何世霞,謝文鵬,郭欣欣,呂育財,3,張文,3,楊瀟,3,龔大春,3*

1(湖北省生物酵素工程技術(shù)研究中心(三峽大學(xué)),湖北 宜昌,443002)2(三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院,湖北 宜昌,443002)3(中國輕工業(yè)功能酵母重點實驗室(三峽大學(xué)),湖北 宜昌,443002)

近年來,隨著聚酰胺產(chǎn)品需求量在全球范圍內(nèi)的迅速增長[1],戊二胺作為己二胺結(jié)構(gòu)類似物[2],可與己二酸聚合制備性能優(yōu)良的新型生物基聚酰胺PA56,可解決由石油為原料的化學(xué)生產(chǎn)制備己二胺所導(dǎo)致的能源短缺和環(huán)境污染等問題[3]。戊二胺應(yīng)用廣泛,如在農(nóng)業(yè)上,其作為“第二信使”可調(diào)節(jié)植物延緩衰老、促進(jìn)植物開花結(jié)實[4-5]等;在醫(yī)藥領(lǐng)域,其可作為一種治療痢疾的有效藥物[6];還參與微生物細(xì)胞內(nèi)鐵離子濃度的調(diào)節(jié)及關(guān)閉微生物蛋白通道等[7-9]。目前,利用微生物生產(chǎn)戊二胺已成為研究的熱點[10-11]。

賴氨酸脫羧酶是一種折疊型I型5′-磷酸吡哆醛依賴酶[12],催化L-賴氨酸生產(chǎn)戊二胺,存在于植物[13]、動物[14]和各種微生物中[15-19]。2011年,KANJEE等[20-21]發(fā)現(xiàn)pH值為5.5時,大腸桿菌CadA具有高催化活性,但在堿性條件下,CadA的催化活性和穩(wěn)定性顯著降低,不利于戊二胺(強(qiáng)堿)的生產(chǎn)。2016年,李乃強(qiáng)等[22]對產(chǎn)酸克雷伯氏菌的賴氨酸脫羧酶進(jìn)行異源表達(dá)并研究其酶學(xué)性質(zhì),結(jié)果表明,粗酶最適pH為5.5,隨著pH增加,酶活力逐漸降低。另外,鑒于已報道的賴氨酸脫羧酶對其酶學(xué)性質(zhì)研究的尚不多見,因此,開展賴氨酸脫羧酶酶學(xué)性質(zhì)的研究,不僅可以豐富數(shù)據(jù)庫,而且還為獲得具有堿性條件下穩(wěn)定和高催化活性的賴氨酸脫羧酶,實現(xiàn)高產(chǎn)戊二胺奠定基礎(chǔ)。

本文主要通過克隆來源于大腸桿菌K12 MG1655中經(jīng)過密碼子優(yōu)化后的賴氨酸脫羧酶基因,將該基因在E.coliBL21(DE3)中進(jìn)行異源表達(dá),利用pET-28a(+)中的His標(biāo)簽分離純化重組酶Ldc,并對其進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究。本研究將為后期該酶的分子改造及工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)由本實驗室鑒定及保存;質(zhì)粒載體pET-28a(+),上海生工生物工程有限公司;限制性內(nèi)切酶BamH I和Hind III,美國New England Biolabs公司;質(zhì)粒抽提試劑盒,南京諾唯贊生物科技股份有限公司;DL10000 DNA Marker、蛋白質(zhì)電泳Marker、6×loading Buffer、5×蛋白上樣緩沖液,TaKaRa有限公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG),純度>99.9%,Calbiochem公司;Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒,北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;L-賴氨酸,上海源葉生物科技有限公司;乙腈(HPLC級,>99.99%),北京邁瑞達(dá)科技有限公司;丹磺酰氯,ACMEC/吉至生化公司;其他試劑為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純;PCR引物合成及測序由北京擎科生物科技有限公司武漢分公司完成。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建及驗證

通過在蘇州金唯智公司進(jìn)行全基因合成大腸桿菌K12 MG1655中賴氨酸脫羧酶基因序列,經(jīng)過密碼子優(yōu)化后,本文中涉及到的引物如表1所示,添加BamH I和Hind III酶切位點,將基因克隆至表達(dá)載體pET-28a(+),并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)中,轉(zhuǎn)化后,取適量菌液涂布在含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基平板上,37 ℃避光培養(yǎng),挑取正確的克隆宿主進(jìn)行培養(yǎng),使用質(zhì)粒抽提試劑盒提取重組質(zhì)粒pET-28a(+)-Ldc(圖1),用內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切驗證,命名為重組菌株E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-Ldc。

圖1 重組表達(dá)載體pET-28a(+)-Ldc結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structural diagram of the recombinant expression vector pET-28a(+)-Ldc

表1 本研究使用到的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 重組菌株培養(yǎng)

挑取在卡那霉素抗性LB平板培養(yǎng)基上,含有重組表達(dá)質(zhì)粒的單菌落接入含50 μg/mL卡那霉素的10 mL LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng),作為種子液。按OD600值為4的比例接種至100 mL搖瓶培養(yǎng)基中,23 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6左右,加入IPTG使終濃度為0.5 mmol/L,23 ℃誘導(dǎo)16～18 h,表達(dá)目的蛋白。8 000 r/min離心10 min收集菌體細(xì)胞,用緩沖液洗滌后,-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 賴氨酸脫羧酶Ldc純酶制備

所有的純化步驟均在冰水浴下進(jìn)行。將離心收集的菌體細(xì)胞懸浮于緩沖液中(20 mmol/L Tris-HCl,10 mmol/L咪唑,0.5 mol/L NaCl,100 mmol/L PMSF,pH 7.2),超聲波破碎30 min(工作4 s,停6 s),4 ℃、10 000 r/min離心10 min取上清液。

粗酶液使用Ni-Agarose柱分離純化,將具有His標(biāo)簽的目的蛋白上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后上柱,分別用10倍柱體積Binding Buffer(20 mmol/L Tris-HCl,20～500 mmol/L咪唑,0.5 mol/L NaCl,pH 7.2)進(jìn)行洗雜洗脫,并按每1 mL流出液分管收集,保存于4 ℃?zhèn)溆?。蛋白樣品?jīng)SDS-PAGE檢測,記錄并分析結(jié)果。

1.2.4 蛋白的分析與測定

重組蛋白分析采用SDS-PAGE[23],考馬斯亮藍(lán)R-250染色顯示蛋白條帶;采用Bradford法[24]測定蛋白濃度。

1.2.5 重組酶Ldc活力測定方法

采用高效液相色譜儀定量檢測賴氨酸脫羧酶的酶活力。測定方法:總反應(yīng)體積1 mL,包括600 μL 100 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)及200 μL 25 mmol/LL-賴氨酸緩沖液,加入5′-磷酸吡哆醛至終濃度為0.1 mmol/L,溫育5 min,最后加入100 μL純酶液,在37 ℃反應(yīng)30 min,煮沸5 min終止反應(yīng),離心取上清液進(jìn)行衍生反應(yīng),HPLC測定戊二胺生成量。酶活力定義:在37 ℃、pH 7.0條件下,每1 min催化生成1 μmol戊二胺所需的酶量定義為1 U。并按公式(1)計算酶活力:

(1)

式中:c,戊二胺的濃度,μmol/L;V總,總反應(yīng)體積,mL;t,反應(yīng)時間,min;V,酶液添加體積,mL。

1.2.6 戊二胺測定方法

參照文獻(xiàn)[25]的方法,稍加修改。取400 μL待測樣品溶液于2 mL容量瓶中,加入40 μL 2 mol/L NaOH溶液和120 μL飽和NaHCO3溶液,振蕩10 s,加入800 μL丹磺酰氯溶液,振蕩混勻,40 ℃避光反應(yīng)45 min。衍生反應(yīng)完畢后,在混合液中加入40 μL氨水,混勻,靜置30 min進(jìn)行終止反應(yīng),用乙腈定容,振蕩混勻,用2 mL注射器吸取適量溶液,0.22 μm濾膜過濾至進(jìn)樣小瓶中,HPLC測定。

色譜柱C18反相色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相V(乙腈)∶V(0.1 mol/L乙酸銨)=8∶2;柱溫35 ℃;流速1 mL/min;檢測波長254 nm;進(jìn)樣量20 μL。

1.2.7 重組酶Ldc的酶學(xué)性質(zhì)研究

1.2.7.1 重組酶Ldc的pH穩(wěn)定性考察

分別將純酶液溶解于pH 4.0～10.0(pH 4.0、5.0、5.7、6.0采用檸檬酸-檸檬酸鈉體系;pH 7.0、8.0采用磷酸鹽體系;pH 9.0、10.0采用甘氨酸-NaOH體系)的100 mmol/L緩沖液中,37 ℃保溫2 h,按照1.2.5節(jié)的方法測定不同pH值下賴氨酸脫羧酶Ldc的相對酶活力,考察此酶的pH穩(wěn)定性。

1.2.7.2 重組酶Ldc的溫度穩(wěn)定性考察

取適量純酶液,采用pH 7.0的磷酸鹽緩沖液,置于20～80 ℃條件下保溫2 h,按照1.2.5節(jié)的方法測定不同溫度下賴氨酸脫羧酶Ldc的酶殘留活性,考察溫度對酶穩(wěn)定性的影響。

1.2.7.3 不同金屬離子對純酶酶活力的影響

在反應(yīng)體系中分別加入終濃度為5 mmol/L的金屬離子(Mn2+、Mg2+、Co2+、Fe2+、Cu2+、Ni2+、Ca2+),測定相對酶活力,研究金屬離子對賴氨酸脫羧酶的影響,以不加金屬離子的作為空白對照。

1.2.7.4 重組酶Ldc的動力學(xué)參數(shù)Km、Vmax、kcat和催化特異性常數(shù)kcat/Km測定

在Ldc最適pH值下的酶反應(yīng)體系中加入0.25～1.25 mmol/L等不同濃度的L-賴氨酸,測定在一定時間(保證酶的催化處于一級動力學(xué)范圍內(nèi))內(nèi)生成戊二胺的量,以此來計算賴氨酸脫羧酶的反應(yīng)速率。利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖,計算出此酶的Km、Vmax值。依據(jù)1.2.4節(jié)的方法測定酶的蛋白含量。酶的轉(zhuǎn)換數(shù)kcat是一個催化常數(shù),可以根據(jù)公式kcat=Vmax/[Et]計算得出。其中,[Et]表示酶的初始總濃度。kcat/Km值是衡量酶的催化效率參數(shù),又稱特異性常數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 賴氨酸脫羧酶Ldc在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)與重組酶的純化

2.1.1 重組質(zhì)粒pET-28a(+)-Ldc的驗證

對正確的陽性克隆重組質(zhì)粒pET-28a(+)-Ldc經(jīng)BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切,1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析,結(jié)果如圖2所示,可見有2條帶,一條為載體片段,約5.3 kb;另一條為目的基因片段,約2.1 kb,插入的外源片段大小與預(yù)期相符,全長為2 148 bp,包含715個氨基酸的編碼序列。

M-DL 10000 DNA Marker;1,2-BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切重組質(zhì)粒pET-28a(+)-Ldc圖2 重組質(zhì)粒pET-28a(+)-Ldc的酶切電泳圖譜Fig.2 Digestion electrophoresis of the recombinant expression plasmid pET-28a(+)-Ldc

2.1.2 咪唑洗脫濃度的探索

將濕菌體細(xì)胞超聲波破碎后進(jìn)行SDS-PAGE檢測蛋白表達(dá)情況。由于目的蛋白N端融合的His-Tag與咪唑可以競爭性結(jié)合在氮基三乙酸表面,因此通過改變咪唑濃度,可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)在鎳柱上的結(jié)合或洗脫。使用Ni-Agarose柱,并采用不同咪唑濃度(50、100、200、300、400、500 mmol/L)的緩沖液進(jìn)行洗脫并收集洗脫液。由圖3可知,50 mmol/L咪唑緩沖液能洗下大部分雜蛋白和目的蛋白,咪唑緩沖液濃度在200 mmol/L時洗出全部目的蛋白。因此,采用含有20 mmol/L咪唑的緩沖液充分洗滌雜蛋白,然后再使用200 mmol/L咪唑的緩沖液洗脫目的蛋白。此外,誘導(dǎo)的重組菌破碎的上清液和沉淀中均出現(xiàn)蛋白條帶,結(jié)合Ldc的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù),則為81.2 kDa,由此可知,該賴氨酸脫羧酶在宿主菌大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)成功,但少部分以包涵體形式不可溶表達(dá)。

M-蛋白Marker;1-粗酶液;2-誘導(dǎo)重組菌破碎沉淀;3-鎳柱流穿液;4～9:50、100、200、300、400、500 mmol/L咪唑洗脫液圖3 目的蛋白Ldc咪唑洗脫結(jié)果Fig.3 Imidazole elution of the Ldc protein

2.1.3 目的蛋白SDS-PAGE檢測

采用1.2.2節(jié)重組菌株誘導(dǎo)培養(yǎng)的濕菌體細(xì)胞,按照1.2.3節(jié)的方法經(jīng)Ni-Agarose柱親和層析純化后,與重組菌菌體破壁上清液相比,純化后的目的蛋白條帶較單一(圖4泳道5)。洗脫液總蛋白含量為15.99 mg,比酶活力為0.56 U/mg。

M-蛋白Marker;1-粗酶液;2-鎳柱流穿液;3,4-鎳柱洗雜液;5-洗脫液圖4 重組蛋白純化樣品的SDS-PAGE圖譜Fig.4 SDS-PAGE pattern of the recombinant protein

2.2 重組酶Ldc的酶學(xué)性質(zhì)研究

2.2.1 重組酶Ldc的pH穩(wěn)定性考察

本研究考察重組酶Ldc在pH 4.0～10.0的純酶酶活力變化。由圖5可知,重組酶Ldc在pH 5.7～8.0,相對酶活力保持80%上,說明該酶穩(wěn)定性較好,具有很好的pH適應(yīng)性。在pH低于5.7和高于8.0條件下,重組酶相對酶活力下降較快,表明在實際操作中要控制好催化環(huán)境的酸堿性。KIM等[26]報道來自肺炎克雷伯菌的賴氨酸脫羧酶LdcC也采用His標(biāo)簽表達(dá)重組得到,其酶pH穩(wěn)定范圍較窄,最穩(wěn)定的pH值為7.0。重組酶Ldc耐酸堿性的能力為該酶的分子改造提供了依據(jù)。

圖5 重組酶Ldc的pH穩(wěn)定性Fig.5 pH stability of the recombinant carbonyl reductase Ldc

2.2.2 重組酶Ldc的溫度穩(wěn)定性考察

由圖6可知,該酶在20～60 ℃的溫度范圍內(nèi)穩(wěn)定性很好,相對酶活力保持在80%以上,但溫度達(dá)到60 ℃以上,酶穩(wěn)定性下降很快,圖6顯示,重組酶T50值為72 ℃,經(jīng)驗證,72.1 ℃時重組酶活力降低為原來的50%,表明該酶的耐熱穩(wěn)定性較好。OSIRE等[27]報道來自氧化葡糖桿菌DSM3504的賴氨酸脫羧酶(GoLDC)采用His-TrapTMHP色譜柱的AKTA Prime系統(tǒng)純化蛋白,其酶的溫度穩(wěn)定性范圍跟本研究基本一致,最適溫度為30 ℃。

圖6 重組酶Ldc溫度穩(wěn)定性Fig.6 Temperature stability of the recombinant carbonyl reductase Ldc

2.2.3 金屬離子對重組酶Ldc活性的影響

很多酶促反應(yīng)需要金屬離子作為輔因子,因此在酶促反應(yīng)中經(jīng)常添加某金屬離子來促進(jìn)或抑制酶促反應(yīng)的進(jìn)行。由圖7可知,賴氨酸脫羧酶的酶活力在一定濃度下受金屬離子的影響較大。在終濃度為5 mmol/L條件下,除Mg2+和Ca2+外,其他5種金屬離子均對賴氨酸脫羧酶具有抑制影響。抑制作用最明顯的是Cu2+,其次是Ni2+。而Mg2+和Ca2+對賴氨酸脫羧酶有微弱的激活作用。楊穎等[28]研究發(fā)現(xiàn),屬于肺炎克雷伯桿菌屬的菌株GXW-1在5 mmol/L的Cu2+作用下,強(qiáng)烈抑制了酶活性,相對酶活力下降到初始酶活力的20%以下,這與本研究結(jié)果大體一致。因此,我們認(rèn)為賴氨酸脫羧酶可能存在結(jié)合位點能夠與這些金屬離子結(jié)合,從而改變了酶的構(gòu)象并影響了酶的活性。

圖7 金屬離子對重組酶Ldc活力的影響Fig.7 Effect of metal ions on the activity of Ldc

2.2.4 重組酶Ldc的動力學(xué)參數(shù)及催化特性參數(shù)

在酶促反應(yīng)體系中設(shè)定不同的L-賴氨酸濃度梯度,在一定反應(yīng)時間內(nèi)使其成為酶促反應(yīng)的限制因素。利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖,計算出此酶的Km為0.011 mol/L,Vmax值為0.643 mmol/(L·min),比活力為0.56 U/mg,酶的轉(zhuǎn)換數(shù)kcat經(jīng)計算為0.23 s-1,kcat/Km值為20.91 L/(mmol·s)。

3 結(jié)論

本實驗在大腸桿菌BL21(DE3)中成功實現(xiàn)了經(jīng)過密碼子優(yōu)化的大腸桿菌K12 MG1655中賴氨酸脫羧酶Ldc基因的異源表達(dá)。結(jié)果表明,該賴氨酸脫羧酶Ldc的基因序列全長2 148 bp,編碼715個氨基酸,重組酶分子質(zhì)量大小在81.2 kDa左右。采用Ni-Agarose親和層析對重組酶Ldc分離純化后,對底物L(fēng)-賴氨酸的比活力為0.56 U/mg。重組酶Ldc適宜pH范圍在5.7～8.0,隨著戊二胺的生產(chǎn),有利于在生產(chǎn)過程中,減少酸性緩沖液的加入,既節(jié)省試劑,又利于后期產(chǎn)品純化和提高產(chǎn)品質(zhì)量,此外,還可通過分子定向進(jìn)化進(jìn)一步提升其適應(yīng)范圍。重組酶Ldc在60 ℃以下穩(wěn)定性很好,相對酶活力保持在80%以上,但隨著溫度的升高,酶穩(wěn)定性下降很快。常見金屬離子實驗表明,Cu2+對該酶的抑制作用最強(qiáng),Mg2+和Ca2+卻有微弱的激活作用。后期將對該酶進(jìn)行分子改造,篩出高酶活力的突變菌株,并研究其酶學(xué)性質(zhì)及產(chǎn)物戊二胺的初步分離純化,為工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。