董文亮 喻 元 羅偉楷 楊慧霞 郭文卓 張 敬

慢性根尖周炎（chronic apical periodontitis ,CAP）是一種常見的由根管內(nèi)的微生物感染和宿主對根尖周組織的免疫反應(yīng)引起的炎癥反應(yīng)性疾病[1]，臨床上表現(xiàn)為根尖周結(jié)締組織的破壞和骨吸收[2]。糖尿病是一種常見且嚴重危害人類健康的慢性內(nèi)分泌代謝疾病[3]，其中2型糖尿病占糖尿病患者的90%以上[4]。糖尿病與口腔健康密切相關(guān)，可導(dǎo)致多種口腔并發(fā)癥，如牙周病、齲病、牙髓根尖周病等，糖尿病患者口腔疾病的發(fā)病率較正常人有明顯增高[5～7]。

本研究通過對比Wnt3a/β-Catenin途徑下OPG（osteoprotegerin）/RANKL（receptor activator of nuclear factor-κB ligand）/RANK（receptor activator of NFκB）系統(tǒng)在慢性根尖周炎及慢性根尖周炎合并2 型糖尿病患者根尖周組織中的表達是否存在差異，從而為探究糖尿病對慢性根尖周炎發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生的影響提供依據(jù)。

材料與方法

1.研究對象及分組

利用隨機數(shù)表法隨機選擇2019 年12 月～2021年12 月在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院口腔醫(yī)院拔牙且符合慢性根尖周炎診斷標準[8～10]的患者作為研究對象。對照組（20 例）：因正畸減數(shù)而拔除的健康牙齒牙周膜組織；實驗組1（20 例）：慢性根尖周炎患者患牙根尖周病損軟組織；實驗組2（20 例）：慢性根尖周炎合并2 型糖尿病患者患牙根尖周病損軟組織。實驗方案已通過醫(yī)院倫理委員會批準（2018-55），簽署知情同意書。

CAP 納入標準:①符合慢性根尖周炎診斷[8～10]，無治療價值，拔牙指征明確的患牙；②能順利獲取患牙根尖周相連的病變軟組織；③X 線片明確根尖周有骨質(zhì)破壞，根尖周指數(shù)[9]（periapical index,PAI）分級≥3級。（圖1）

圖1 PAI指數(shù)的參考影像圖及解剖圖[9]

2型糖尿病納入標準：①符合2型糖尿病診斷[4,5]且病程1 年以上、空腹血糖≤8.88 mmol/L 者；②無合并中風(fēng)、心絞痛、心肌梗死、糖尿病腎病等嚴重糖尿病并發(fā)癥。

排除標準：①牙周牙髓聯(lián)合病變者；②除糖尿病外，全身患有其他系統(tǒng)性疾病者；③3 個月內(nèi)有抗生素、非甾體類抗炎藥等局部或全身用藥史；④妊娠期患者及不能耐受拔牙手術(shù)者；⑤根管治療中/曾有根管治療史的患牙；⑥向患者說明研究目的后，不愿意參與、無法完成隨訪者。

2.標本采集與制備

根據(jù)實驗分組拔出牙齒后，無菌刀片刮除對照組根尖區(qū)牙周膜、實驗組根尖周病變組織，立即固定于10%中性緩沖福爾馬林12～48 h，經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明化，石蠟包埋，制備連續(xù)切片（厚度4μm）。

3.試劑與設(shè)備

一抗：Wnt3a 兔抗人多克隆抗體（Gene Tex，美國），β-Catenin，OPG，RANKL 兔抗人多克隆抗體（ABconal，中國武漢）；二抗：PV9000 試劑盒（鼠/兔，北京中杉金橋公司）；光學(xué)顯微鏡（Olympus，日本）；H&E 染色試劑盒、DAB 顯色試劑盒（北京九州柏林生物科技有限公司）。

4.H&E染色及計分

將各組樣本按H&E 染色試劑盒說明書對病理連續(xù)切片完成H&E 染色。每樣本隨機選取3 個連續(xù)視野，顯微鏡下觀察樣本炎癥浸潤程度計分：輕度炎癥（炎癥細胞＜視野中細胞數(shù)量的1/3，計1 分）；中度炎癥（視野中細胞數(shù)量的1/3≤炎癥細胞≤視野中細胞數(shù)量的2/3，計2 分）；重度炎癥（炎癥細胞＞視野中細胞數(shù)量的2/3，計3分）[11]。

5.免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判定

切片脫蠟水化后，PBS洗3次（5分鐘/次）。微波熱修復(fù)抗原，室溫冷卻，過氧化酶阻斷溶液室溫下孵育10 分鐘，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。PBS 洗3次。每張切片滴加50 μL 正常非免疫動物血清（羊），37℃恒溫箱封閉60 分鐘，擦去多余血清。每張切片分別滴加一抗50 μL，4℃過夜（稀釋比例1∶100）。室溫復(fù)溫60 分鐘，PBS 洗3 次，滴加反應(yīng)增強液50 μL，室溫下孵育20 分鐘。PBS 洗3 次。滴加50 μL 二抗（山羊抗兔IgG 聚合物）溶液，室溫下孵育20 分鐘。PBS 洗3 次。每張切片滴加100 μL DAB 顯色，顯微鏡下掌握染色程度，自來水洗滌5分鐘，蘇木精復(fù)染、自來水沖洗、無水乙醇脫水干燥、二甲苯透明，中性樹膠封片。

光鏡下觀察、拍照、結(jié)果判定：以染色強度結(jié)合陽性細胞百分比綜合計分。①染色強度計分：以多數(shù)細胞呈現(xiàn)的染色特性（染色深淺與背景著色對比）計分，無著色為0 分；淡黃色為1 分；棕黃色為2 分；棕褐色為3 分[12]。②陽性細胞百分比計分：以（某類細胞）5 個400 倍視野的陽性細胞平均數(shù)計分，0～5%為0 分；6%～25%為1 分；26%～50%為2 分；51%～75%為3分；＞75%為4分。每張切片隨機取5個400倍視野，每個視野進行染色強度計分與陽性細胞百分比計分，二者乘積0 分為陰性（-）；1～4 分弱陽性（+）；5～8 分中度陽性（++）；9～12 分強陽性（+++）[12]。該結(jié)果由一名高年資病理醫(yī)生進行雙盲評分（Kappa 值＞0.81），觀察3 次，取其均值作為各樣本最終得分。

6.統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS25.0 軟件分析處理，計量資料（免疫組織化學(xué)染色結(jié)果）采用t檢驗，計數(shù)資料（H&E 染色炎癥浸潤程度計分）采用卡方檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，其中兩兩樣本之間相互比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異具有顯著性。

結(jié) 果

1.H&E染色結(jié)果

光學(xué)顯微鏡下進行觀察，牙周膜組織經(jīng)組織病理分析為健康牙周膜組織，無明顯炎性細胞浸潤，為正常對照組（圖2A）。實驗組1與實驗組2根尖周病損軟組織中均可見大量炎癥細胞浸潤，根據(jù)其炎癥浸潤程度分為輕、中、重度炎癥[11]（圖2B、C、D）；對兩組進行炎癥浸潤程度計分統(tǒng)計，結(jié)果顯示慢性根尖周炎合并2 型糖尿病組炎癥浸潤程度得分大于慢性根尖周炎組（χ2=8.139，P=0.0171＜0.05）（表1）。

表1 慢性根尖周炎組及慢性根尖周炎合并2型糖尿病組炎癥浸潤程度計分情況

圖2 H&E染色炎癥程度分級（×400）

2.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

對照組、實驗組1、實驗組2均檢測到Wnt3a、β-Catenin、OPG、RANKL 主要染色位于細胞質(zhì)、細胞核中。對照組中Wnt3a 強陽性表達，β-Catenin未見表達，其余均少量表達（圖3）。在實驗組1、實驗組2中，四種因子集中在中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞等炎癥細胞的細胞核、細胞質(zhì)中表達（圖4、5）。

圖3 對照組牙周膜（成纖維細胞的細胞質(zhì)）中Wnt3a、β-Catenin、OPG、RANKL的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（×400）

圖4 實驗組1根尖周病損軟組織（炎癥細胞的細胞核、細胞質(zhì)）中Wnt3a、β-Catenin、OPG、RANKL的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（×400）

圖5 實驗組2根尖周病損軟組織（炎癥細胞的細胞核、細胞質(zhì)）中Wnt3a、β-Catenin、OPG、RANKL的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（×400）

3.Wnt3a、β-Catenin在各組中的表達情況

Wnt3a、β-Catenin在對照組、實驗組1、實驗組2中陽性表達。Wnt3a 在實驗組1 中的表達水平低于對照組，比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)；在實驗組2 中的表達水平高于對照組與實驗組1，較對照組無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，與實驗組1 比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。β-Catenin在實驗組1、實驗組2 中的表達水平均高于對照組且比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。（表2）

表2 Wnt3a、β-Catenin在各組中的表達水平（±s）

注：#與對照組比較，P＜0.05；*與實驗組1比較，P＜0.05。

組別對照組實驗組1實驗組2 n 20 20 20 Wnt3a 10.37±2.41 8.37±4.17 12.83±3.95*β-Catenin 0±0 4.55±3.05#6.01±1.45#

4.OPG、RANKL、RANKL/OPG 在各組中的表達情況

OPG、RANKL 在各組中均陽性表達。OPG、RANKL、RANKL/OPG 在對照組、實驗組1、實驗組2中表達水平呈升高趨勢，OPG 與RANKL/OPG 在各組間比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，RANKL 在實驗組1、實驗組2的表達與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。（表3）

表3 OPG、RANKL在各組中的表達水平及RANKL/OPG 的比值變化（±s）

表3 OPG、RANKL在各組中的表達水平及RANKL/OPG 的比值變化（±s）

注：#與對照組比較，P＜0.05；*與實驗組1比較，P＜0.05。

組別對照組實驗組1實驗組2 n 20 20 20 OPG 2.74±0.52 7.26±2.63#11.19±3.46#*RANKL 1.38±2.33 9.25±2.12#12.77.±1.74#RANKL/OPG 0.64±1.57 1.27±1.61#1.91±0.79#*

討 論

慢性根尖周炎是根管內(nèi)長期存在感染及病原刺激物而導(dǎo)致的根尖周圍組織慢性炎癥反應(yīng)。局部且長期存在的炎癥反應(yīng)可以激活破骨細胞，進而啟動骨吸收，且骨形成受阻，導(dǎo)致骨穩(wěn)態(tài)的破壞[13,14]。Wnt3a/β-Catenin途徑和OPG/RANKL/RANK 系統(tǒng)在骨代謝中起到重要作用[15,16]，在慢性根尖周炎及其他慢性疾病中的發(fā)生發(fā)展中均有表達[17～19]。它們參與調(diào)控成骨及破骨因子，并且與2 型糖尿病的胰島素水平相關(guān)[20]。通過藥物調(diào)控Wnt信號通路可能影響胰島素水平，減少糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生[21,22]。在本研究中，H&E 染色結(jié)果表明在慢性根尖周炎合并2 型糖尿病組中炎癥浸潤的程度明顯高于慢性根尖周炎組（P＜0.05），這與現(xiàn)有研究結(jié)果相一致，原因可能是糖尿病可直接影響免疫系統(tǒng)功能，導(dǎo)致愈合率下降和免疫功能延遲[23]。高水平的晚期糖基化終末產(chǎn)物會增加組織氧化應(yīng)激并上調(diào)炎癥反應(yīng)[24]。臨床研究也表明，糖尿病會降低根管治療的成功率[25]，同時也會增加患者診間急癥的發(fā)生率以及病變的嚴重程度[23,26]，但具體機制還有待進一步的探索。

Wnt3a 是Wnt 信號通路中一個天然抑制劑，在炎癥反應(yīng)中可以通過抑制促炎因子來控制炎癥反應(yīng)[27]，通過Wnt3a/β-Catenin信號通路促進成骨細胞的形成[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，Wnt3a 在對照組成纖維細胞中表達呈強陽性，β-Catenin未見明顯表達?？赡苡捎谠趯φ战M（健康牙周膜）中，Wnt3a 還參與其他信號通路的調(diào)節(jié)而未激活Wnt/β-Catenin通路[29]。而在慢性根尖周炎組與慢性根尖周炎合并2 型糖尿病組中Wnt3a、β-Catenin均呈陽性表達，Wnt3a 在慢性根尖周炎合并2 型糖尿病組中表達量更高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與本研究前述的炎癥浸潤嚴重程度和Chen 等[30]在動物研究中的研究結(jié)果相符合。說明Wnt3a 借助Wnt信號通路在炎癥反應(yīng)中參與抑制促炎因子的產(chǎn)生，發(fā)揮抑制骨吸收、促進骨形成等作用[30]。

細胞質(zhì)內(nèi)的β-Catenin升高并轉(zhuǎn)運至細胞核內(nèi)，這是Wnt 經(jīng)典信號通路活化的標志。本研究中，慢性根尖周炎組和慢性根尖周炎合并2 型糖尿病組中β-Catenin的表達量均較對照組增高，且具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），與Wnt3a 的升高相一致，表明由于炎癥刺激Wnt/β-Catenin通路被激活。值得注意的是，本研究中β-Catenin的表達在慢性根尖周炎合并2型糖尿病組中較慢性根尖周炎組升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。分析其原因可能是機體高糖環(huán)境下對β-Catenin的抑制與重度炎癥對β-Catenin的激活同時存在、相互抵消，進而導(dǎo)致其表達量無明顯升高[17,31]，具體原因及機制需進一步實驗進行深入研究。

RANKL和OPG在骨穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用，破骨細胞的形成和激活受到RANKL/RANK/OPG 軸的重要調(diào)控[32]。Wnt/β-Catenin信號能夠刺激成骨細胞上調(diào)OPG 表達，改變RANKL/OPG 的比值，抑制破骨細胞分化和活性，從而抑制骨吸收[15,32]。慢性根尖周炎是一種以根尖周牙槽骨破壞為主要表現(xiàn)的疾病，而糖尿病患者因其微血管病變及免疫系統(tǒng)的變化，對慢性根尖周炎局部骨穩(wěn)態(tài)破壞產(chǎn)生影響。故認為RANKL/RANK/OPG 軸作為慢性根尖周炎合并2型糖尿病患者的研究切入點是有意義的。

本研究針對慢性根尖周炎組、慢性根尖周炎合并2 型糖尿病根尖周病變軟組織切片中OPG、RANKL 在炎癥細胞中表達情況進行分析，其表達水平均明顯高于對照組，OPG 在慢性根尖周炎合并2型糖尿病組中表達水平明顯高于對照組和慢性根尖周炎組，而RANKL 在慢性根尖周炎合并2 型糖尿病組中的表達水平高于慢性根尖周炎組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與Moh、Mantovani 等人的研究結(jié)果相符合，即與正常血糖組相比，2 型糖尿病患者的血清OPG 水平顯著增加，而RANKL 水平?jīng)]有變化[20,33]。分析原因可能是糖尿病狀態(tài)下RANKL/RANK/OPG軸啟動，OPG 在炎癥細胞中表達快速增高，OPG 對RANKL 信號的阻斷，導(dǎo)致細胞中RANKL 升高不明顯。雖然OPG 的上升會對破骨細胞的分化成熟起到抑制作用，但炎癥的遷延不愈導(dǎo)致骨穩(wěn)態(tài)持續(xù)破壞，骨吸收增加，同時糖尿病導(dǎo)致的局部微血管病變，也會導(dǎo)致炎癥反應(yīng)持續(xù)加重，并繼發(fā)成骨細胞功能受損及活性降低，最終導(dǎo)致OPG 對破骨細胞活性抑制減弱，使慢性根尖周炎合并2 型糖尿病患者局部癥狀加重，根尖周骨質(zhì)破壞增大。基于以上研究結(jié)果，我們猜想糖尿病及慢性根尖周炎在局部病變中通過Wnt/β-Catenin途徑中的不同程度表達，調(diào)控OPG 及RANKL 的相關(guān)表達。這可能不僅與慢性根尖周炎的局部炎癥刺激有關(guān)，同時也受糖尿病對全身機體免疫系統(tǒng)及白細胞趨化的影響[34]。

在實驗方法上，本研究采用H&E 染色以及半定量的免疫組織化學(xué)方法對炎癥浸潤程度和Wnt3a、β-Catenin、OPG、RANKL 的表達水平進行分析統(tǒng)計，主要考慮該方法具有特異性強、敏感性高、定位準確等特點，同時對組織樣本的取材時間、組織量、儲存條件等要求相對較低，操作較易。但結(jié)果受標本取材、視野選擇、計分統(tǒng)計等方面的影響存在一定主觀性、偶然性和局限性；檢測目標蛋白表達量的結(jié)果精確度較qPCR、Western-Blot[11,16]等定量檢測分析欠佳。提示筆者在未來進一步研究中利用動物模型控制標本取材的一致性，采用qPCR、Western-Blot等更為客觀、精確、有效的方法檢測目標蛋白的表達量。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，慢性根尖周炎根尖周組織炎癥浸潤程度及Wnt3a、β-Catenin、OPG、RANKL的表達水平與慢性根尖周炎患者是否患有2型糖尿病有關(guān)，提示2 型糖尿病在慢性根尖周炎的發(fā)生發(fā)展過程中起到一定作用。在局部病變中，2型糖尿病對慢性根尖周炎的影響表現(xiàn)在發(fā)病率的增高、并發(fā)癥增加及成功率降低[25,26]。但是目前1型糖尿病及2 型糖尿病兩種分型對局部病變是否會產(chǎn)生不同影響、對于慢性根尖周炎影響的通路及因子尚待進一步實驗驗證。