麥天倩 李春年 許明明

活髓保存術(shù)[1]是一種微創(chuàng)的牙髓病療法，包括蓋髓術(shù)和牙髓切斷術(shù)，原理是利用牙髓的修復(fù)防御機制保存剩余健康牙髓的活力，其中蓋髓材料的選擇與治療效果密切相關(guān)。無機三氧化物聚合物(mineral trioxide aggregate，MTA)是目前臨床上使用最多的生物陶瓷類蓋髓劑，與氫氧化鈣相比，MTA蓋髓后牙髓炎癥反應(yīng)更輕，可誘導(dǎo)形成更為成熟的牙本質(zhì)橋[2]。CGF 是最新一代自體血小板濃縮生物制劑，含有天然的纖維蛋白支架和多種生長因子[3]，具有促進(jìn)創(chuàng)口愈合、硬軟組織形成和暫時性支架保護(hù)作用[4]，可通過多條信號通路調(diào)控牙髓干細(xì)胞的礦化[5]，提示CGF 在活髓保存術(shù)中作為蓋髓材料具有較大的潛能。

本研究通過將MTA、CGF 聯(lián)合應(yīng)用作為蓋髓材料進(jìn)行大鼠磨牙直接蓋髓，觀察兩者聯(lián)合應(yīng)用對修復(fù)性牙本質(zhì)橋形成及DSPP表達(dá)的影響，以期為活髓保存術(shù)蓋髓材料的選擇提供新的思路和實驗參考。

材料與方法

一、主要實驗材料

1.實驗動物

SD 雄性大鼠16 只（4 w，150±5 g），Blab/c 雌性裸鼠16只(6 w，20±5 g，SPF級），由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，檢疫合格，飼養(yǎng)由河北省口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室提供。實驗研究方案通過河北醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查【(2020】027)。

2.主要實驗試劑

ProRoot MTA（登士柏，美國），4%多聚甲醛固定液（蘭杰柯，中國），10%EDTA（雷根，中國），Masson染色液試劑盒（雷根，中國）,兔抗大鼠DSPP 抗體(圣克魯斯，美國),免疫組化試劑盒、DAB 試劑盒（中杉金橋，中國）。

二、實驗方法

1.CGF膜的制備

采集健康志愿者肘部靜脈血10 ml 注入專用試管中，使用Medifuge離心機離心，離心后從上到下分為3 層：血漿層、CGF 凝膠層、紅細(xì)胞層。從試管中取出CGF 凝膠層和紅細(xì)胞層,用眼科剪將兩層分離，將CGF 凝膠層置于兩層無菌紗布中擠出所有可視流動血清得到CGF 膜，再裁剪成合適大小后置于無菌生理鹽水中備用。

2.大鼠磨牙牙冠的獲取

腹腔注射過量0.5%戊巴比妥鈉處死大鼠，手術(shù)分離下頜骨置于75%酒精中15 秒；無菌PBS 沖洗下頜骨3次，每次3分鐘；分離雙側(cè)第一磨牙，刀片刮凈牙頸部的牙齦組織及牙周膜，置于無菌PBS 溶液中漂洗3 次，每次3 分鐘；手術(shù)刀片將磨牙自牙頸部截斷，保留牙冠及冠髓，置于新鮮DMEM液內(nèi)備用。

3.實驗分組及直接蓋髓模型構(gòu)建

根據(jù)蓋髓材料的不同將牙冠隨機分為：空白對照組、MTA 組、CGF 組、MTA+CGF 組，蓋髓材料與大鼠磨牙牙冠復(fù)合物的構(gòu)建參考以往文獻(xiàn)報道[6]。

(1)空白對照組：牙髓斷面不放置任何材料。

(2)MTA 組：MTA 按說明書調(diào)拌好后覆蓋于牙髓斷面，厚度約為0.5 mm；

(3)CGF組：將裁剪好的CGF膜置于牙髓斷面；

(4)MTA+CGF 組：先將CGF 膜置于牙髓斷面，后在其上放置MTA。

4.裸鼠皮下埋植實驗

使用0.5%戊巴比妥鈉，以30 mg/kg的比例對裸鼠進(jìn)行腹腔麻醉，角膜反射消失且四肢肌肉松弛表明麻醉起效；1%碘伏棉簽消毒裸鼠背部皮膚，分別在兩側(cè)近后腿處做5 mm 左右的橫行切口；止血鉗鈍性分離皮下組織形成囊袋；將樣本植入囊袋中，牙髓斷面朝向裸鼠背部肌層，可吸收縫線縫合傷口后再次消毒，裸鼠耳部打孔并做好實驗記錄，待裸鼠蘇醒后放回SPF環(huán)境下繼續(xù)正常飼養(yǎng)，如圖1。

圖1 牙冠裸鼠皮下埋植

5.樣本處理及染色

6 周后處死裸鼠取出樣本，常規(guī)固定、脫鈣、脫水、透明、包埋，制作沿下頜第一磨牙牙體長軸近遠(yuǎn)中方向厚5 μm切片；再進(jìn)行HE染色、Masson染色、DSPP免疫組化染色(具體步驟參考說明書）。

6.牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體質(zhì)量評價

組織學(xué)結(jié)果由兩名觀察者根據(jù)表1[7]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評估,觀察者均不知道實驗方法及目的,主要觀察牙髓斷面處牙本質(zhì)橋的形成及近牙本質(zhì)橋牙髓的炎癥反應(yīng)情況。

表1 組織學(xué)結(jié)果評價標(biāo)準(zhǔn)

7.統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS（version 26.0）統(tǒng)計軟件，對于等級變量采用Kruskal-Wallis 檢驗，內(nèi)部多重比較也采用Kruskal-Wallis 檢驗，P＜0.05 代表具有統(tǒng)計學(xué)意義；數(shù)值型變量進(jìn)行正態(tài)性檢驗，對于非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用Mann-Whitney 檢驗，組間多重比較也采用Mann-Whitney檢驗，P＜0.05代表具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.HE、Masson染色

各組染色結(jié)果如圖2所示。

圖2 體內(nèi)移植6周各組誘導(dǎo)牙髓組織形成牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體

(1)空白對照組：牙髓斷面處無礦化物形成。

(2)MTA 組：牙冠髓腔側(cè)可見一層修復(fù)性牙本質(zhì)形成，牙髓斷面處形成一層較厚的類牙本質(zhì)樣礦化基質(zhì)，與修復(fù)性牙本質(zhì)相結(jié)合，基質(zhì)內(nèi)含有牙本質(zhì)小管樣結(jié)構(gòu)，但形態(tài)不規(guī)整，近髓腔側(cè)可見一層前期牙本質(zhì)；髓腔明顯縮小，牙髓組織正常，其間含有血管，近類牙本質(zhì)處可見一層呈極性分布的成牙本質(zhì)樣細(xì)胞，細(xì)胞呈立方狀或矮柱狀，細(xì)胞突起嵌入到礦化組織中，并達(dá)到基質(zhì)的整個層。

(3)CGF 組：同MTA 組表現(xiàn)基本一致，牙本質(zhì)小管形態(tài)較MTA 組更為規(guī)整，但未見前期牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)，成牙本質(zhì)樣細(xì)胞呈扁平狀。

(4)MTA+CGF 組：同MTA 組表現(xiàn)基本一致，牙本質(zhì)小管形態(tài)規(guī)整，可見前期牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)，成牙本質(zhì)樣細(xì)胞呈高柱狀。

2.牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體形成的質(zhì)量評價

各組樣本根據(jù)牙髓斷面有無硬化物形成及牙髓壞死進(jìn)行分類，結(jié)果如表2 所示。數(shù)據(jù)經(jīng)過等級資料的Kruskal-Wallis 檢驗后分析，結(jié)果如表3 所示，對照組與其他三組存在顯著差異（P＜0.001），而實驗組間無顯著差異（P＞0.05）。

表3 樣本組織學(xué)結(jié)果各組多重比較

3.DSPP免疫組化染色結(jié)果分析

樣本移植6 周后對牙本質(zhì)特異性蛋白DSPP 進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果如圖3 所示，DSPP 主要在成牙本質(zhì)細(xì)胞層及前期牙本質(zhì)表達(dá)，MTA+CGF 組DSPP 陽性表達(dá)明顯強于MTA 組及CGF 組。對各組陽性表達(dá)的AOD 值進(jìn)行定量統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果顯示DSPP 在MTA+CGF 組中表達(dá)最強，各組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.0001），結(jié)果如圖4。

圖3 體內(nèi)移植6周各組DSPP表達(dá)情況

圖4 DSPP免疫組化染色結(jié)果（P＜0.0001）

討 論

MTA 蓋髓后牙髓壞死的樣本數(shù)較CGF 組更多，但兩者之間并無統(tǒng)計學(xué)差異，這可能與蓋髓模型建立的方式有關(guān)，若牙髓斷面處放置過厚的MTA 可能影響牙髓血供從而導(dǎo)致牙髓的壞死。但6 周時CGF組形成的成牙本質(zhì)樣細(xì)胞呈扁平狀，未見明顯的前期牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)形成，而MTA 組的成牙本質(zhì)樣細(xì)胞呈立方狀或矮柱狀，可見明顯的前期牙本質(zhì)，表明此時CGF 組成牙本質(zhì)樣細(xì)胞的活性降低，成牙本質(zhì)能力較MTA組弱。

兩者蓋髓后出現(xiàn)的差異主要原因可能與CGF中生長因子的釋放相關(guān)[8～10]，還有研究發(fā)現(xiàn)CGF 膜在體內(nèi)3 周時即可被完全降解，被新生的纖維結(jié)締組織所取代[11]。因此隨著蓋髓時間的延長，尤其是28 天后，CGF 促進(jìn)牙髓細(xì)胞成牙本質(zhì)向分化能力則會逐漸減弱直至消失。

6 周后顯示MTA+CGF 蓋髓效果較兩者單獨應(yīng)用更為顯著，其誘導(dǎo)形成的類牙本質(zhì)基質(zhì)具有更為典型的牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)，不僅具有前期牙本質(zhì)，其中的牙本質(zhì)小管形態(tài)也較單獨應(yīng)用MTA 更為規(guī)整，同時可見明顯的成牙本質(zhì)細(xì)胞層，成牙本質(zhì)細(xì)胞呈高柱狀，表明其具有更強的成牙本質(zhì)的能力。其中1 個樣本未見鈣化物形成且牙髓壞死，分析其原因可能是聯(lián)合蓋髓樣本在植入后蓋髓物容易移位導(dǎo)致蓋髓失敗。關(guān)于生長因子與生物陶瓷材料聯(lián)合應(yīng)用已多有報道[12，13]，在血小板濃縮物與生物陶瓷材料聯(lián)合應(yīng)用方面，有研究將富血小板纖維蛋白（platelet rich fibrin，PRF）聯(lián)合MTA 用于兔直接蓋髓，組織學(xué)結(jié)果顯示PRF+MTA 作為蓋髓劑用于直接蓋髓術(shù)時，牙髓炎癥反應(yīng)程度較輕，牙髓狀態(tài)較穩(wěn)定且具有較強的鈣化橋形成能力，鈣化橋結(jié)構(gòu)似骨樣牙本質(zhì)[14]。CT 結(jié)果顯示PRF 聯(lián)合MTA 較單獨蓋髓組鈣化物體積更大[15]。本實驗結(jié)果與前期相關(guān)實驗結(jié)果基本一致。

DSPP主要分布于牙齒，是一種由成牙本質(zhì)細(xì)胞高度表達(dá)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白[16]，在細(xì)胞內(nèi)合成后裂解為牙本質(zhì)磷蛋白(dentin phosphoprotein, DPP)和牙本質(zhì)涎蛋白(dentin sialoprotein, DSP),DPP 主要表達(dá)于牙本質(zhì)的礦化前緣[17]，DSP 主要在前期牙本質(zhì)中表達(dá)，在修復(fù)性牙本質(zhì)中少量表達(dá)[18]。DSPP 與牙齒發(fā)育和生物礦化密切相關(guān)，因此通常將DSPP作為成牙向分化的檢測指標(biāo)[19]。本實驗免疫組化結(jié)果顯示DSPP 在MTA+CGF 組中表達(dá)最強，在CGF 組中表達(dá)最弱，在空白對照組基本不表達(dá)，各組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，與組織學(xué)表現(xiàn)出來的結(jié)果相一致。

聯(lián)合應(yīng)用之所以出現(xiàn)更為顯著的效果，原因在于兩者均可促進(jìn)成牙本質(zhì)相關(guān)因子的釋放，起到協(xié)同作用。MTA 在與組織液接觸后發(fā)生水合反應(yīng)轉(zhuǎn)化為氫氧化鈣和水合硅酸鈣從而釋放出Ca2+和OH－[20]。OH－參與了礦化過程的中ALP 和BMP-2的釋放，Ca2+增加細(xì)胞外鈣敏感受體（calciumsensing receptor,CaSR)的活性，上調(diào)DSPP、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白-1（dentin matrix protein-1，DMP-1）、骨鈣蛋白的表達(dá)。CGF 是第三代血小板濃縮物，可釋放豐富的生長因子[21],包括轉(zhuǎn)化生長因子-β1、血管內(nèi)皮生長因子、PDGF 等，這些因子在調(diào)控細(xì)胞增殖及分化、促進(jìn)組織修復(fù)再生、膠原蛋白合成起著重要作用[22]。

綜上，本研究對MTA 聯(lián)合CGF 用于直接蓋髓的可行性和應(yīng)用方式進(jìn)行初步探索,綜合目前的研究結(jié)果顯示，CGF是一種潛在的活髓治療蓋髓材料，其與生物陶瓷材料聯(lián)合直接蓋髓較MTA 或CGF 單獨進(jìn)行直接蓋髓的效果更佳，在活髓保存治療中具有巨大的潛能及應(yīng)用價值。