高 騰,趙琳琳,汪煜楠,初婷婷,鄭永慧,張驚宇

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,黑龍江 哈爾濱150001)

腺相關(guān)病毒(Adeno-associated virus,AAV)屬于細(xì)小病毒科的依賴病毒屬,AAV的線性單鏈DNA基因組約為4.7 kb,有兩個主要編碼基因:編碼復(fù)制相關(guān)蛋白(Rep)與衣殼蛋白(Cap)[1-3]。AAV基因組末端長度為145 bp的反向末端重復(fù)序列(ITR)是DNA的復(fù)制來源,也是包裝信號和整合位點所需的唯一基本活性序列。重組AAV基因傳遞載體包含一個保留ITR的基因組,但野生型AAV編碼序列被治療基因(轉(zhuǎn)基因)取代。這些載體是通過添加編碼VP和Rep蛋白的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)來組裝的[4-5]。腺相關(guān)病毒宿主范圍較廣,可整合到染色體但無致病性,免疫原性較弱,可長期表達(dá)外源基因,是體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移理想的候選載體[6]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)13種腺相關(guān)病毒血清型,現(xiàn)階段發(fā)現(xiàn)的腺相關(guān)病毒血清型尚不能破壞寄主并誘發(fā)病害[7]。使用腺相關(guān)病毒載體進行體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移的安全性和有效性都受到宿主免疫系統(tǒng)的影響。針對轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的衣殼特異性,T細(xì)胞反應(yīng)在腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因過程中,對外源基因表達(dá)時間的長短有一定影響[8-10]。目前腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移在腦腫瘤領(lǐng)域的應(yīng)用尚處于萌芽階段,其中一個重要原因就是缺乏高效轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的腺相關(guān)病毒載體。所以如何提高腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)腦腫瘤細(xì)胞的效率是重要的研究方向。因此本研究通過在AAV5的衣殼蛋白Cap的氨基酸N573后插入一段寡肽GIVADNLNL以替換Q574到T578之間的蛋白序列QSSTT,同時引入兩個點突變S2A和T711S得到AAVX01,進而研究其產(chǎn)量及轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。

1 材料與方法

1.1 主要材料AAV5、AAV8兩種腺相關(guān)病毒血清型,pAAV-CMV-GFP質(zhì)粒,pHelper質(zhì)粒,HEK293細(xì)胞,H4細(xì)胞系和A172細(xì)胞系。

1.2 AAVX01的構(gòu)建在AAV5的Cap基因N573后隨機插入7個氨基酸寡肽片段,同時引入S2A、T711S兩個點突變位點,經(jīng)合理設(shè)計并合成形成AAV5隨機質(zhì)粒,將構(gòu)建的病毒包裝質(zhì)粒與pHelper質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞形成具有感染性的嵌合AAV5。將嵌合AAV5與Ad5質(zhì)粒共感染H4細(xì)胞系及A172細(xì)胞系,感染48 h后收集細(xì)胞裂解液用于下一輪的感染,如此反復(fù)感染兩組細(xì)胞系4～5次,提取病毒DNA,并對突變的衣殼蛋白基因進行測序,分析出現(xiàn)頻次最高的突變體,此變體在H4細(xì)胞系及A172細(xì)胞系中轉(zhuǎn)導(dǎo)效率優(yōu)于其他變體,實驗中發(fā)現(xiàn)插入寡肽片段為GIVADNLNL的突變體轉(zhuǎn)導(dǎo)效率優(yōu)異,命名為AAVX01。

1.3 細(xì)胞的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染、病毒包裝、純化、感染用含10%FBS、1%雙抗(體積分?jǐn)?shù))的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)HEK293細(xì)胞,用含10% FBS、1%雙抗(體積分?jǐn)?shù))、10%熱滅活胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)H4和A172細(xì)胞。將AAV包裝質(zhì)粒、pHelper質(zhì)粒、pAAV-CMV-GFP質(zhì)粒在PEI條件下進行三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。48 h后,收集細(xì)胞并通過離心沉淀,將細(xì)胞重懸于含150 mmol/L NaCl,50 mmol/LTris-HCl(pH7.5)的PBS溶液中,冷凍與融化交替進行反復(fù)若干次,并在37℃下用Benzonase酶(50 U/mL)處理0.5 h,去除細(xì)胞裂解物,并將上清液加到碘克沙醇梯度溶液(按體積分?jǐn)?shù)使用PBS配制10%、20%、40%、50%碘克沙醇梯度溶液)中,在4℃下以78 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心120 min,從40%碘克沙醇相中收獲病毒顆粒。將收獲的病毒以感染復(fù)數(shù)=1×105vg/cell感染H4、A172細(xì)胞,觀察GFP綠色熒光表達(dá),每組平行進行5次實驗。

1.4 嵌合AAV和嵌合質(zhì)粒的構(gòu)建AAV Cap基因重組后,用特異性引物進行PCR擴增生成全長Cap嵌合體,克隆到野生型AAV5主鏈中生成重組質(zhì)粒。對20個重組質(zhì)粒進行克隆和DNA測序。建立質(zhì)粒后,分兩步生成AAV衣殼。首先通過將pXR2和AAV質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染,將含有重組Cap基因的部分包裝到AAV5衣殼中。然后將得到的AAV感染HEK293細(xì)胞和腺病毒Ad5重復(fù)感染的H4細(xì)胞系及A172細(xì)胞系,從而確保產(chǎn)生包裝相應(yīng)嵌合AAV基因組的嵌合AAV衣殼。

輔助質(zhì)粒pXR和引物序列設(shè)計:利用外層引物P1和P2擴增DNA,進行片段反應(yīng)。從輔助質(zhì)粒中擴增出包含整個Cap、部分Rep基因和部分質(zhì)粒主干序列的4.4 k堿基片段。然后將PCR產(chǎn)物以等摩爾量混合在一起,用DNaseI隨機破碎。大小在400到1 200個堿基對之間的片段在瓊脂糖凝膠中被分解,并在沒有引物的情況下通過變性、退火和延伸的循環(huán)重新組裝。然后在4℃下,用內(nèi)引物P3和P4擴增組裝好的片段,用SfiI和XbaI酶切,并連接到用相同酶酶切的主鏈上結(jié)扎混合物并純化。將此20個樣本克隆進行序列分析。

1.5 提取mRNA和PCR檢測實時熒光定量PCR對采集病毒進行檢測,以pAAV-CMV-GFP為標(biāo)準(zhǔn)品,在GFP基因上設(shè)計上游引物和下游引物。從GenBank中查詢得到人AAV5的cDNA。用Prime Primier軟件設(shè)計引物。引物由納川生物技術(shù)有限公司合成。

上游引物(Forward primer):5’-GGAAGCTTATGTCCATCTTGTTTTATG-3’

下游引物(Reverse primer):5’-ATGCGGCCGCTTCATGTTCTTCCGATT-3’

1.6 銀染銀染檢測出蛋白和核酸的陽性率較高,AAV的外殼由VP1、VP2、VP3 3種蛋白按1∶1∶10比例組成,利用Thermo Scientific的銀染試劑盒對收集的病毒顆粒進行純度分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理本實驗各定量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計描述以標(biāo)準(zhǔn)差的方式來體現(xiàn)。用雙尾檢驗及不成對資料的t檢驗來比較各組血清型的神經(jīng)膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 與H4及A172細(xì)胞系高親和AAV載體

利用肽展示技術(shù)通過在AAV5衣殼蛋白Cap的氨基酸N573后插入一段氨基酸GIVADNLNL以替換Q574到T578之間的蛋白序列QSSTT,同時引入兩個點突變S2A和T711S得到AAVX01(圖1)。本研究該改造是否會對AAV產(chǎn)量造成影響,通過qPCR定量分析從5×107個細(xì)胞中產(chǎn)出的病毒量,發(fā)現(xiàn)AAVX01的產(chǎn)量不比常用的野生型AAV5,8低(表1);進而計算qPCR和銀染測得的病毒滴度比值(即實心率,反映有活性的病毒量),發(fā)現(xiàn)AAVX01的實心率不明顯低于野生型AAV5,8。上述結(jié)果說明對AAV5改造產(chǎn)生的AAVX01產(chǎn)量和實心率不低于野生型AAV5,8。

表1 AAV5、AAV8及AAVX01產(chǎn)量和實心率

圖1 與H4及A172細(xì)胞系高親和AAV載體AAVX01

2.2 AAVX01有優(yōu)異的H4及A172細(xì)胞系轉(zhuǎn)導(dǎo)效率

為了研究AAVX01感染腫瘤細(xì)胞的效率,本研究選擇了H4和A172這兩種常用的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系,將包裝了GFP報告基因的AAV以5×104vg/cell的感染復(fù)數(shù)(MOI)感染細(xì)胞,于72 h后觀察綠色熒光表達(dá)。對于被病毒感染神經(jīng)膠質(zhì)母瘤細(xì)胞A172的比例,AAVX01是AAV5的2.85倍,是AAV8的9.27倍(圖2A,B);對于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞H4的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率AAVX01是AAV5的6.85倍,是AAV8的1.67倍(圖3A,B)。上述結(jié)果說明AAVX01相比于野生型AAV5,8對于H4及A172神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系有更好的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。

圖2 AAVX01轉(zhuǎn)導(dǎo)A172細(xì)胞系的效率

圖3 AAVX01轉(zhuǎn)導(dǎo)H4細(xì)胞系的效率

AAVX01載體的構(gòu)建:通過在AAV5衣殼蛋白Cap的氨基酸N573后插入一段氨基酸GIVADNLNL以替換Q574到T578之間的蛋白序列QSSTT,同時引入兩個點突變S2A和T711S得到AAVX01。

通過qPCR定量分析從5×107個細(xì)胞中產(chǎn)出的病毒量;進而計算qPCR和銀染測得的病毒滴度比值,數(shù)據(jù)以平均值的形式體現(xiàn),n=3,數(shù)據(jù)統(tǒng)計采取非配對t檢驗。

3 討論

AAV已成為人類基因治療最常用的傳遞方式之一。事實上,目前歐洲和美國食品和藥物管理局已經(jīng)批準(zhǔn)了3種rAAV藥物[11-12]?？傮w來講,rAAV藥物臨床應(yīng)用取得了積極的治療效果且AAV基因治療具有較強的安全性。然而,關(guān)于AAV載體的研發(fā)仍面臨諸多問題:衣殼和轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的免疫原性、靶器官體內(nèi)如何高效轉(zhuǎn)導(dǎo)。通過對AAV載體衣殼蛋白的修飾能夠減低體內(nèi)抗體的中和作用,從而降低免疫原性。本研究獲得具有高效神經(jīng)膠質(zhì)瘤親和性和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞感染性新型AAV血清型,且中和抗體分布較低。此新型血清型對膠質(zhì)瘤的治療有重要意義。

目前已有相關(guān)研究表明AAV5在眼睛、肺和神經(jīng)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率優(yōu)于其他血清型[13-15],AAV8則表現(xiàn)出突出的肝臟轉(zhuǎn)導(dǎo)優(yōu)勢,有研究團隊由此開發(fā)出用于改善胰島素基因治療糖尿病的肝臟特異性Tet-off AAV8載體[16]。AAV8的肌肉親和性也表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景[17]?，F(xiàn)有研究表明,AAV9在全身組織和器官中都有廣泛的表達(dá)。由于AAV9具有可以穿越血腦屏障的特性[18-19],所以在神經(jīng)系統(tǒng)的相關(guān)研究中AAV9是較受歡迎的病毒載體之一。目前在野生的AAV中尚缺乏理想的血清型能夠?qū)Χ喾N腫瘤細(xì)胞有較高的基因遞送效率,這是AAV在腫瘤治療方面應(yīng)用受到限制的一個重要原因。然而本研究中新型的AAVX01對于至少兩種神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞有相對優(yōu)異的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,使其具有成為抗腫瘤藥物載體的潛力,因此可遞送多種例如抗腫瘤單抗,雙特異性抗體,自殺基因,RNAi等藥物并維持它們在體內(nèi)的穩(wěn)定表達(dá),為腫瘤的治療提供更多的選擇。

有團隊也對AAV5在神經(jīng)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率進行了研究,在雌性Wistar大鼠采用背根神經(jīng)元直接注射的方式,比較了不同血清型腺相關(guān)病毒(AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6 和 AAV8) 載體對初級感覺神經(jīng)元的轉(zhuǎn)染效果,發(fā)現(xiàn) AAV5 的轉(zhuǎn)染效果最佳[20]。已有研究表明,AAV2優(yōu)先轉(zhuǎn)導(dǎo)神經(jīng)元而AAV5同時轉(zhuǎn)導(dǎo)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞[21]。早在2003年,有學(xué)者就已經(jīng)在研究AAV8介導(dǎo)的可溶性VEGF受體向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的基因傳遞治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤,在研究過程中發(fā)現(xiàn),由于rAAV載體的表達(dá)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)是穩(wěn)定和長期的[22],因此抗VEGF治療存在反饋機制。這表明對神經(jīng)膠質(zhì)瘤高親和性的新型AAVX01血清型介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移,有希望在中樞神經(jīng)系統(tǒng)持續(xù)表達(dá)一種有效的腫瘤抑制,但其療效可能會同時受限于機體的反饋機制,如何將對神經(jīng)膠質(zhì)瘤高親和性的新型AAVX01載體所攜帶的抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤基因的作用進行優(yōu)化,將成為動物實驗和臨床實驗的重點。隨著對rAAV研究的深入,會有更多、更安全的rAAV載體出現(xiàn),具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。