劉凱龍，黃 天，劉曉曄，玉 霞，姚國(guó)強(qiáng)

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)蒙古自治區(qū)乳品生物技術(shù)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 呼和浩特 010018）

益生菌即活的、被足量攝入后對(duì)宿主有益的微生物[1]，具有降膽固醇、增強(qiáng)免疫、改善胃腸道功能以及抗病毒等作用[2-5]。益生菌一般分為雙歧桿菌屬、乳植桿菌屬、乳酪桿菌屬等[6]，其中雙歧桿菌屬是最早定殖于人體腸道，作為嬰幼兒腸道內(nèi)的核心菌群，對(duì)于理想腸道菌群的建立至關(guān)重要[7-8]。目前，動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種作為益生菌已被深層次研究并廣泛應(yīng)用到食品加工領(lǐng)域及醫(yī)療領(lǐng)域等，然而在菌株生產(chǎn)、使用過(guò)程中，通常會(huì)出現(xiàn)形態(tài)突變、碳水化合物利用能力下降、生長(zhǎng)周期延長(zhǎng)等衰退現(xiàn)象[9]，因此對(duì)于菌株的遺傳穩(wěn)定性評(píng)估尤為重要。目前對(duì)益生菌遺傳穩(wěn)定性的研究包括對(duì)其連續(xù)傳代過(guò)程中的表型特性、細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)等方面[10]。隨著高通量技術(shù)的發(fā)展，可在基因?qū)用鎸?shí)現(xiàn)對(duì)菌株的遺傳穩(wěn)定性評(píng)估，并根據(jù)測(cè)序結(jié)果，推測(cè)基因數(shù)目、功能及表達(dá)機(jī)制，揭示菌株的直系同源序列，從而分析其遺傳特性和驗(yàn)證表型演化[11-12]。

前期研究表明動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種（Bifidobacterium animalis subsp.lactis，B.animalis subsp.lactis）V9 對(duì)胃腸的消化液具有良好的耐受性，體外試驗(yàn)表明，該菌株經(jīng)胃腸道消化后存活率為92.44%，可耐受的膽鹽質(zhì)量濃度為0.3 g/100 mL[13]，并對(duì)腸道致病菌具有拮抗作用，可顯著提高腹瀉康復(fù)率，調(diào)節(jié)免疫等益生功能[14-15]。本研究擬評(píng)價(jià)動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9 連續(xù)傳代培養(yǎng)過(guò)程中的遺傳穩(wěn)定性，從菌體形態(tài)變化、碳水化合物利用能力等表型穩(wěn)定性方面著手，并結(jié)合比較基因組學(xué)分析其進(jìn)化的基本規(guī)律，評(píng)價(jià)其遺傳穩(wěn)定性，為動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9 的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)及產(chǎn)業(yè)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株與試劑 動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9（V9），由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

TPY 液體培養(yǎng)基（配方：葡萄糖5.00 g/L，水解酪蛋白10.00 g/L，大豆胨5.00 g/L，酵母粉2.00 g/L，K2HPO42.00 g/L，氯化鎂0.50 g/L，硫酸鋅0.25 g/L，氯化鈣0.15 g/L，氯化鐵0.002×10-3g/L，Twain-80 1.00 g/L，MgSO47H2O 0.10 g/L，L-半胱氨酸0.50 g/L），卡邁舒生物科技有限公司；瓊脂糖、核酸染料、2 000 DNA Marker 等，大連寶生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 設(shè)備與儀器 離心機(jī)，貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)（中國(guó)）有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，恒科技儀器股份有限公司；pH 計(jì)，梅特勒（上海）公司；紫外分光光度計(jì)，NanoDrop 公司；BX50 光學(xué)顯微鏡，OLYMPUS 公司（日本）；Applied biosystems PCR 儀，伯樂(lè)公司等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 V9 活化及傳代培養(yǎng)

1.2.1.1 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 將-80 ℃冷凍保藏的供試菌株接種于TPY（表1）液體培養(yǎng)基中，接種量為1%（體積分?jǐn)?shù)），37 ℃嚴(yán)格厭氧培養(yǎng)（24±0.5）h，每隔2 h 取樣（N=3），于波長(zhǎng)600 nm 處測(cè)定其吸光值、pH 值，繪制生長(zhǎng)曲線。

表1 TPY 液體培養(yǎng)基Table 1 TPY liquid medium

1.2.1.2 連續(xù)傳代培養(yǎng) 將-80 ℃冷凍保藏的V9原始菌種活化2 代后劃線于固體TPY 培養(yǎng)基上，37 ℃厭氧培養(yǎng)（72±0.5）h，挑取單菌落，接種于新鮮液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再以體積分?jǐn)?shù)1%的接種量接種于新鮮液體培養(yǎng)基中連續(xù)傳代培養(yǎng)，將0，25，50，75，100 代分別標(biāo)記為A0，A25，A50，A75 和A100。

1.2.1.3 菌株代數(shù)的計(jì)算 通過(guò)1.2.1.1 節(jié)確定的穩(wěn)定期時(shí)間作為傳代培養(yǎng)時(shí)間，公式為：

式中：N0——以1%接種量接入新鮮液體培養(yǎng)基的初始活菌數(shù)，CFU/mL；Nf——穩(wěn)定期活菌數(shù)，CFU/mL。

1.2.2 V9 連續(xù)傳代培養(yǎng)過(guò)程中表型檢測(cè)

1.2.2.1 菌體形態(tài)觀察 連續(xù)培養(yǎng)100 代過(guò)程中，對(duì)不同代時(shí)的V9 進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢、觀察菌體形態(tài)，并初步確認(rèn)菌株純度。

1.2.2.2 碳水化合物代謝能力 按照API 50CHL試劑盒說(shuō)明書(shū)制備。將A0、A25、A50、A75 和A100菌懸液吸至API 50CHL 碳水化合物鑒定試劑條中，用無(wú)菌石蠟封口，37 ℃嚴(yán)格厭氧培養(yǎng)（48±0.5）h，查看顯色結(jié)果。培養(yǎng)液中所含溴甲粉紫指示劑變?yōu)辄S色（25 號(hào)管變?yōu)楹谏殛?yáng)性反應(yīng)，表明該菌株可利用對(duì)應(yīng)的碳水化合物；反之為陰性反應(yīng)，表明該菌株不可利用對(duì)應(yīng)碳水化合物。49 種碳水化合物見(jiàn)表2。

表2 API 50 CHL 乳桿菌鑒定系統(tǒng)各種碳水化合物一覽表Table 2 API 50 CHL Lactobacillus identification system list of various carbohydrates

1.2.3 V9 基因組分析

1.2.3.1 基因組DNA 提取及純度檢測(cè) 對(duì)V9 的A0、A25、A50、A75 和A100 提取DNA，將提取的DNA通過(guò)Nanodrop 進(jìn)行純 度測(cè)定（A260nm/A280nm，A260nm/A230nm），使用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)條帶完整度及純度進(jìn)行檢測(cè)。使用STE 傳統(tǒng)方法對(duì)菌株全基因組進(jìn)行提取，純度檢測(cè)同上，濃度檢測(cè)使用Qubit，滿足要求后通過(guò)Nanopore 平臺(tái)進(jìn)行全基因組測(cè)序。

1.2.3.2 組裝及環(huán)化 通過(guò)NextDenovo 軟件組裝，然后使用Circlator 軟件將二代數(shù)據(jù)進(jìn)行環(huán)化[17]。通過(guò)Pilon 軟件使用二代數(shù)據(jù)對(duì)三代數(shù)據(jù)進(jìn)行Polish[18-19]。最終獲得不同代時(shí)的V9 全基因組序列。

1.2.3.3 平均核苷酸一致性計(jì)算 參考Goris等[20]的方法，對(duì)V9 不同代時(shí)菌株基因組與其原始基因組進(jìn)行平均核苷酸一致性計(jì)算，用自制Perl 腳本比較菌株間的平均核苷酸一致性值。

1.2.3.4 SNP 位點(diǎn)分析 以V9 原始序列作為參考基因組，使用Mummer 軟件對(duì)菌株不同代時(shí)的SNP 位點(diǎn)進(jìn)行識(shí)別分析，利用Soapsnp 軟件進(jìn)行SNP 位點(diǎn)檢測(cè)驗(yàn)證[21]。

1.2.3.5 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建 將1.2.2.4 節(jié)識(shí)別的SNP 位點(diǎn)整理成序列，利用軟件ITOL 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)行可視化。

1.2.3.6 碳水化合物活性酶分析 將V9 不同代時(shí)菌株的全基因組與碳水化合物活性酶（CAZymes）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能注釋，根據(jù)注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)菌株中潛在的CAZymes 家族，通過(guò)TBtools軟件進(jìn)行可視化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 V9 生長(zhǎng)曲線

微生物的不同生長(zhǎng)周期，菌種的生理狀態(tài)有所差異[22]。菌種的傳代通常選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期或者穩(wěn)定期初期為宜。吸入射光（OD600nm）會(huì)因細(xì)胞的散射作用而呈現(xiàn)對(duì)應(yīng)的變化趨勢(shì)，當(dāng)吸光值為600 nm 時(shí)，在一定程度上可以反映培養(yǎng)液中V9的生長(zhǎng)變化趨勢(shì)[23]，如圖1 所示。

圖1 動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9 原始菌株生長(zhǎng)曲線Fig.1 The growth curve of the original B.animalis subsp.lactis V9

V9 在37 ℃、厭氧培養(yǎng)24 h 過(guò)程中pH 值、OD600nm的變化趨勢(shì)：0～8 h V9 處于延滯期，OD600nm上升緩慢，8 h 后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，OD600nm迅速上升，pH值大幅度下降，20 h 時(shí)OD600nm達(dá)到最 大值，之后趨于平緩，進(jìn)入穩(wěn)定期。

2.2 V9 菌株代數(shù)計(jì)算結(jié)果

根據(jù)上述繪制的V9 生長(zhǎng)曲線，對(duì)其在生長(zhǎng)初始及穩(wěn)定初期進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算菌株的代數(shù)。具體結(jié)果見(jiàn)表3。V9 初始活菌數(shù)為（2.70±0.52）×106CFU/mL，對(duì)數(shù)末期活菌數(shù)為（2.79±0.24）×108CFU/mL，參照1.2.1.3 節(jié)菌株生長(zhǎng)代時(shí)計(jì)算方法，到達(dá)穩(wěn)定期V9 的生長(zhǎng)代數(shù)約為6.69 代，且在20 h 進(jìn)入穩(wěn)定期，故以24 h 為傳代周期，平均每天傳1 次，約6.69 代，連續(xù)傳100 代，約15 d 完成。

表3 動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9 原始菌株代數(shù)結(jié)果（n=3，）Table 3 Algebraic results of the starting strain of B.animalis subsp.lactis V9（n=3，）

表3 動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9 原始菌株代數(shù)結(jié)果（n=3，）Table 3 Algebraic results of the starting strain of B.animalis subsp.lactis V9（n=3，）

表4 不同代時(shí)動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9 碳水化合物（API 50CHL）利用情況（n=3，）Table 4 Utilization of carbohydrates（API 50CHL）of B.animalis subsp.lactis V9 in different generations（n=3，）

表4 不同代時(shí)動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9 碳水化合物（API 50CHL）利用情況（n=3，）Table 4 Utilization of carbohydrates（API 50CHL）of B.animalis subsp.lactis V9 in different generations（n=3，）

（續(xù)表4）

注：“+”表示可利用；“-”表示不可利用。

2.3 V9 連續(xù)傳代培養(yǎng)過(guò)程中表型研究

2.3.1 菌株連續(xù)傳代過(guò)程中的菌體形態(tài)觀察 對(duì)V9 在A0、A25、A50、A75 和A100 菌懸液進(jìn)行 革蘭氏染色，顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。對(duì)比結(jié)果見(jiàn)圖2。V9 連續(xù)傳100 代菌體形態(tài)均屬于動(dòng)物雙歧桿菌典型形態(tài)，且不同代時(shí)的菌體形態(tài)無(wú)明顯差異。

2.3.2 碳水化合物代謝能力 梅里埃碳水化合物鑒定（API 50CHL）試劑盒可對(duì)不同碳水化合物的代謝能力進(jìn)行分析，并用于菌株鑒定或分型。V9可利用12 種碳水化合物，包括L-阿拉伯糖、D-核糖、D-葡萄糖、苦杏仁苷、七葉靈檸檬酸鐵、D-麥芽糖、D-乳糖、D-密二糖、D-蔗糖、D-棉子糖和D-龍膽二糖，且V9 在A0、A25、A50、A75 及A100時(shí)碳水化合物代謝能力無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

2.4 V9 連續(xù)傳代中基因組研究結(jié)果

2.4.1 GTDB 基因組數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì) 利用NextDenovo 軟件對(duì)3 代測(cè)序得到的原始Reads 進(jìn)行組裝，組裝完成后將5 個(gè)代時(shí)的V9（N=3）分別與GTDB數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)表5。GTDB 比對(duì)結(jié)果顯示該菌株屬于動(dòng)物雙歧桿菌（Bifidobacterium animalis）。

表5 GTDB 比對(duì)結(jié)果Table 5 GTDB comparison results

2.4.2 基因組信息 利用Circlator 軟件將組裝后的三代數(shù)據(jù)進(jìn)行環(huán)化，并使用Pilon 軟件對(duì)Nanopore 測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證[17]。最終得到不同代時(shí)V9 的基因組序列。分析其基因組信息，結(jié)果顯示A0、A25、A50、A75 和A100 的V9 平均基因組大小為1.96 Mb，平均GC 含量為60.48%，且無(wú)質(zhì)粒，結(jié)果見(jiàn)表6。參考基因組的大小為1.94 Mb，GC含量為60.50%，傳代過(guò)程中的不同代時(shí)V9 與原始參考菌株基因信息無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表6 動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9 基因組信息Table 6 B.animalis subsp.lactis V9 genome information

2.4.3 ANI 計(jì)算 平均核苷一致性（ANI）是反映近緣菌株間平均堿基相似度最重要的指標(biāo)。通常，當(dāng)ANI 值大于95%時(shí)為同一種或亞種[24]。為了在基因組水平上評(píng)估V9 連續(xù)傳代過(guò)程中菌株間的遺傳關(guān)系，計(jì)算V9 5 個(gè)代時(shí)的ANI 值，并用TBtools 軟件對(duì)ANI 值可視化。如圖3 所示，不同代時(shí)的V9 間表現(xiàn)出高度相似性，ANI 值均大于99.99%，表明傳代過(guò)程中菌株均屬同一亞種，即動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種。

2.4.4 SNP 分析 單核苷酸多態(tài)性（SNP）是指在基因組層面上，因單個(gè)核苷酸的變異而導(dǎo)致的DNA 序列的多態(tài)性[25]。本研究以V9 原始序列作為參考基因組，對(duì)不同代時(shí)的株菌SNP 位點(diǎn)進(jìn)行識(shí)別分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同代時(shí)株菌中共鑒定到42個(gè)SNP 位點(diǎn)，其中包括4 個(gè)同義突變，9 個(gè)非同義突變，其余29 個(gè)位于基因間區(qū)。將SNPs 位點(diǎn)結(jié)合gff 進(jìn)行功能注釋，得到與SNPs 突變相關(guān)的基因及功能，如表7 所示。非同義突變分別位于ISL3樣元素IS2001 家族轉(zhuǎn)運(yùn)酶、ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ATP結(jié)合蛋白/滲透酶、C69 家族二肽酶、糖苷-戊苷-己酮陽(yáng)離子同向轉(zhuǎn)運(yùn)的基因上，同時(shí)這些突變均未發(fā)生在影響碳水化合物酶功能的基因上。

在連續(xù)傳代的過(guò)程中高頻突變數(shù)量較少，檢測(cè)到5 個(gè)SNP 發(fā)生在第0 代基因組與參考基因組之間，一旦建立將穩(wěn)定存在。菌株低頻突變被檢測(cè)到的數(shù)量均小于21，其鑒定為同一菌株。分析發(fā)現(xiàn)0 代的菌株與25 代菌株相比，沒(méi)有穩(wěn)定遺傳的SNP 位點(diǎn)，A25-3 與A50-3 菌株在同一基因位點(diǎn)僅發(fā)現(xiàn)一個(gè)SNP；第50 代與75 代不存在相同位點(diǎn)SNP；A75-1 與A100-1 菌株在同一基因位點(diǎn)僅發(fā)現(xiàn)一個(gè)SNP，并沒(méi)有穩(wěn)定遺傳。陳霞[25]以動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種AD011 全基因組序列作為參考，研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9、Bi04 和DSM10140 共存在276 個(gè)SNP 位點(diǎn)，其中包括38個(gè)同義突變、178 個(gè)非同義突變、60 個(gè)位于基因間區(qū)，平均每株菌擁有92 個(gè)SNP，判定為少數(shù)突變。相比較V9 不同代時(shí)的SNP 多態(tài)性極少，遺傳異質(zhì)性較低，因此，V9 在連續(xù)傳代過(guò)程中有較好的遺傳穩(wěn)定性。

2.4.5 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可直觀反映同一群體內(nèi)不同個(gè)體間的遺傳距離，通過(guò)其判斷菌株在連續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中的穩(wěn)定性[27]。聚集在同一分支，表明菌株之間的多樣性較低，遺傳距離較近。進(jìn)一步了解V9 不同代時(shí)15 株的遺傳距離，以V9 原始基因組序列為參考基因組，基于15 株菌的SNPs 序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖4 所示。不同代時(shí)的V9 與參考基因組聚在同一分支，親緣性較近，具有高度相似的遺傳特性。

2.4.6 碳水化合物活性酶注釋 碳水化合物是生物體維持生命活動(dòng)所需能量的主要來(lái)源。碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(kù)（CAZy）是物質(zhì)對(duì)碳水化合物及其衍生物的合成及分解的酶類數(shù)據(jù)庫(kù)[26]，其將碳水化合物活性酶分成為六大基因家族，包括糖苷水解酶（GHs）家族、糖基轉(zhuǎn)移酶家族（GTs）家族、多糖裂解酶（PLs）、碳水化合物酯酶（CEs）、輔助氧化還原酶（AAs）和碳水化合物鏈接模塊（CBMs）[27]。其中GH s 家族主要作用是糖苷鍵的水解和重排，GTs 家族主要作用是糖苷鍵的形成，PLs 家族主要作用是糖苷鍵的非水解裂解，CEs 家族主要作用是水解碳水化合物的酯類，AAs 家族主要作用是與CAZymes 協(xié)同作用的氧化還原酶，CBMs 家族主要作用是與碳水化合物結(jié)合。為在全基因組水平上了解V9 不同代時(shí)菌株對(duì)碳水化合物的代謝能力，通過(guò)碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(kù)在DBCAN2 網(wǎng)站上對(duì)V9 的碳水化合物活性酶功能基因進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5 所示。

共注釋到四大類碳水化合物活性酶的62 個(gè)小類基因家族，包括15 個(gè)糖苷水解酶家族（GH）、7 個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶家族（GT）、6 個(gè)碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域家族（CBM）和3 個(gè)碳水化合物酯酶家族（CE）。不同代時(shí)菌株注釋到的碳水化合物活性酶類不存在顯著差異（P>0.05），碳水化合物代謝相關(guān)基因基本一致。由此表明V9 不同代時(shí)菌株碳水化合物代謝功能基因高度保守，遺傳穩(wěn)定性良好。

3 結(jié)論

對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9 連續(xù)傳100 代過(guò)程中的表型特征及基因組穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明：V9 在連續(xù)傳100 代過(guò)程中具有穩(wěn)定的表型特征、分子遺傳特征，表明其具有良好的遺傳穩(wěn)定性，有利于產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。