劉國(guó)榮，劉洋碩，聶蓉

（1 北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院 北京100048 2 北京工商大學(xué)老年?duì)I養(yǎng)與健康教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京100048 3 北京工商大學(xué)北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心 北京 100048）

乳酸菌細(xì)菌素是在乳酸菌生長(zhǎng)過(guò)程中自身產(chǎn)生的一種具有抗菌活性的多肽類(lèi)物質(zhì)，大部分乳酸菌細(xì)菌素具有高疏水性、高等電點(diǎn)以及陽(yáng)離子性的特性[1-2]。與抗生素不同，細(xì)菌素可以被胰凝乳蛋白酶以及胃蛋白酶等人體中常見(jiàn)的蛋白酶降解，具有無(wú)毒、無(wú)抗藥性、無(wú)殘留等優(yōu)點(diǎn)[3-4]。然而，細(xì)菌素的產(chǎn)量受多種因素的影響，例如培養(yǎng)條件、相關(guān)合成基因的表達(dá)、是否添加外源刺激物質(zhì)等。由于外源物質(zhì)的安全性較高且成本較低，因此目前的研究集中于構(gòu)建外源微生物與產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的共培養(yǎng)體系，以此提高細(xì)菌素的產(chǎn)量。有研究表明，外源微生物可以誘導(dǎo)乳酸菌細(xì)菌素的高效合成[5]，Man等[6]研究發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌STY-31 與植物乳桿菌KLDS1.0391 共培養(yǎng)會(huì)提高植物乳桿菌素（Plantaricin）MG 的產(chǎn)量；另外，Tabasco等[7]研究表明德氏乳桿菌保加利亞亞種CECT4005 和德氏乳桿菌乳酸亞種CECT282 等都會(huì)增強(qiáng)嗜酸乳桿菌La-5 產(chǎn)生乳桿菌素（Lactacin）B 的能力。

群體感應(yīng)系統(tǒng)（Quorum sensing，QS）是一種細(xì)胞間相互交流的“語(yǔ)言”，分為種內(nèi)和種間群體感應(yīng)系統(tǒng)；信號(hào)分子隨著細(xì)菌的生長(zhǎng)不斷產(chǎn)生，當(dāng)積累到一定量后，便會(huì)被自身或其它細(xì)菌所感知，從而誘導(dǎo)特定基因的表達(dá)，使菌群表現(xiàn)出如形成生物被膜、產(chǎn)生細(xì)菌素等生理活動(dòng)[8-9]。在純培養(yǎng)中，植物乳桿菌素EF 的合成受到種內(nèi)群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控，即：首先，植物乳桿菌自身通過(guò)plnA 基因編碼合成信號(hào)分子自誘導(dǎo)肽（Autoinducing peptide，AIP）；當(dāng)細(xì)菌大量繁殖，種群密度不斷增加致AIP 大量積累達(dá)到閾值時(shí)，激活位于細(xì)胞膜上的由plnB 基因編碼的組氨酸蛋白激酶，并以磷酸化的方式將群體感應(yīng)信號(hào)分子傳遞給相應(yīng)的反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白，這兩個(gè)蛋白則分別由plnC 和plnD編碼；接著調(diào)控操縱子plnEFI 產(chǎn)生植物乳桿菌素EF，并通過(guò)ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)分泌到胞外[10-14]。而在共培養(yǎng)體系中，同時(shí)存在種間群體感應(yīng)與種內(nèi)群體感應(yīng)兩種信號(hào)分子。目前有研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌DC400 和羅氏乳桿菌A7 在共培養(yǎng)過(guò)程中，LuxS基因的表達(dá)量上升，AI-2 的分泌量增加[15]。植物乳桿菌NMD-17 與瑞士乳桿菌NMD-137 進(jìn)行共培養(yǎng)時(shí)，會(huì)顯著增加AI-2 信號(hào)分子的活性，因此推測(cè)AI-2/LuxS 介導(dǎo)的種間群體感應(yīng)系統(tǒng)在其中發(fā)揮一定的作用[16]。

本課題組發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌RX-8 與枯草芽孢桿菌1.8715 共培養(yǎng)可以提高植物乳桿菌素EF 的產(chǎn)量。在阻斷種間信號(hào)分子AI-2 后，會(huì)降低枯草芽孢桿菌1.8715 對(duì)共培養(yǎng)植物乳桿菌素EF 的誘導(dǎo)效應(yīng)，說(shuō)明種內(nèi)群體感應(yīng)系統(tǒng)參與調(diào)控共培養(yǎng)中植物乳桿菌素EF 的合成[17]。本研究基于以上結(jié)果，敲除種內(nèi)群體感應(yīng)系統(tǒng)關(guān)鍵基因信號(hào)分子AIP 的編碼基因plnA，將突變菌株植物乳桿菌ΔRX-8、野生菌株植物乳桿菌RX-8 分別與枯草芽孢桿菌1.8715 共培養(yǎng)后，測(cè)定信號(hào)分子的分泌情況及相關(guān)基因的表達(dá)量，探究群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控細(xì)菌素合成的作用機(jī)制。這對(duì)于在共培養(yǎng)體系中提高乳酸菌細(xì)菌素的產(chǎn)量，以及群體感應(yīng)相關(guān)基因的研究提供理論依據(jù)，為乳酸菌細(xì)菌素的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 試驗(yàn)材料

1.1 菌株與質(zhì)粒

本研究所用的菌株和質(zhì)粒見(jiàn)表1。

表1 菌株和質(zhì)粒Table 1 Bacterial strains and plasmids

1.2 試劑

Q5 高保真DNA 聚合酶，購(gòu)于北京欣華綠源科技有限公司；E.Z.N.A 質(zhì)粒小提試劑盒，購(gòu)于上海索寶萊科技有限公司；ClonExpress II 克隆試劑盒，購(gòu)于南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司；紅霉素、氨芐青霉素、DNA marker、多功能DNA 純化回收試劑盒，購(gòu)于北京半夏生物科技有限公司；限制性?xún)?nèi)切酶，購(gòu)于Takara 公司。

1.3 儀器與設(shè)備

C1000 Touch PCR 儀，美國(guó)BIO-RAD2 公司；SPX-150B 生化培養(yǎng)箱，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；BSA224S 型數(shù)字電子天平，德國(guó)Sartorius 公司；渦旋振蕩器，德國(guó)IKA 公司；小型高速離心機(jī)，美國(guó)SIGMA 公司；BioSpectrum 凝膠成像儀，美國(guó)UVP 公司；UB-7 pH 計(jì)，美國(guó)DENVER 儀器公司；電穿孔儀，德國(guó)Eppendorf 公司。

1.4 引物設(shè)計(jì)

利用Primer Premier 5.0 進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，如表2 所示。

表2 引物列表Table 2 Primer design

2 試驗(yàn)方法

2.1 基因缺失菌株及種內(nèi)群體感應(yīng)系統(tǒng)缺失共培養(yǎng)體系的構(gòu)建

2.1.1 質(zhì)粒pMG36e-red/cas 的構(gòu)建 從含有pCas 的大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α 中提取質(zhì)粒，操作步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)，以質(zhì)粒pCas為模板，使用引物Cas9-F/R 和Red-F/R 擴(kuò)增CRISPR/Cas9 基因編輯所需的敲除元件內(nèi)切酶基因Cas9 和重組修復(fù)酶基因λ-Red。

利用TaKaRa Quickcut SacI、KpnI 限制性?xún)?nèi)切酶切質(zhì)粒pMG36e，將環(huán)形pMG36e 質(zhì)粒線(xiàn)化，所得酶切產(chǎn)物電泳驗(yàn)證并回收。將切膠回收后的線(xiàn)性質(zhì)粒pMG36e 和純化后的Cas9 和λ-Red 片段進(jìn)行多片段一次性連接。將得到的產(chǎn)物與感受態(tài)細(xì)胞混勻冰上靜置，隨后熱激冰浴并加入LB 培養(yǎng)基。37 ℃充分復(fù)蘇后，取菌液涂布于氨芐青霉素抗性L(fǎng)B 平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h。

2.1.2 sgRNA 的設(shè)計(jì) 根據(jù)植物乳桿菌RX-8 種內(nèi)信號(hào)分子編碼基因plnA 的序列和靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)原則，選擇帶有PAM（NGG）位點(diǎn)的位置設(shè)計(jì)靶向sgRNA，命名為plnA-sgRNA，并以質(zhì)粒pNZ8148來(lái)源的PNis 啟動(dòng)子作為sgRNA 的啟動(dòng)子，誘導(dǎo)表達(dá)sgRNA。

2.1.3 plnA 同源臂片段的擴(kuò)增及與質(zhì)粒的連接轉(zhuǎn)化 分別以plnA-L F/R 和plnA-R F/R 為引物，以植物乳桿菌RX-8 基因組為模板擴(kuò)增plnA 基因兩側(cè)同源臂。將純化回收的同源臂片段和線(xiàn)化的質(zhì)粒連接并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α。

2.1.4 敲除質(zhì)粒pMG36e-red/cas-sgRNA/plnALR 構(gòu)建 將線(xiàn)化質(zhì)粒pMG36e-red/cas、pNissgRNA 和同源臂片段plnA-LR 進(jìn)行多片段一次性連接，連接后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α 進(jìn)行酶切并測(cè)序驗(yàn)證。

2.1.5 敲除菌株乳桿菌RX-8ΔplnA 構(gòu)建 將原始菌株RX-8 活化兩代后，接種至含2%甘氨酸的MRS 培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入氨芐青霉素（終質(zhì)量濃度為10 μg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)至其OD600nm在0.4～0.5。離心收集菌體細(xì)胞。用預(yù)冷的電穿孔緩沖液清洗細(xì)胞2 次后，加入預(yù)冷的500 μL 30% PEG-1500 重懸菌體，得到感受態(tài)細(xì)胞。

將上述得到的質(zhì)粒DNA 加入感受態(tài)細(xì)胞中，移液槍吹吸混勻后冰浴5 min，轉(zhuǎn)移至提前預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯，設(shè)置電擊參數(shù)為：電壓2.5 kV，電脈沖25 μF，電阻200 Ω。電擊后立即用含2 mmol/L CaCl2和20 mmol/L MgCl2的預(yù)冷的MRS 肉湯稀釋?zhuān)⒃?0 ℃下孵育3 h。吸取200 μL 到紅霉素MRS固體平板上，涂布后培養(yǎng)24 h。挑取生長(zhǎng)情況良好的單個(gè)菌落，分別接種于具有氨芐青霉素抗性和自誘導(dǎo)肽的LB 試管中，37 ℃，200 r/min 搖菌擴(kuò)增12 h 后，提取植物乳桿菌RX-8 基因組DNA。用引物ΔplnA-F/R 擴(kuò)增敲除片段，將PCR 產(chǎn)物測(cè)序與野生菌株序列進(jìn)行對(duì)比。

2.2 共培養(yǎng)中突變菌株的產(chǎn)細(xì)菌素變化分析

2.2.1 突變菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定 將野生菌株RX-8 和敲除菌株ΔRX-8 接種到MRS 培養(yǎng)基中，并將枯草芽孢桿菌1.8715 的種子液等比例分別接入，形成共培養(yǎng)體系后連續(xù)培養(yǎng)32 h，每隔4 h取樣測(cè)OD600nm，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

2.2.2 突變菌株抑菌活性的測(cè)定 采用硫酸銨沉淀法制備[18]細(xì)菌素粗提液，采用瓊脂擴(kuò)散法[19]進(jìn)行測(cè)定抗菌活性。在培養(yǎng)的固體平板上觀(guān)察是否具有明顯的抑菌圈，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈的直徑抑菌圈直徑越大，抑菌效果越好。

2.3 共培養(yǎng)體系中種間信號(hào)分子AI-2 的分泌量檢測(cè)

從野生菌株RX-8 和敲除菌株ΔRX-8 種子培養(yǎng)液中取菌液按照1%接種量接種到MRS 培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)32 h，離心收集上清液。從BB170種子培養(yǎng)液中取菌液按照1%接種量接種到AB培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)至OD600nm在0.7～1.2，稀釋后得到BB170 稀釋液，并以BB170 熒光值為對(duì)照，計(jì)算野生菌株和突變菌株的相對(duì)發(fā)光值。

2.4 共培養(yǎng)中突變菌株相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平研究

2.4.1 突變菌株與野生菌株總RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄cDNA 的制備 將野生菌株RX-8、突變菌株ΔRX-8 進(jìn)行純培養(yǎng)并分別與枯草芽孢桿菌1.8715 共培養(yǎng)提取每隔4 h 的野生菌株與突變菌株的發(fā)酵液，離心收集菌體，采用RNA 提取試劑盒得到總RNA，并利用cDNA 合成試劑盒提取制備cDNA。

2.4.2 RT-qPCR 分析 對(duì)共培養(yǎng)中野生菌株RX-8 和突變菌株ΔRX-8 的ABC 系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)基因LuxS、甲硫腺苷核苷酶基因pfs、群體感應(yīng)基因plnBCD、細(xì)菌素基因plnEF 的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定結(jié)果以純培養(yǎng)時(shí)的RX-8 基因表達(dá)量為基準(zhǔn)（即為1）進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算。

3 結(jié)果與分析

3.1 構(gòu)建種內(nèi)群體感應(yīng)缺失的共培養(yǎng)體系

3.1.1 質(zhì)粒pMG36e-red/cas 的構(gòu)建 本研究以質(zhì)粒pMG36e 為敲除骨架，插入CRISPR/Cas9 基因編輯所需的組件，初步構(gòu)建了敲除工具。如圖1所示，在第1 泳道和第2 泳道分別擴(kuò)增得到2 個(gè)位于3～5 kp 和2～3 kp 之間的DNA 片段，與預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大?。? 107，2 210 bp）基本一致，并且測(cè)序結(jié)果顯示序列完全正確。將線(xiàn)化質(zhì)粒pMG36e與敲除組件Cas 和λ-Red 連接轉(zhuǎn)化，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切（XhoI、BglII 和BamHI、XhoI）驗(yàn)證，第3泳道為重組質(zhì)粒pMG36e-red/cas（大小約為8.8 kb），第4 泳道的cas9 片段和pMG36e-λ-Red 分別實(shí)際長(zhǎng)度為5 820 bp 和4 107 bp，測(cè)序結(jié)果比對(duì)正確，表明成功構(gòu)建質(zhì)粒pMG36e-red/cas。

圖1 質(zhì)粒pMG36e-red/cas 的構(gòu)建電泳圖Fig.1 Construction of plasmid pMG36e-red/cas

3.1.2 sgRNA 的設(shè)計(jì) 根據(jù)https：//links.jianshu.com 網(wǎng)站在線(xiàn)設(shè)計(jì)plnA 基因的sgRNA。在網(wǎng)站中導(dǎo)入plnA 基因后可生成所有可能的靶點(diǎn)位置，選取得分最高的序列。本研究選擇距離啟動(dòng)子ATG只有17 堿基的位置并且尾端帶有PAM 序列的sgRNA 序列，以pNZ8148 來(lái)源的pNis 啟動(dòng)子作為sgRNA 的啟動(dòng)子，誘導(dǎo)其表達(dá)。目的基因plnA 中sgRNA 所在位置及其堿基序列如圖2 所示。將設(shè)計(jì)好的plnA 基因的sgRNA 序列和pNis 啟動(dòng)子序列構(gòu)成的pNis-sgRNA 進(jìn)行合成，電泳結(jié)果如圖3所示。

圖2 plnA 基因的sgRNA 位置及序列Fig.2 Insertion position of sgRNA and sequences of plnA

圖3 pNis-sgRNA 酶切電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis pattern of RCR amplification product of pNis-sgRNA

3.1.3 plnA 同源臂的設(shè)計(jì) 擴(kuò)增plnA 基因左右兩端的同源臂plnA-L（493bp）和plnA-R（526 bp），圖4 中顯示分別擴(kuò)增得到2 個(gè)位于500～750 bp 之間的DNA 片段，與預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大?。?00 bp）條帶大小相符且測(cè)序結(jié)果顯示序列完全正確，表明擴(kuò)增成功。接著將純化回收后的同源臂和質(zhì)粒分別連接，酶切鑒定結(jié)果圖如4 所示。重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)XhoI 和SpeI 雙酶切后在1～2 kb 之間可見(jiàn)1 000 bp 左右的條帶，電泳結(jié)果與測(cè)序結(jié)果均表明與預(yù)期相符。

圖4 plnA 同源臂L/R 基因的PCR 產(chǎn)物和雙酶切電泳圖Fig.4 A garose electrophoresis of PCR products of plnA-L/R

3.1.4 敲除質(zhì)粒pMG36e-red/cas-sgRNA/plnALR 的構(gòu)建 將質(zhì)粒pMG36e-red/Cas 與同源臂plnA-L/R、pNis-gRNA 連接轉(zhuǎn)化。如圖5 所示，經(jīng)XhoI 和SpeI 雙酶切后可見(jiàn)在1～2 kb 和8 kb 出現(xiàn)兩條特異性條帶，均與預(yù)期大小一致。將重組的敲除質(zhì)粒和酶切片段測(cè)序，結(jié)果與原序列一致，分別為同源臂片段1 019 bp 和pMG36e-red/cas-sgRNA 10 680 bp。

圖5 敲除質(zhì)粒酶切PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.5 Electrophoretic pattern of knockout plasmid enzyme digestion PCR products

3.1.5 突變菌株ΔRX-8 的構(gòu)建 將敲除質(zhì)粒CRISPR/Cas-sgRNA-plnA-L/R 電擊轉(zhuǎn)化入植物乳桿菌RX-8 中，通過(guò)引物ΔplnA-F/R 擴(kuò)增靶基因的同源臂，判定plnA 基因的敲除情況。由于敲除片段長(zhǎng)度較短在電泳圖中不明顯，這里通過(guò)測(cè)序序列峰圖和序列對(duì)比圖展示敲除結(jié)果如圖6，從峰圖中可見(jiàn)敲除plnA 基因后進(jìn)行了同源修復(fù)并引入設(shè)計(jì)的強(qiáng)終止子序列。

圖6 plnA 基因敲除前后的測(cè)序鑒定結(jié)果Fig.6 Sequencing results before and after plnA gene knockout

3.2 共培養(yǎng)中突變菌株的產(chǎn)細(xì)菌素變化

3.2.1 共培養(yǎng)中突變菌株生長(zhǎng)情況 為研究在共培養(yǎng)中種內(nèi)群體感應(yīng)系統(tǒng)關(guān)鍵基因信號(hào)分子plnA基因敲除后植物乳桿菌RX-8 的生長(zhǎng)代謝變化，本研究繪制了共培養(yǎng)32 h 的念珠菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖。如圖7 所示，在敲除了plnA 基因之后，無(wú)論是純培養(yǎng)還是共培養(yǎng)過(guò)程中，突變菌株仍然保持著良好的生長(zhǎng)活性，且共培養(yǎng)的菌體密度高于純培養(yǎng)。與野生菌株相比，突變菌株的菌體密度整體略低，但是并無(wú)明顯的差異，依舊保持平穩(wěn)的生長(zhǎng)趨勢(shì)。

圖7 野生菌株RX-8 和突變菌株ΔRX-8 的生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.7 Growth curve of wild plant RX-8 and mutation plant ΔRX-8

3.2.2 共培養(yǎng)中突變菌株細(xì)菌素合成情況 野生菌株RX-8 和和突變菌株ΔRX-8 在純培養(yǎng)和共培養(yǎng)體系中細(xì)菌素合成量如圖8 所示。純培養(yǎng)體系中，由于敲除了ΔplnA，突變菌株不會(huì)產(chǎn)生細(xì)菌素，所以抑菌圈直徑為0。在共培養(yǎng)體系中，突變菌株植物乳桿菌ΔRX-8 的細(xì)菌素合成量雖較野生菌株植物乳桿菌RX-8 有所下降，但卻明顯高于純培養(yǎng)體系中野生菌株植物乳桿菌RX-8 細(xì)菌素的合成量，說(shuō)明敲除plnA 后依然部分存在枯草芽孢桿菌1.8715 的誘導(dǎo)作用。從整體來(lái)看，細(xì)菌素在整個(gè)培養(yǎng)時(shí)期均表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，且純培養(yǎng)體系中細(xì)菌素的產(chǎn)量以及合成速度均高于純培養(yǎng)體系。

圖8 細(xì)菌素合成量變化Fig.8 The changes in bacteriocin synthesis

3.3 共培養(yǎng)中突變菌株群體感應(yīng)系統(tǒng)信號(hào)分子分泌情況

敲除種內(nèi)信號(hào)分子基因plnA 后，研究共培養(yǎng)過(guò)程中野生菌株RX-8 與突變菌株ΔRX-8 種間信號(hào)分子AI-2 分泌量，結(jié)果如圖9 所示。以上清液的相對(duì)發(fā)光量作為AI-2 分泌量的判斷依據(jù)，在4～20 h 的培養(yǎng)過(guò)程中，純培養(yǎng)體系A(chǔ)I-2 分泌量顯著低于共培養(yǎng)體系，但是在20 h 之后便無(wú)明顯差異。從菌株水平來(lái)看，在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，無(wú)論是共培養(yǎng)還是純培養(yǎng)，突變菌株與野生菌株AI-2的分泌量始終保持在同一水平。

圖9 種間信號(hào)分子AI-2 分泌情況Fig.9 Secretion of interspecies signaling molecule AI-2

3.4 共培養(yǎng)體系中突變菌株群體感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)情況

3.4.1 對(duì)種間信號(hào)分子合成基因LuxS、pfs 的影響 對(duì)種間信號(hào)分子合成相關(guān)基因LuxS、pfs 的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖10 所示。在整個(gè)培養(yǎng)的過(guò)程中，共培養(yǎng)體系的突變菌株與野生菌株在LuxS、pfs 的表達(dá)量上均未有明顯差異，但是與純培養(yǎng)相比表達(dá)量均有所上升。由此可以看出敲除種內(nèi)信號(hào)分子編碼基因plnA 對(duì)種間信號(hào)分子合成基因的轉(zhuǎn)錄無(wú)影響，這與AI-2 分泌量未發(fā)生變化的結(jié)果一致。

3.4.2 共培養(yǎng)中突變菌株群體感應(yīng)系統(tǒng)雙組分系統(tǒng)基因表達(dá)情況 敲除種內(nèi)信號(hào)分子基因plnA后，研究共培養(yǎng)過(guò)程中野生菌株RX-8 與突變菌株ΔRX-8 的群體感應(yīng)系統(tǒng)中雙組分系統(tǒng)編碼基因plnBCD 的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果如圖11 所示。相對(duì)表達(dá)量是以純培養(yǎng)過(guò)程中植物乳桿菌RX-8 的基因表達(dá)量為基準(zhǔn)，因此相對(duì)表達(dá)量大于1 即為基因表達(dá)上調(diào)。由圖11 可知，在敲除了plnA 之后，基因plnBCD 的相對(duì)表達(dá)量均大于1，這意味著相關(guān)基因仍然表達(dá)且處于上調(diào)水平，由此推測(cè)在共培養(yǎng)的過(guò)程中可能存在某些物質(zhì)刺激相關(guān)的受體蛋白，從而調(diào)控相應(yīng)基因的表達(dá)。與野生菌株相比，突變菌株的組氨酸激酶編碼基因plnB 表達(dá)量有所下降，差異主要集中在菌株生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期及穩(wěn)定期，即12～32 h；而作為下一級(jí)信號(hào)基因的plnCD，表達(dá)差異略有滯后且時(shí)間縮短，集中在16～28 h。從整體上看，3 個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量變化與細(xì)菌素的產(chǎn)量具有相同的變化趨勢(shì)，呈現(xiàn)出先上升后下降。

圖11 雙組分系統(tǒng)基因plnBCD 表達(dá)情況Fig.11 Changes in expression of two-component system gene plnBCD

圖12 細(xì)菌素結(jié)構(gòu)基因plnEF 表達(dá)量變化Fig.12 Changes in expression of bacteriocin structural gene plnEF

3.4.3 對(duì)細(xì)菌素合成基因表達(dá)的影響 從基因的轉(zhuǎn)錄水平上可以看出，細(xì)菌素合成基因plnEF 的表達(dá)量有顯著差異，在敲除了plnA 基因之后，突變菌株的plnEF 表達(dá)量明顯低于野生菌株，但是相對(duì)表達(dá)量仍然大于1，與純培養(yǎng)相比基因表達(dá)上調(diào)。共培養(yǎng)體系中，0～4 h 由于在細(xì)菌處于遲滯期，細(xì)菌素并未開(kāi)始合成，因此兩菌株的基因表達(dá)量并無(wú)顯著差異；從8 h 開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體密度開(kāi)始增加，同時(shí)細(xì)菌素開(kāi)始合成，相關(guān)的細(xì)菌素結(jié)構(gòu)基因開(kāi)始表達(dá)，導(dǎo)致二者的表達(dá)量開(kāi)始具有顯著差異直至培養(yǎng)結(jié)束。

4 討論與結(jié)論

本研究對(duì)采用CRISPR/Cas9 基因敲除技術(shù)構(gòu)建突變菌株植物乳桿菌ΔRX-8，將其與枯草芽孢桿菌1.8715 進(jìn)行共培養(yǎng)，同時(shí)以野生菌株RX-8與枯草芽孢桿菌1.8715 的共培養(yǎng)體系為對(duì)照，研究種內(nèi)群體感應(yīng)系統(tǒng)在枯草芽孢桿菌1.8715誘導(dǎo)植物乳桿菌RX-8 細(xì)菌素產(chǎn)生增加過(guò)程中所起的作用以及相關(guān)基因的變化情況。

根據(jù)敲除菌株與野生菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)結(jié)果顯示，在敲除了plnA 基因之后，植物乳桿菌RX-8仍然可以正常生長(zhǎng)。共培養(yǎng)體系和純培養(yǎng)體系中，兩者的菌體密度并無(wú)顯著差異，具有相同的生長(zhǎng)趨勢(shì)，這表明plnA 基因是一種非致死性基因，敲除之后對(duì)植物乳桿菌RX-8 生長(zhǎng)情況沒(méi)有明顯的影響，可以排除因?yàn)樯L(zhǎng)情況而導(dǎo)致細(xì)菌素產(chǎn)量下降的干擾因素，同時(shí)也說(shuō)明種間信號(hào)分子缺失共培養(yǎng)體系的成功構(gòu)建。

從細(xì)菌素的合成情況可以發(fā)現(xiàn)，相較于純培養(yǎng)體系中的野生菌株RX-8，共培養(yǎng)體系中突變菌株ΔRX-8 的細(xì)菌素產(chǎn)量顯著上升，但是仍然低于野生菌株的共培養(yǎng)體系，這說(shuō)明細(xì)菌素的誘導(dǎo)合成途徑并不完全是由種內(nèi)群體感應(yīng)系統(tǒng)所調(diào)控的，種間群體感應(yīng)系統(tǒng)在細(xì)菌素的合成過(guò)程中同樣發(fā)揮作用。而種間信號(hào)分子AI-2 分泌量的結(jié)果顯示，當(dāng)細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，共培養(yǎng)體系與純培養(yǎng)體系的分泌量具有顯著差異，待進(jìn)入穩(wěn)定期后便無(wú)明顯區(qū)別。在共培養(yǎng)過(guò)程中，敲除菌株與野生菌株種間信號(hào)分子AI-2 的分泌量始終保持一致，且在純培養(yǎng)體系中亦是如此。上述結(jié)果均表明在種內(nèi)群體感應(yīng)系統(tǒng)的缺失的共培養(yǎng)體系中，種間群體感應(yīng)系統(tǒng)信號(hào)分子的分泌不會(huì)受到影響。

從轉(zhuǎn)錄水平上看，在共培養(yǎng)體系中，敲除了plnA 基因之后，調(diào)控雙組分系統(tǒng)plnBCD 基因的表達(dá)量略低于野生菌株，但是依舊屬于正常水平。共培養(yǎng)體系中組氨酸蛋白激酶編碼基因plnB 的表達(dá)量略有降低，這是因?yàn)闃?gòu)建種內(nèi)群體感應(yīng)系統(tǒng)缺失共培養(yǎng)體系后，突變菌株ΔRX-8 不再分泌種內(nèi)信號(hào)分子AIP，而組氨酸蛋白激酶恰好是AIP的受體蛋白，導(dǎo)致受體蛋白只能被部分激活[20-22]。在Zhang等[23-24]的研究中，敲除了plnB 基因之后的突變菌株植物乳桿菌ΔLXM-1 的細(xì)菌素產(chǎn)量明顯降低，在補(bǔ)充PlnA 之后仍然無(wú)法恢復(fù)，這是由于在缺乏受體蛋白的情況下，即使有信號(hào)分子PlnA 也無(wú)法激活種內(nèi)群體感應(yīng)系統(tǒng)來(lái)調(diào)控細(xì)菌素合成。而在本研究中，缺失了PlnA 之后，plnB 的表達(dá)量雖然有所下降，卻不會(huì)降低至純培養(yǎng)水平，說(shuō)明了PlnB 可能被其它信號(hào)分子激活。另外，與純培養(yǎng)的野生菌株相比，共培養(yǎng)的野生菌株和突變菌株種間信號(hào)分子AI-2 的分泌量明顯增加，同時(shí)基因LuxS，pfs 的表達(dá)量均有上調(diào)。姜雪雍等[25]的研究結(jié)果顯示，在副干酪乳桿菌HD1.7 與枯草芽孢桿菌構(gòu)成的共培養(yǎng)體系中，細(xì)菌素的合成量是純培養(yǎng)組的1.21 倍，群體感應(yīng)相關(guān)基因LuxS上調(diào)2.31 倍。而在孫思睿等[26-28]的研究中，純培養(yǎng)體系下組氨酸蛋白激酶基因細(xì)菌素結(jié)構(gòu)基因plNC8HK、雙組分調(diào)節(jié)基因plnD 以及細(xì)菌素結(jié)構(gòu)基因plnEF 均因LuxS 基因的缺失，表達(dá)顯著下調(diào)，這與本研究結(jié)果一致。因此推測(cè)種間信號(hào)分子AI-2 可能與AIP 共用同一套雙組分系統(tǒng)。在共培養(yǎng)12 h 時(shí)，二者plnB 基因的表達(dá)量已經(jīng)具有顯著差異，但是其下級(jí)傳導(dǎo)基因的表達(dá)量雖有差異卻并不顯著，直至16 h 時(shí)差異開(kāi)始顯著，因此存在基因表達(dá)的滯后性[29-31]。同時(shí)，細(xì)菌素合成基因plnEF 的表達(dá)量有明顯差異，突變菌株ΔRX-8 的plnEF 基因的表達(dá)量比野生菌株略有降低，但細(xì)菌素的產(chǎn)量仍然高于純培養(yǎng)中的野生菌株，這與細(xì)菌素表達(dá)量的變化趨勢(shì)相符。

綜合以上結(jié)果，在種內(nèi)信號(hào)分子缺失的共培養(yǎng)體系中，誘導(dǎo)效應(yīng)并未因?yàn)槿笔lnA 而完全喪失，表明除PlnA 介導(dǎo)的種內(nèi)群體感應(yīng)系統(tǒng)之外，還有其它系統(tǒng)調(diào)控誘導(dǎo)效應(yīng)。由于在種內(nèi)群體感應(yīng)系統(tǒng)缺失的共培養(yǎng)體系中不會(huì)影響種間信號(hào)分子AI-2 的合成，而結(jié)果顯示AI-2 的分泌量提高，推測(cè)可能是存在種間信號(hào)分子AI-2 與種間信號(hào)分子AIP 共用同一套雙組分系統(tǒng)的現(xiàn)象，兩種信號(hào)分子共同促進(jìn)細(xì)菌素的高效合成。