愈傷組織量少，接種后7 d 底端就有乳白色的根長出，而且具有側(cè)根；隨著培養(yǎng)時間的延長，根系逐漸增長，無菌苗長勢優(yōu)于NAA 處理(圖1D、E)。 添加0.5 mg/L IBA 生根率最高，為80.00%，極顯著高于其他處理(表7)。 因此，西伯利亞杏最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+ 0.5 mg/L IBA。

表7 不同生長素種類及濃度對生根的影響

3 討論與結(jié)論

外植體滅菌是體外再生的重要環(huán)節(jié)，直接影響再生體系的建立。 由于植物組織中存在的污染微生物不同，找到適當?shù)南痉椒ㄖ陵P(guān)重要[19]。目前多采用NaClO、HgCl2、酒精等一種或多種消毒劑聯(lián)合對外植體進行消毒。 宮惠[20]和楊超臣[13]等研究表明，HgCl2對種子具有毒害作用，用其進行種子消毒時會對細胞造成損傷，不利于種子萌發(fā)。 本試驗也發(fā)現(xiàn)0.1% HgCl2對西伯利亞杏種子的消毒效果差于2% NaClO；以2% NaClO消毒10 min 的效果最佳，種子萌發(fā)率達到91.67%，污染率為零。 另外，外植體不同，其適宜的消毒劑種類和消毒方法也不盡相同。 本研究中，0.1% HgCl2對西伯利亞杏莖段的消毒效果明顯優(yōu)于2% NaClO，在粉花山杏莖段消毒研究中也得出相同的結(jié)論[21]。 原因可能是莖段外源菌較多，NaClO 難以清除，同時也說明莖段對短時HgCl2處理具有一定的耐受性[22]。

西伯利亞杏種子具有生理后熟性，具有較長的休眠期。 目前解除果樹種子休眠主要采用沙藏低溫層積法和外源激素處理[23]，其中施用外源激素所需時間較短且使用相對靈活。 已有研究表明，外源GA3在打破種子生理休眠和促進萌發(fā)方面具有重要作用[24-25]，適宜濃度的GA3能夠促進楸樹[26]和沙棗[27]種子萌發(fā)。 本試驗利用GA3溶液浸泡打破西伯利亞杏種子休眠，在0.5～1.5 g/L范圍內(nèi)，GA3處理對西伯利亞杏種子萌發(fā)和生長表現(xiàn)出低濃度促進、高濃度抑制的規(guī)律，與在楸樹[26]和沙棗[27]上的研究結(jié)果一致；以1.0 g/L GA3處理的種子萌發(fā)效果最好，同時促進了無菌苗的發(fā)育和根的生長。

培養(yǎng)基作為植物組織培養(yǎng)的營養(yǎng)基礎(chǔ)，是決定組織培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵因素，需要根據(jù)不同的組培生產(chǎn)和試驗?zāi)康?、植物種類和培養(yǎng)部位等選擇適宜的培養(yǎng)基。 MS 培養(yǎng)基無機鹽含量較高，微量元素種類齊全、濃度較高；WPM 培養(yǎng)基不含錳和碘，鈣、鉀和硝態(tài)氮的含量高，適用于大多數(shù)木本植物的培養(yǎng)。 本試驗選用WPM、1/2MS 和MS 培養(yǎng)基，不添加任何激素，以探究適合西伯利亞杏種子萌發(fā)和生長的基本培養(yǎng)基，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MS較WPM 和1/2MS 更利于西伯利亞杏種子萌發(fā)和生長，這與王立科等[28]對野生黑果枸杞組培試驗的結(jié)果相似，但與在鐵皮石斛[29]和香椿[13]中的試驗結(jié)果不同。 這可能是由于不同植物品種具有不同的遺傳、生物和生態(tài)特征，影響了對營養(yǎng)物質(zhì)的需求[30]。

通過莖段腋芽誘導(dǎo)直接獲得無菌芽苗的方式能夠?qū)崿F(xiàn)植物離體快繁且遺傳穩(wěn)定[31]。 單獨使用生長素可以促進腋芽直接萌發(fā)成芽[32]，在紫花槭[33]和元寶楓[34]的離體快繁中，適宜濃度的IBA對莖段腋芽誘導(dǎo)具有顯著效果；但高濃度的IBA也會抑制腋芽的萌發(fā)[33]。 本研究發(fā)現(xiàn)IBA 對西伯利亞杏莖段腋芽誘導(dǎo)的影響顯著，當IBA 濃度為0.2 mg/L 時誘導(dǎo)率最高。

不同植物品種增殖培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)基類型及激素種類和濃度存在差異。 李屬植物增殖培養(yǎng)中比較常用的激素組合為6-BA 與NAA 或IBA[35-36]。 如仁用杏品種‘圍選1 號’和‘優(yōu)一’腋芽增殖培養(yǎng)中以MS 為基本培養(yǎng)基，添加1.0 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA，獲得了較好的增殖效果；而李、杏砧木品種‘St.Julien A’在WPM+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA 中增殖系數(shù)高，且生長良好。本研究對不同濃度6-BA 與0.1 mg/L NAA 組合用于西伯利亞杏腋芽增殖時發(fā)現(xiàn)，在MS 培養(yǎng)基中，1.0 mg/L 6-BA 的增殖系數(shù)顯著高于0.5 mg/L 6-BA，且叢生芽長勢良好，節(jié)間能夠伸長，葉片舒展，說明較高濃度的細胞分裂素與較低濃度的生長素組合可獲得良好的增殖效果[10]；在WPM 培養(yǎng)基中，雖腋芽增殖系數(shù)高于在MS 培養(yǎng)基中，但叢生芽生長狀況較差，基部產(chǎn)生大量愈傷組織，葉片無法展開。 所以MS 培養(yǎng)基更適合西伯利亞杏腋芽的增殖培養(yǎng)。

有效的生根誘導(dǎo)是建立西伯利亞杏離體快繁的重要前提[37]。 IBA 和NAA 是植物生根培養(yǎng)中最常用的生長素。 本研究發(fā)現(xiàn)，NAA 和IBA 均能誘導(dǎo)西伯利亞杏生根。 但在添加NAA 的生根培養(yǎng)基中，與培養(yǎng)基接觸的莖段基部先長出愈傷組織，根從愈傷組織處長出且生根緩慢；而在添加IBA 的生根培養(yǎng)基中，不易產(chǎn)生愈傷組織，根系從莖段基部直接長出，生根效率高。 可見，IBA 對西伯利亞杏的生根效果優(yōu)于NAA，與前人研究結(jié)論[36-39]相似。

綜上，本試驗通過對西伯利亞杏種子和莖段最佳消毒處理、種子無菌苗培養(yǎng)條件及莖段腋芽誘導(dǎo)、增殖和生根的組培體系研究，建立了西伯利亞杏種子和莖段無菌苗培養(yǎng)及快繁技術(shù)體系:西伯利亞杏種子采取75%乙醇30 s+2% NaClO 10 min 的消毒方式進行滅菌，用1.0 g/L GA3溶液浸泡6 h 后接種到MS 基本培養(yǎng)基上，種子萌發(fā)率高達91.67%；莖段用75%乙醇30 s+0.1% HgCl21.5 min 消毒，然后接種到腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+0.2 mg/L IBA)上，腋芽誘導(dǎo)率達85.83%；30 d 時轉(zhuǎn)接入腋芽增殖培養(yǎng)基MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA 上，增殖系數(shù)可達3.68；30 d 時轉(zhuǎn)接入生根培養(yǎng)基(1/2MS+0.5 mg/L IBA)上，生根率可達80.00%。 本研究為西伯利亞杏遺傳轉(zhuǎn)化研究奠定了基礎(chǔ)，對實現(xiàn)西伯利亞杏的規(guī)?；a(chǎn)、加速良種化進程工作具有重要意義。