李唯嘉,榮書玲,李 保

心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)是全球重大的公共健康問題[1]。CVD的病理過程涉及多種細(xì)胞死亡形式,在受到非致死性應(yīng)激或損傷時(shí),心肌細(xì)胞主要發(fā)生程序性心肌細(xì)胞死亡[2]。程序性細(xì)胞死亡作為一種由基因決定的有序、主動(dòng)死亡,包括凋亡、焦亡、鐵死亡和壞死性凋亡(necroptosis)。壞死性凋亡參與了多種CVD的發(fā)病過程,在動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)、心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷、心肌梗死(myocardial infarction,MI)、病理性心室重塑和心力衰竭(heart failure,HF)中發(fā)揮重要作用。近年來(lái),壞死性凋亡的信號(hào)通路、相關(guān)分子機(jī)制研究也取得了重要進(jìn)展。

壞死性凋亡是非半胱天冬氨酸酶(Caspase)依賴的可調(diào)控性細(xì)胞壞死,具有細(xì)胞凋亡和壞死的一些共同特征,主要表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹和細(xì)胞膜完整性的破壞,可引起炎癥反應(yīng)[3]。壞死性凋亡由死亡受體介導(dǎo),被與受體相結(jié)合的配體激活,其中,參與腫瘤壞死因子-α/腫瘤壞死因子受體(TNF-α/TNFR)誘導(dǎo)途徑的蛋白如受體相互作用激酶1(receptor interacting protein-1,RIP1)、受體相互作用激酶3(receptor interacting protein-3,RIP3)和底物混合譜系激酶樣蛋白(mixed lineage kinase-like domain,MLKL)等是壞死性凋亡的關(guān)鍵分子,RIP1-RIP3-MLKL通路也被稱為壞死凋亡的經(jīng)典通路,許多藥物和化合物通過作用于RIP1、RIP3、MLKL等壞死性凋亡關(guān)鍵分子抑制程序性壞死的發(fā)生[4]。

因此,明確心肌細(xì)胞壞死性凋亡的分子機(jī)制,探究壞死性凋亡在CVD的病理生理過程中的作用,對(duì)于尋找新的干預(yù)方式及治療靶點(diǎn),有效降低CVD的死亡率,改善心血管病人的預(yù)后,具有重要的臨床意義。本研究針對(duì)壞死性凋亡的經(jīng)典信號(hào)通路RIP1-RIP3-MLKL、抗壞死性凋亡相關(guān)治療藥物及這一通路在CVD中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 壞死性凋亡的經(jīng)典信號(hào)通路及其在CVD中的作用

1.1 RIPs是壞死性凋亡中的重要調(diào)控分子

RIPs是一類具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性的蛋白。在結(jié)構(gòu)上,這類蛋白N端具有高度保守的激酶結(jié)構(gòu)域,因此RIPs具有相同的生物學(xué)功能。RIPs可以接受細(xì)胞表面受體傳遞的細(xì)胞外刺激及來(lái)自細(xì)胞內(nèi)模式識(shí)別受體的信號(hào),啟動(dòng)下游級(jí)聯(lián)反應(yīng),激活轉(zhuǎn)錄因子,而其中一些因子被激活后可以協(xié)助死亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo),導(dǎo)致細(xì)胞死亡[5]。RIP蛋白家族具有許多成員,包括RIP1～7,其中RIP1和RIP3兩種蛋白在壞死性凋亡中有重要作用。

1.2 壞死性凋亡的經(jīng)典通路

壞死性凋亡由死亡受體誘導(dǎo)發(fā)生,包括TNFR家族(如TNFR1、TNFR2、TRAILR、Fas/CD95)、病原體識(shí)別受體[如Toll樣受體(TLR)3、TLR4,NOD樣受體]、干擾素受體(IFNR)、干擾素調(diào)節(jié)因子(DAI)的DNA依賴性激活劑以及細(xì)胞內(nèi)的RNA或DNA感受器等[6]。這些死亡受體與其各自的配體結(jié)合,啟動(dòng)壞死性凋亡途徑。壞死性凋亡涉及多種信號(hào)通路,其中研究最為廣泛、最經(jīng)典的是由TNF-α/TNFR途徑誘導(dǎo)的RIP1-RIP3-MLKL通路,該過程可以被簡(jiǎn)述為:當(dāng)TNF-α與TNFR1結(jié)合,TNFR1被激活后與RIP1、腫瘤壞死因子受體相關(guān)死亡域蛋白(TRADD)、FADD/E3泛素化連接酶、TRAF2/5、細(xì)胞凋亡蛋白-1的細(xì)胞抑制劑cIAP1/2共同形成復(fù)合物I,RIP1在此過程中泛素化,活性受到抑制,NF-κB通路被激活,利于細(xì)胞生存。復(fù)合體I中的RIP1去泛素化后被激活并從中解離,在胞漿中招募Csapase-8(外源性凋亡途徑的啟動(dòng)因子,當(dāng)被抑制或敲除時(shí)激活壞死性凋亡)等。當(dāng)三磷酸腺苷(ATP)充足時(shí),Caspase-8活化,此時(shí)RIP1和RIP3失活,阻斷壞死性凋亡通路,同時(shí)凋亡通路被激活,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡;當(dāng)ATP缺乏時(shí),Caspase-8活性減低,RIP3和RIP1結(jié)合,形成RIP1-RIP3復(fù)合物招募并磷酸化下游的MLKL;活化的MLKL與磷脂酰肌醇磷酸鹽、磷脂酰甘油和心磷脂結(jié)合,形成壞死性復(fù)合體,并易位到細(xì)胞膜,其中的MLKL引起細(xì)胞膜透化、細(xì)胞腫脹,細(xì)胞釋放內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)損傷相關(guān)分子模式,啟動(dòng)免疫應(yīng)答,導(dǎo)致炎癥反應(yīng)發(fā)生[7]。

此外,隨著研究的不斷深入,除了TNF-α介導(dǎo)的經(jīng)典壞死性凋亡外,RIP1和RIP3可以激活線粒體應(yīng)激通路介導(dǎo)壞死性凋亡的發(fā)生,如RIP1介導(dǎo)的RIP1-MEK/ERK通路,RIP3介導(dǎo)RIP3-c-Jun氨基末端激酶(JNK)-BNIP3、RIP3-PGAM5-Drp-1、RIP3-鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)-線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)通路等[8]。研究發(fā)現(xiàn),CaMKⅡ可能作為MLKL的下游效應(yīng)因子,并參與了心肌I/R損傷過程中的壞死性凋亡[9]。RIP3還可以激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路介導(dǎo)壞死性凋亡發(fā)生,如RIP3-XO-活性氧(ROS)-mPTP信號(hào)通路[10]。但是這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子機(jī)制目前并未完全闡明,仍需要深入研究。

2 抗壞死性凋亡藥物在心肌損傷治療中的作用

2.1 RIP1抑制劑

壞死抑素-1(necrostatin-1,Nec-1)是發(fā)現(xiàn)最早、應(yīng)用最廣泛的一種RIP1特異性抑制劑[11]。Nec-1已經(jīng)廣泛應(yīng)用于RIP1參與的各種細(xì)胞壞死和疾病[12]。Nec-1通過阻斷RIP1磷酸化有效地阻斷RIP1-RIP3-MLKL信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),從而抑制細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡。在許多疾病模型中,如MI、精神疾病和腸道炎性疾病等,Nec-1被證實(shí)不僅抑制RIP1,還能降低RIP3的表達(dá)和磷酸化[13]。然而,Nec-1并不是直接抑制RIP3且不會(huì)阻斷RIP3自磷酸化,而是通過減少RIP1和RIP3之間的相互作用,抑制RIP1-RIP3復(fù)合體的形成和降低復(fù)合體穩(wěn)定性,從而影響下游RIP3的活性[14]。

研究證實(shí),ROS的產(chǎn)生可能是RIP1依賴性的,ROS增加RIP1/RIP3的表達(dá),并能增強(qiáng)RIP1-RIP3復(fù)合體的穩(wěn)定性;Nec-1還通過靶向ROS影響壞死性凋亡;在急性I/R損傷疾病模型中,Nec-1可以降低損傷細(xì)胞內(nèi)ROS水平,這種下調(diào)甚至可以將損傷細(xì)胞ROS降至與正常細(xì)胞相似的ROS水平[15]。因此,Nec-1被廣泛應(yīng)用于MI、AS、糖尿病心肌病等。除了Nec-1,Harris等[16]還在化學(xué)篩選中發(fā)現(xiàn)了其他幾種RIP1抑制劑,如GSK2982772,但尚在臨床試驗(yàn)階段,其藥理機(jī)制有待深入研究。

2.2 RIP3抑制劑

RIP3作為RIP1的下游信號(hào)分子,直接靶向作用于MLKL,在整個(gè)信號(hào)通路中非常重要。因此,與RIP1激酶抑制劑相比,RIP3激酶抑制劑在壞死性凋亡中的作用更為重要。Li等[17]研究發(fā)現(xiàn),一類傳統(tǒng)上用于治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的B-Taf抑制劑(VE600)在抑制RIP3方面也有一定的效果,其中,一類化合物如達(dá)拉非尼通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制ATP與RIP3酶相結(jié)合,減少RIP3介導(dǎo)的MLKL磷酸化,破壞RIP3和MLKL之間的相互作用,但是目前尚未應(yīng)用于CVD研究[18]。還有一些抗癌藥物如帕納替尼可以同時(shí)抑制RIP1和RIP3抑制壞死性凋亡。

2.3 MLKL抑制劑

MLKL可以作為預(yù)防細(xì)胞壞死性凋亡、抑制壞死性凋亡后嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)的最佳治療靶點(diǎn),但是針對(duì)MLKL抑制劑的報(bào)道較少。壞死磺胺是MLKL抑制劑,目前仍應(yīng)用于動(dòng)物或細(xì)胞模型中。除了抑制經(jīng)典通路的藥物,還有一些如褪黑素可以減少M(fèi)I面積,其機(jī)制可能是通過抑制RIPK3-PGAM5-CypD-mPTP信號(hào)通路,減少mPTP的開放,抑制心臟I/R損傷后心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞壞死性凋亡[19]。

隨著對(duì)壞死性凋亡藥物研究的不斷深入,一些藥物如達(dá)拉非尼等可用于治療特定臨床疾病。然而,大多數(shù)研究靶向壞死性凋亡的藥物及治療效果都僅停留在體外實(shí)驗(yàn)或動(dòng)物模型階段。因此,這些化合物和藥物臨床使用可行性仍有待進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)和臨床試驗(yàn)評(píng)估。

3 壞死性凋亡與CVD的關(guān)系

3.1 壞死性凋亡與AS

AS累及大中肌性動(dòng)脈,AS斑塊造成動(dòng)脈壁增厚變硬、血管狹窄,不穩(wěn)定斑塊破裂堵塞器官或四肢血管管腔,引發(fā)心腦血管疾病及并發(fā)癥。AS與脂質(zhì)代謝密切相關(guān),在血脂異常的因素中最重要的是過量的低密度脂蛋白(low density lipoprotein cholesterol,LDL),尤其是氧化型LDL(ox-LDL),氧化應(yīng)激(oxidative stress,OS)可以加速LDL沉積在動(dòng)脈內(nèi)膜。LDL在ROS的作用下成為ox-LDL,ox-LDL刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌炎性因子,誘導(dǎo)單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附,單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化成巨噬細(xì)胞。ox-LDL還可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞攝取脂蛋白,形成巨噬泡沫細(xì)胞,而巨噬細(xì)胞死亡是AS斑塊形成壞死的主要因素,壞死的斑塊容易破裂[20]。過去的研究多集中于ox-LDL有細(xì)胞毒性并能誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的凋亡及凋亡細(xì)胞過早清除引起的繼發(fā)性壞死。近年來(lái),關(guān)于在AS斑塊形成的過程中,巨噬細(xì)胞在壞死性凋亡中的作用也取得了一些進(jìn)展。

目前研究認(rèn)為,巨噬細(xì)胞壞死性凋亡途徑可以作為不穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊診斷和治療的靶點(diǎn)。研究顯示,在AS小鼠模型中,敲除RIP3基因的小鼠較對(duì)照組小鼠動(dòng)脈粥樣斑塊的體積明顯縮小,病灶中壞死性凋亡的巨噬細(xì)胞較少,炎癥較輕,但是凋亡細(xì)胞的數(shù)量無(wú)明顯差異;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),RIP3和載脂蛋白E雙基因敲除的小鼠,動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中炎癥反應(yīng)及壞死性凋亡水平明顯下降[21]。Karunakaran等[22]研究表明,AS病人的頸動(dòng)脈斑塊巨噬細(xì)胞中RIP3和MLKL的表達(dá)顯著增加,并且檢測(cè)到磷酸化的MLKL,提示RIP3、MLKL與AS密切相關(guān),且壞死性凋亡的激活及RIP3、MLKL基因表達(dá)上調(diào)可能增加斑塊的不穩(wěn)定性,從而參與AS的病理過程,提早干預(yù)RIP3基因表達(dá),可能會(huì)阻斷AS的病理進(jìn)程;通過使用開發(fā)的新型Nec-1放射性示蹤劑,可以特異性定位于小鼠的AS斑塊,提示Nec-1靶向治療AS的壞死性凋亡可能是一種有效的策略。然而,有研究表明,MLKL基因敲除后,小鼠血中膽固醇水平降低,但增加了AS斑塊內(nèi)和體外巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞中脂質(zhì)的累積,這可能是由于內(nèi)體運(yùn)輸缺陷導(dǎo)致的,目前尚無(wú)定論[23]。

3.2 壞死性凋亡與MI

MI是指冠狀動(dòng)脈受到持續(xù)且嚴(yán)重的閉塞,心肌細(xì)胞持續(xù)性缺血缺氧,發(fā)生不可逆的死亡。而挽救缺血心肌的唯一方式是恢復(fù)血液灌注,即在冠狀動(dòng)脈部分或完全梗死后一定時(shí)間內(nèi)血液再次灌流,缺血的心肌雖然供血得以恢復(fù),但心肌細(xì)胞壞死仍不可避免,超過一段時(shí)間再進(jìn)行灌注會(huì)導(dǎo)致額外的不可逆損傷,加重梗死過程(致死性再灌注損傷)。在離體大鼠I/R模型中,使用Nec-1可以有效減小MI面積,改善心功能[24]。因此,深入研究壞死性凋亡的發(fā)生和調(diào)控對(duì)防治I/R及MI意義重大。研究表明,I/R后,小鼠心臟標(biāo)本中RIP1、RIP3、MLKL的蛋白水平明顯升高;小鼠的非再灌注MI模型中RIP3也顯著上調(diào)。在RIP3基因敲除小鼠永久性左前降支結(jié)扎術(shù),I/R后檢測(cè)小鼠心臟中RIP3顯著上調(diào),ROS和其他炎癥反應(yīng)也升高,在梗死3 d后左室射血分?jǐn)?shù)升高,心肌肥大被抑制,提示RIP3介導(dǎo)MI后的不良重塑[25]。RIP1-RIP3-MLKL在MI病理生理過程及預(yù)后中發(fā)揮重要作用。

然而,隨著研究的深入,Chang等[26]研究顯示,MLKL在RIP3誘導(dǎo)的I/R壞死性凋亡中作用有限,提示還存在其他非經(jīng)典通路參與這一過程。在高糖誘導(dǎo)的急性MI模型中,蛋白磷酸酶抑制劑可以通過抑制RIP3-CaMKⅡ介導(dǎo)的ROS,減輕壞死性凋亡。Zhang等[27]研究顯示,在大鼠心肌I/R損傷模型中,RIP3通過直接激活CaMKⅡ,引起mPTP開放,細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高,促使心肌細(xì)胞壞死,這一過程與RIP1、MLKL無(wú)關(guān),但此研究存在一定局限性。Yang等[28]研究顯示,MLKL和CaMKⅡ均參與RIP3誘發(fā)的心肌缺血引起的慢性胸痛,心肌I/R損傷可以由RIP1-RIP3-MLKL和RIP3-CaMKⅡ這兩條途徑共同參與,其中,CaMKⅡ被確定為RIP3的新型底物,在未來(lái)的研究中更具有價(jià)值。此外,還有幾種microRNA(miRNAs)也可以調(diào)節(jié)心臟I/R后的壞死性凋亡。miR-223被認(rèn)為是I/R損傷和心肌壞死性凋亡的潛在調(diào)節(jié)因子,可以減小梗死面積及壞死標(biāo)志物的生成;miRNAs調(diào)節(jié)受到RIP1、RIP3、MLKL蛋白水平的影響;miR-873作用機(jī)制與miR-223相同,都是壞死性凋亡的負(fù)性調(diào)節(jié)因子;miR-103、miR-107s可以促進(jìn)壞死性凋亡,詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步研究[29]。這些miRNAs可能作為減輕I/R損傷的新靶點(diǎn),有助于治療缺血和OS誘導(dǎo)的心肌損傷,減輕I/R損傷,為治療MI、改善病人預(yù)后提供新的思路。

3.3 壞死性凋亡與HF

HF指在各種病因的作用下,由于心肌能量代謝、興奮收縮耦聯(lián)以及心臟結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,心排血量下降,啟動(dòng)心率加快、心臟緊張?jiān)葱约訌?qiáng)、心肌收縮增強(qiáng)和心室重塑等心臟本身結(jié)構(gòu)和功能、心外多種代償機(jī)制。長(zhǎng)期代償導(dǎo)致心室重塑的發(fā)展進(jìn)一步加重HF。

壞死性凋亡參與HF過程,并且促進(jìn)心室重塑進(jìn)程。Szobi等[30]研究發(fā)現(xiàn),在HF病人的樣本中,壞死性凋亡的關(guān)鍵介質(zhì)RIP1、RIP3和MLKL及其磷酸化水平表達(dá)較健康對(duì)照組均上調(diào),活化的Caspase-8表達(dá)顯著下降,說(shuō)明在HF過程中凋亡可能被抑制,促進(jìn)壞死性凋亡的發(fā)生。阿霉素可以誘導(dǎo)心臟損傷,經(jīng)阿霉素誘導(dǎo)的HF模型中RIP3表達(dá)上調(diào),敲除RIP3基因可以減輕阿霉素對(duì)心臟的損害,減少M(fèi)I后30 d的心功能障礙、心肌肥厚和炎癥反應(yīng),提示壞死性凋亡促進(jìn)慢性HF的心室重塑;在橫向主動(dòng)脈收縮(transverse aortic contraction,TAC)術(shù)后,小鼠在第8周出現(xiàn)HF,在衰竭的心臟標(biāo)本中也可以觀察到類似的壞死性凋亡相關(guān)蛋白上調(diào),表明壞死性凋亡促進(jìn)TAC小鼠HF發(fā)展[31]。TAC后的RIP1、RIP3、MLKL及其磷酸化水平表達(dá)上調(diào)可以被分子伴侶熱休克蛋白(heat shock protein,Hsp)90抑制劑逆轉(zhuǎn),Hsp90抑制劑也可通過抑制RIP1-RIP3-MLKL相互作用來(lái)減弱TNF-α誘導(dǎo)的壞死性凋亡,提示抑制Hsp90可能通過抑制受損心臟RIP1-RIP3-MLKL通路激活,從而產(chǎn)生治療效果[32]。

此外,RIP1、RIP3也可以作為潛在的新治療靶點(diǎn),保護(hù)心臟免受兒茶酚胺超負(fù)荷引起的心臟損害[33]。Hippo信號(hào)效應(yīng)子TEAD1[34]、硫化氫[35]通過抑制RIP1-RIP3-MLKL介導(dǎo)的壞死性凋亡成為HF的潛在治療靶點(diǎn)。

3.4 壞死性凋亡與心肌炎癥性疾病

壞死性凋亡可以引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng),心肌炎是心臟的炎癥性疾病。在病毒性心肌炎肌細(xì)胞損傷炎癥反應(yīng)過程中產(chǎn)生大量炎性因子,其中包括TNF-α,這可能與柯薩奇病毒B3誘導(dǎo)細(xì)胞裂解和壞死性凋亡具有一定的相似性。Zhou等[36]提出壞死性凋亡可能是急性心肌炎心肌細(xì)胞死亡的新機(jī)制。急性病毒性心肌炎小鼠模型中,Nec-1明顯對(duì)小鼠心肌損傷起到保護(hù)作用[37]。

4 小 結(jié)

TNF-α介導(dǎo)的RIP1-RIP3-MLKL經(jīng)典壞死性凋亡通路與CVD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。靶向調(diào)控這些壞死性凋亡相關(guān)的因子也為治療CVD指明了方向。然而,目前很多研究尚在細(xì)胞模型或動(dòng)物模型階段,尚需深入研究并將這些發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化為臨床具有重要意義。