冼偉杭，張?zhí)煊?，賴健儀，王丙云，董貴信，3，陳志勝，陳勝鋒，白銀山，劉璨穎，張 暉，計慧琴

（1.佛山科學技術(shù)學院生命科學與工程學院，佛山，528200；2.廣東長隆集團有限公司，廣州，511430；3.廣東華南珍稀野生動物物種保護中心，珠海，519031）

孟加拉虎（Panthera tigris tigris）是一種珍稀野生動物，保護這一珍稀動物除恢復(fù)棲息地外，還可通過圈養(yǎng)維持物種數(shù)量。目前圈養(yǎng)的孟加拉虎常發(fā)腎炎［1］，常規(guī)治療方法是使用抗菌消炎藥物以及調(diào)節(jié)電解質(zhì)和水鹽平衡，但并不能修復(fù)受損器官組織結(jié)構(gòu)，即不能完全恢復(fù)腎臟功能，可能導致孟加拉虎死亡。因此，為保護孟加拉虎，需要找到一種新型且有效地用于孟加拉虎腎炎治療的方法。在這種情況下，一種涉及間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的療法——再生療法逐漸進入人們的視野。從中胚層起源的干細胞稱為間充質(zhì)干細胞，具備自我更新和多向分化潛能［2-4］。脂肪間充質(zhì)干細胞（adipose derived mesenchymal stem cells，AD-MSCs）來源于脂肪，大量研究發(fā)現(xiàn)其在腎損傷治療上具有療效［5-12］，并且具有來源豐富、操作簡便、容易獲取、體外增殖能力強等特征［13-15］，目前已經(jīng)從人、馬、豬和牛等物種中成功分離［16-23］。ADMSCs 能通過分化途徑分化為受損組織細胞［5，7-10］及通過旁分泌途徑分泌因子發(fā)揮干細胞募集、血管再生、減輕炎癥反應(yīng)和抗細胞凋亡等作用［5-10，12］，促進受損組織的修復(fù)，進而起到有效治療腎損傷的效果［5-12］。

基于AD-MSCs 在治療腎損傷方面的作用，認為其具備治療虎腎病的潛能，但目前缺乏標準化的分離、培養(yǎng)和鑒定虎AD-MSCs 的方法。本試驗擬研究虎AD-MSCs 的分離方法、培養(yǎng)體系以及生物學特性，為虎的腎病等疾病治療提供種子細胞。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

長隆野生動物園1歲雌性孟加拉虎。

1.2 脂肪采集及原代AD-MSCs的分離和培養(yǎng)

對孟加拉虎進行腹部增生物切除手術(shù)時，在距離患處5 cm 處采集脂肪，然后結(jié)節(jié)縫合，將采集到的脂肪儲存在含有10%雙抗的1×phosphate buffered saline（PBS）中，冷藏保存運輸?shù)綄嶒炇?。用?0%雙抗的PBS 洗去組織上的血液，清洗干凈后將組織放進50 mL 離心管中，用無菌器械將組織剪碎，加入0.1%Ⅰ型膠原酶消化1 h 至無明顯組織塊后終止消化；將消化好的組織過濾并離心，棄上清，用完全培養(yǎng)基將細胞重懸；進行細胞計數(shù)，然后將細胞密度調(diào)整到1×106個/mL 并轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，放置于培養(yǎng)箱37 ℃、5% CO2培養(yǎng)，24 h 后觀察細胞貼壁情況。

1.3 細胞傳代培養(yǎng)、生長特性觀察及生長曲線的繪制

待細胞在培養(yǎng)皿生長面積達到80%，吸去上清，用PBS 清洗。加入胰酶消化，40 s 后加入終止液終止消化。離心棄上清，傳代擴增培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)和活性，拍照記錄。依次選取P3、P6、P9 代孟加拉虎AD-MSCs，調(diào)整細胞密度并接種于96 孔板，培養(yǎng)24 h 后，每天同一時間段選取5 孔，加入CCK8 孵育30 min，利用酶標儀測量并記錄對應(yīng)OD 值，每孔測量3 次取平均值，持續(xù)8 d。以橫坐標為培養(yǎng)時間，縱坐標為OD 值繪制生長曲線。

1.4 細胞形態(tài)學觀察

使用倒置顯微鏡對原代及傳代細胞的形態(tài)進行觀察并記錄。

1.5 AD-MSCs成脂誘導分化試驗

選取生長狀態(tài)良好的P3 代細胞，調(diào)整細胞密度接種到24 孔板中培養(yǎng)，各選取3 個孔作為對照組和試驗組。對照組用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，試驗組加入誘導分化A 液，誘導分化A 液由88.5%基礎(chǔ)培養(yǎng)基、10.0%胎牛血清、1.4%成脂誘導分化添加物A-Ⅰ和0.1%成脂誘導分化添加物A-Ⅱ構(gòu)成。培養(yǎng)3 d后加入B 液培養(yǎng)1 d 為1 個循環(huán)，誘導分化B 液由90.0%基礎(chǔ)培養(yǎng)基、9.8%胎牛血清和成脂誘導分化添加物B構(gòu)成。試驗組在培養(yǎng)3個循環(huán)后，棄上清，清洗，用多聚甲醛固定30 min，棄去多聚甲醛并清洗。用油紅O 染色30 min，染色結(jié)束清洗多余染液，利用倒置顯微鏡觀察并拍照記錄。

1.6 AD-MSCs成骨誘導分化試驗

選取生長狀態(tài)良好的P3 代細胞，調(diào)整細胞密度接種到24 孔板中培養(yǎng)，各選取3 個孔作為對照組和試驗組。對照組用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，試驗組用成骨誘導分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)14～21 d可見細胞表面有明顯粗糙樣物質(zhì)，棄上清并清洗細胞，用多聚甲醛固定30 min，棄多聚甲醛并清洗，加入茜素紅染液染色30 min，染色結(jié)束清洗多余染液置于倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.7 總RNA提取及cDNA合成

將虎AD-MSCs 接種于6 孔板上，待細胞長滿棄上清并用DEPC-H2O 清洗，然后按照以下步驟進行：（1）用TRIzol 液裂解細胞后離心。（2）離心結(jié)束棄上清加入氯仿，混合靜置離心。（3）離心結(jié)束吸取上層水層至新的EP 管中，加入異丙醇混合離心。（4）離心結(jié)束后棄上清，加入乙醇，混合離心。（5）離心結(jié)束棄上清，沉淀室溫干燥后加入RNase-free ddH2O溶解沉淀并檢測濃度，結(jié)果顯示A260/A280值為1.867，可用于cDNA 合成。（6）cDNA 合成使用TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，依據(jù)試劑盒說明書操作，-20 ℃保存合成的cDNA。

1.8 PCR基因檢測

將cDNA 全組基因作為模板進行PCR 體系擴增，電泳檢測擴增產(chǎn)物，引物設(shè)計見表1。因產(chǎn)物大小在200～3 000 bp，所以需配制1.5% 的電泳膠，取0.75 g 瓊脂粉加熱溶解在60 mL 的1×TAE 緩沖液中，然后加入4 μL 核酸染液攪拌均勻，倒板并冷卻30 min，冷卻后依次加入DL2000 DNA Marker及PCR 產(chǎn)物，在電壓120 V、電流200 mA 的條件下電泳20 min，電泳結(jié)束后在照膠儀下觀察記錄電泳結(jié)果。

表1 MSCs相關(guān)基因的引物序列Tab.1 Primer sequences of MSCs related genes

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)學觀察

通過Ⅰ型膠原酶消化法得到原代培養(yǎng)的細胞呈圓形，部分貼壁細胞呈梭狀，胞體透亮（圖1A）；培養(yǎng)48 h 后，大量細胞開始貼壁，細胞形態(tài)為長梭形，胞質(zhì)較大，折光性強（圖1B）；培養(yǎng)72 h 后，細胞生長面積為70%～80%，可進行傳代擴增培養(yǎng)（圖1C）；傳代細胞形態(tài)為均勻梭形（圖1D）；傳代培養(yǎng)至P6代細胞生長穩(wěn)定（圖1E）；細胞形態(tài)沒有發(fā)生改變（圖1F）。

圖1 孟加拉虎AD-MSCs生長狀況Fig.1 Growth of AD-MSCs in Bengal tiger

2.2 AD-MSCs生長曲線

圖2顯示，P3、P6和P9代虎AD-MSCs的生長曲線均為S型，P3、P6和P9培養(yǎng)至第4天進入對數(shù)生長期，P3、P6代細胞培養(yǎng)至第7天進入平臺期，P9代細胞培養(yǎng)至第8天進入平臺期。與P3、P6代細胞比，P9代細胞增殖能力下降。符合MSCs生長曲線規(guī)律。

圖2 孟加拉虎AD-MSCs生長曲線Fig.2 Growth curve of AD-MSCs of Bengal tiger

2.3 AD-MSCs成脂誘導分化

取生長狀態(tài)良好的P3 代細胞進行成脂誘導分化，對照組細胞形態(tài)上沒有明顯變化，試驗組細胞在加入誘導分化培養(yǎng)基4 d 后，胞體變大變圓，部分細胞發(fā)生融合，且可見胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大小不一的脂質(zhì)顆粒，培養(yǎng)6 d 后脂滴增多變大。培養(yǎng)8 d，脂滴明顯，用油紅O 染色結(jié)果顯示試驗組的脂滴能紅染（圖3B），對照組不被染色（圖3A），表明虎AD-MSCs具有脂向分化能力。

圖3 孟加拉虎AD-MSCs成脂誘導分化結(jié)果（100×）Fig.3 Adipogenic differentiation of Bengal tiger AD-MSCs（100×）

2.4 AD-MSCs成骨誘導分化

取生長狀態(tài)良好的P3 代細胞進行成骨誘導分化鑒定，對照組細胞形態(tài)上沒有發(fā)生明顯變化。試驗組加入成骨誘導培養(yǎng)液培養(yǎng)7 d后，細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，由長梭狀變?yōu)轺[片狀，細胞成片狀堆積；誘導培養(yǎng)14 d 細胞表面可見粗糙樣物質(zhì)，此時利用茜素紅進行成骨染色。顯微鏡下觀察試驗組可見細胞融合生長，視野內(nèi)可見明顯紅染區(qū)域（圖4B），表明成骨誘導條件下細胞形成鈣結(jié)節(jié)。對照組視野下無明顯紅染區(qū)域（圖4A）。

圖4 孟加拉虎AD-MSCs成骨誘導分化結(jié)果（100×）Fig.4 Bone induced differentiation of Bengal tiger AD-MSCs（100×）

2.5 AD-MSCs表面標記物基因檢測

PCR 基因檢測結(jié)果如圖5 所示，表面標記物CD90、CD105、CD29 和CD44 在相應(yīng)范圍有明顯條帶，CD34 在相應(yīng)范圍無條帶，表明該細胞陽性表達CD90、CD105、CD29 和CD44，不表達CD34，結(jié)果符合間充質(zhì)干細胞表面標記物特性。

圖5 孟加拉虎AD-MSCs表面標記物基因檢測結(jié)果Fig.5 Detection results of AD-MSCs surface marker genes in Bengal tiger

3 討論

圈養(yǎng)孟加拉虎常發(fā)腎炎疾?。?］，恢復(fù)受損組織的再生療法成為新的治療選擇。再生療法是以MSCs 為基礎(chǔ)的治療方式［24］。MSCs 是一種起源于中胚層的干細胞，具有自我更新能力和多向分化能力［2-4］，在體外培養(yǎng)能連續(xù)傳代且保持細胞的形態(tài)和特性。誘導培養(yǎng)條件下，能分化為脂肪細胞、骨細胞和軟骨細胞等多種細胞。MSCs 具有免疫原性低、趨化歸巢、旁分泌和免疫調(diào)節(jié)等能力［2-3］，因此廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學的研究。AD-MSCs 與其他來源的MSCs 相比，具有來源豐富、供體創(chuàng)傷輕、易獲得和體外增殖能力強的特點［13-15］。目前已經(jīng)成功從多種動物上分離培養(yǎng)AD-MSCs，但虎脂肪來源的MSCs分離培養(yǎng)沒有研究報道。在多種疾病的治療上，ADMSCs被大量使用，其中在腎損傷治療的研究中也取得進展，如犬、貓及小鼠的急性腎損傷、缺血性灌注腎損傷模型的治療中具備效果［5-12］。不同種屬的同種MSCs能表達相同表面標記物，相同表面標記物表達表明細胞具有相似的潛能［25-26］，因此虎AD-MSCs的分離方法、培養(yǎng)體系的建立具有重要意義，為后續(xù)虎AD-MSCs 的應(yīng)用建立基礎(chǔ)，為虎腎病的治療提供新式療法。

AD-MSCs分離方法主要為膠原酶消化法。本研究采?、裥湍z原酶消化法從脂肪組織分離得到虎的AD-MSCs。在顯微鏡下可見細胞形態(tài)為長梭形，生長方式為旋渦狀生長，與已有研究［16-23］分離的ADMSCs 形態(tài)描述結(jié)果相符。對細胞進行多次傳代培養(yǎng)，細胞形態(tài)保持不變，均為長梭形，P3、P6 和P9 細胞生長曲線符合MSCs 生長曲線規(guī)律。P3、P6 代細胞增殖能力差異小，與P3、P6代細胞比，P9代細胞增殖能力下降。有研究表明，MSCs 在體外培養(yǎng)條件下，P3 至P6 MSCs 增殖速度快、形態(tài)良好、活性強。MSCs傳代至P9后，MSCs會出現(xiàn)空泡化、胞體變大及增殖緩慢等細胞老化現(xiàn)象［27］。根據(jù)MSCs 體外培養(yǎng)的特點可以為后續(xù)臨床應(yīng)用細胞代數(shù)的選擇提供參考，同時也要求完善體外培養(yǎng)體系，延緩細胞老化。

本研究使用PCR 檢測AD-MSCs 表面標志物，通過PCR 擴增得到相應(yīng)MSCs 特定表面標記物基因片段。結(jié)果顯示在區(qū)間范圍內(nèi)有CD90、CD44、CD105及CD29條帶，無CD34條帶。在誘導培養(yǎng)基條件下，AD-MSCs 可向脂肪、骨和軟骨等方向分化。本試驗分別對孟加拉虎AD-MSCs 進行成骨和成脂誘導分化，檢測虎AD-MSCs 的多向分化能力。成骨誘導培養(yǎng)基主要成分為地塞米松、抗壞血酸和β-甘油磷酸，其中地塞米松和抗壞血酸有利于骨成熟和細胞外基質(zhì)膠原的合成，而β-甘油磷酸鈉有利于細胞內(nèi)鈣鹽沉積和鈣化形成。沉積的鈣鹽可用茜素紅染液染成深紅色以便在顯微鏡下觀察。成脂誘導分化液中主要誘導因子有胰島素、IBMX、羅格列酮和地塞米松，能夠促進MSCs 向脂肪方向誘導分化。上述結(jié)果均符合國際MSCs 標準定義，即：表達CD44、CD90、CD105和CD29等MSCs表面標記物，不表達CD34等造血細胞表面標志物；在特定條件下可誘導分化為骨細胞和脂肪細胞［16-23，28-29］。

本研究不提供細胞流式鑒定結(jié)果，原因是目前可以獲取的流式抗體因種屬特異性，無法在虎ADMSCs 上表達，不適用于虎AD-MSCs 的流式細胞術(shù)鑒定。

綜上所述，本研究成功建立虎AD-MSCs 原代分離培養(yǎng)方法，該方法操作簡單方便，具有獲得大量虎AD-MSCs的優(yōu)勢，同時通過誘導分化、表面標記物表達等鑒定試驗，表明所獲取細胞為虎AD-MSCs，為虎AD-MSCs的后續(xù)研究和臨床應(yīng)用提供穩(wěn)定的細胞分離和培養(yǎng)方法。