馮 良 尹 克 張素欣 陳 中 包 陽 李天客

口腔癌是發(fā)生在口腔的惡性腫瘤。2010 年，美國疾病控制中心統(tǒng)計(jì)表明，在全球每年約有50 萬人患口腔癌，導(dǎo)致約1.2 萬人死亡[1]。其中發(fā)展中國家的發(fā)病率高于發(fā)達(dá)國家?？谇活M面部的惡性腫瘤在我國以舌癌、牙齦癌、頰癌等較為常見，由于特殊的部位，對患者術(shù)后功能和心理的影響巨大[2～5]。雖然口腔癌在我國的發(fā)病率低，但由于人口基數(shù)很大，每年有近4.65 萬例新發(fā)病例[6]。至今口腔癌的病因尚不清楚，但研究表明，吸煙、飲酒、口腔衛(wèi)生差、飲食和免疫狀況等因素與口腔癌有關(guān)[7～9]。近年來，隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)的發(fā)展，相關(guān)研究人員從分子角度和基因表達(dá)等微觀層面進(jìn)行了一系列研究，從而使腫瘤的發(fā)病機(jī)制更加明了，其中免疫因素備受學(xué)者的關(guān)注[10，11]。

T淋巴細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞之一[12，13]，其產(chǎn)生于胸腺，當(dāng)初始T 細(xì)胞進(jìn)入外周淋巴器官或淋巴組織后，一旦接觸了抗原提呈細(xì)胞提呈的、與抗原受體相匹配的抗原肽，它們便代謝活躍并增殖分化[14]。當(dāng)再次與相同的抗原相遇時，它們會迅速轉(zhuǎn)化繁殖，形成大量的效應(yīng)T 細(xì)胞，從而引發(fā)更強(qiáng)的免疫反應(yīng)，使機(jī)體對抗原保持長期免疫[15，16]。

惡性腫瘤是降低人類生活質(zhì)量和生存時間的重要原因之一。機(jī)體自身的抗腫瘤免疫系統(tǒng)通過免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子等參與對腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)測和殺害，在抗腫瘤免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用[17]。目前，手術(shù)仍然是口腔癌治療的主要手段。因此，研究口腔癌除手術(shù)治療外的免疫治療，對口腔癌患者更好的康復(fù)具有重要意義，免疫治療也是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。相關(guān)研究表明，PD-1免疫治療頭頸部鱗狀細(xì)胞癌有較大影響[18]。晚期頭頸部鱗癌患者行PD1 抑制劑治療,能夠順利完成治療。Pembrolizumab（PD1 抑制劑）對治療復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）有效[19]。但是直到現(xiàn)在，PD1 免疫治療對口腔癌患者T細(xì)胞免疫功能的影響尚不清楚。

因此,本研究擬通過流式細(xì)胞術(shù)檢測口腔癌患者PD1 免疫治療前后外周血T 淋巴細(xì)胞各個亞群的表達(dá)情況,探索腫瘤患者的免疫系統(tǒng)變化和T 淋巴細(xì)胞各表型在口腔癌癥免疫療法的預(yù)測功能,為口腔癌免疫治療的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

材料和方法

1.患者和知情同意

本項(xiàng)目選取2019 年10 月～2020 年9 月在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)的60 例口腔鱗癌患者作為研究對象。

納入標(biāo)準(zhǔn)：18 歲＜年齡＜80 歲；入院前未進(jìn)行抗腫瘤治療；排除全身系統(tǒng)性疾??；臨床分期為Ⅲ期和Ⅳ期。

排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡＜18 歲或者年齡＞80 歲；患有其他相關(guān)病癥或已經(jīng)進(jìn)行相關(guān)治療。

60例病人進(jìn)行PD1免疫治療。PD1是免疫檢查點(diǎn)抑制劑（Immune-checkpoint inhibitors，ICIs）的一種。PD1 治療采用靜脈注射的方式進(jìn)行，每次持續(xù)至少30 分鐘。免疫治療病人分別于治療前兩天及治療后20天采取新鮮外周血1 ml，肝素抗凝。

術(shù)后2 周后合并化療一起應(yīng)用PD1 免疫治療，每三周做一次，合并化療六個周期，六個周期后單藥應(yīng)用直達(dá)兩年。帕博利珠單抗的劑量為：200 mg 每3周一次。

試驗(yàn)經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院人體倫理委員會批準(zhǔn)（倫理批號：2022KY408），并獲得患者及其家屬的書面同意。

2.免疫功能指標(biāo)檢測

使用流式細(xì)胞儀檢測CD4+T 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞在T 淋巴細(xì)胞中的百分比，計(jì)算CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞的比值。流式細(xì)胞儀-EPICS XL（美國BECKMAN-COULTER 公司)及其配套的計(jì)算機(jī)軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，SZ-1 型快速混勻器，超凈工作臺（美國BIOLOGICAL Safety Cabinets ClassII）。鼠抗人CD4-FITC、CD8-PE 單克隆抗體，紅細(xì)胞裂解液，PBS等。

3.流式細(xì)胞儀檢測條件及參數(shù)

Epics-XLII 型流式細(xì)胞儀產(chǎn)自美國Beckerman Coulter 公司，激發(fā)光源為15 mW 氬離子激光器，激發(fā)波長為488 nm。免疫熒光數(shù)據(jù)采用Expo32ADC進(jìn)行分析，將儀器CV 值調(diào)整在2% 以內(nèi)，flowcheckTMFlourpheres（10 μm）熒光微球（REF 6605359 Beckman Coulter，Inc.Fullerton，CA92835）作為檢測前的標(biāo)準(zhǔn)樣品。

4.ELISA法檢測血液中IFN-γ和IL-2水平

采用人IFN-γ 試劑盒(貨號：ab174443，公司：abcam，規(guī)格：1*96 test)和人IL-2 試劑盒（貨號：PD2050, 公司：Bio-Techne China Co.Ltd.，規(guī)格：1*50 plates）。根據(jù)說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)流程操作。處理血液配制標(biāo)準(zhǔn)品，加樣（標(biāo)準(zhǔn)品及樣本），洗板，加檢測抗體溶液，孵育，洗板，加酶溶液，孵育，洗板，加入TMB 底物，加入50 μl 終止液，立即450 nm 讀數(shù)（雙抗夾心法），有樣本OD 值代入標(biāo)曲中計(jì)算出濃度，結(jié)果以EXCEL形式發(fā)出。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。配對T檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組內(nèi)的比較，采用方差分析進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組與對照組間的比較。P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.60例口腔癌患者的基線數(shù)據(jù)

共納入60 例患者，其中男性患者32 例，女性患者28例；65歲以下患者34例，65歲以上（包含65歲）患者26例；腫瘤直徑小于3 cm患者45例，大于或等于3 cm 患者15 例；Ⅲ期患者14 例，Ⅳ期患者46 例；無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者37 例，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者23 例；無淋巴結(jié)受累患者30 例，淋巴結(jié)受累患者30 例；TNM 分期Ⅰ期患者6 例，Ⅱ期患者12 例，Ⅲ 期患者18 例，Ⅳ期患者24例（表1）。

表1 60例接受PD1治療的口腔癌患者的基本信息

2.PD1治療前后的免疫功能變化

在PD1 治療后，口腔癌患者血液中IFN-γ 的含量顯著升高，由0.347±0.112 升高為1.047±0.113（P＜0.001）；在PD1治療后，口腔癌患者血液中IL-2 的含量顯著升高，由1.916±0.657 升高為3.931±0.555（P＜0.001）；在PD1治療后，口腔癌患者血液中CD4+T 細(xì)胞百分比的含量顯著升高，由9.809±1.851 升高為23.720±3.873（P＜0.001）；在PD1 治療后，口腔癌患者血液中CD8+T 細(xì)胞百分比的含量顯著降低，由50.841±2.858 降 低 為13.095±2.871（P＜0.001）；在PD1 治療后，口腔癌患者血液中CD4/CD8+T 細(xì)胞比例的含量顯著升高，由0.194±0.038 升高為1.895±0.552（P＜0.001）。綜上所見，口腔癌患者在接受PD1免疫治療之后，患者的免疫功能明顯提升，PD1治療口腔癌效果顯著（表2）。

表2 60例口腔癌患者在接受PD1治療前后的免疫功能變化

表3 60例口腔癌患者在接受PD1治療前后的臨床效果

3.PD1治療前后的臨床效果對比

在PD1 治療后，口腔癌患者吞咽困難的癥狀明顯減輕，由治療前的75.0%的吞咽困難發(fā)生率降低為11.7%（P＜0.001）。PD1治療前的口腔黏膜炎的發(fā)生率為86.7%，PD1治療后其發(fā)生率降低為10.0%（P＜0.001）。在PD1 治療后，口腔癌患者口干的癥狀明顯減輕，由治療前的80.0%的發(fā)生率降低為15.0%（P＜0.001）。PD1 治療前的疲勞的發(fā)生率為88.3%，PD1 治療后其發(fā)生率降低為8.3%（P＜0.001）。PD1治療前的頭痛的發(fā)生率為78.3%，PD1 治療后其發(fā)生率降低為18.3%（P＜0.001）。

討 論

有研究表明，人體的抗腫瘤免疫主要是以細(xì)胞免疫為主，T 淋巴細(xì)胞為核心，由于T 淋巴細(xì)胞各亞型在抗腫瘤免疫中發(fā)揮的作用不同，所以各亞型T淋巴細(xì)胞在外周血中的分布反映了機(jī)體抗腫瘤免疫的情況[17]。研究得出，肝癌浸潤淋巴細(xì)胞與癌旁組織相比，存在CD4/CD8 倒置、CD8 陽性T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞和NKT 細(xì)胞含量減少的情況，提示主要抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞含量降低。肝細(xì)胞癌與癌旁組織中的淋巴細(xì)胞基因表達(dá)存在差異[20]。研究得出，檢測胃癌、腸癌、肺癌、乳腺癌和肝癌患者的外周血T 細(xì)胞亞群對確定臨床療效和預(yù)后具有重要的臨床意義[21]。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞胞外酶CD73 表達(dá)量高，而CD39 表達(dá)量低；與外周血相比，膠質(zhì)瘤浸潤的CD4+T 淋巴細(xì)胞CD39 表達(dá)明顯上調(diào)，而CD73 表達(dá)沒有明顯差異。膠質(zhì)瘤的CD73 和CD4+T 淋巴細(xì)胞的CD39 可以協(xié)同作用，誘導(dǎo)腺苷介導(dǎo)的應(yīng)答性T 細(xì)胞擴(kuò)增的抑制[22]。膠質(zhì)瘤組織中CD73 的表達(dá)與患者的預(yù)后相關(guān)，CD73 可能是膠質(zhì)瘤新的免疫治療靶點(diǎn)。CD4+和CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞是最近才被認(rèn)識的一類免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，因其強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)作用被稱為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）[23]。Treg源自于胸腺，發(fā)揮抑制性免疫調(diào)節(jié)的作用，持續(xù)表達(dá)IL-2Rα 鏈（CD25），具有免疫無能和免疫抑制性兩種特征，可抑制自身免疫性疾病，誘導(dǎo)對移植物的免疫耐受。抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答的發(fā)生以及CD4+CD25-和CD8+T 細(xì)胞的激活和增殖。因此，自身免疫性疾病的治療、腫瘤免疫治療和移植耐受誘導(dǎo)等方面具有潛在的應(yīng)用價值[24,25]。

當(dāng)前，癌癥免疫療法著力于增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對癌細(xì)胞的識別能力和殺傷能力，主要靠調(diào)控免疫系統(tǒng)的T 淋巴細(xì)胞，即通過激活人體自身的免疫系統(tǒng)，使其更為有效地進(jìn)攻癌細(xì)胞[26]。目前主要有三種免疫治療策略，分別為細(xì)胞免疫治療（如樹突細(xì)胞治療）、細(xì)胞因子治療（治療腎細(xì)胞癌的白介素-2 等）和單克隆抗體治療[27]。

其中，自身免疫細(xì)胞治療技術(shù)是指將單個核細(xì)胞從患者自身的外周血和其他細(xì)胞中分離出來，經(jīng)過專項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)胞的活化與增殖后，回輸入患者體內(nèi)，直接殺死腫瘤細(xì)胞或病毒感染的細(xì)胞，同時發(fā)揮調(diào)節(jié)和增強(qiáng)人體免疫功能的作用[28]。伴隨自身免疫細(xì)胞治療技術(shù)的發(fā)展，利用細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine induced killer cell，CIK 細(xì)胞）治療惡性腫瘤的臨床試驗(yàn)層出不窮，自體免疫細(xì)胞治療技術(shù)快速高效且副作用小，相比其他治療腫瘤技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀和發(fā)展，細(xì)胞免疫治療技術(shù)是最有希望成為完全消滅癌細(xì)胞的腫瘤技術(shù)[29]。

本研究得出PD1免疫治療可減輕口腔癌患者經(jīng)過放化療等治療產(chǎn)生的巨大的毒副作用，避免手術(shù)切除對患者的身心健康造成的沉重打擊，同時不破壞患者的免疫功能。有研究表明，可以通過阻斷PD1 治療晚期皮膚鱗狀細(xì)胞癌[30]。本研究成果可有效幫助提高口腔癌患者的早期診斷、治療效果，具有良好的預(yù)測作用，為口腔癌患者的臨床治療提供幫助，改善患者預(yù)后，同時可降低手術(shù)率，節(jié)約醫(yī)療費(fèi)用。

結(jié)論：綜上所述，運(yùn)用PD1 免疫治療口腔癌患者，治療前后患者T 細(xì)胞免疫功能明顯增強(qiáng)，對患者有一定的治療效果，具有一定的臨床應(yīng)用價值與應(yīng)用前景，為臨床上應(yīng)用針對口腔癌的免疫治療提供理論依據(jù)。