■ 宋增武 孫立瑞 鎖博海 劉思淼 葛懌澤 辛嘉英，2*

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150076；2.中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所羰基合成與選擇氧化國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730000）

聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織預(yù)測，到2030 年，水產(chǎn)養(yǎng)殖生物將占世界海產(chǎn)品供應(yīng)量的53%[1]，全球水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量將增加2 600萬噸，額外需要4 000萬噸飼料[2]，而水產(chǎn)養(yǎng)殖的進(jìn)一步增長可能受到飼料資源短缺的限制[3-4]。由于水產(chǎn)動物對蛋白質(zhì)含量要求較高，一般是畜禽的2～4 倍，因此目前水產(chǎn)飼料中蛋白質(zhì)的主要來源是利用魚、蝦、蟹制成的魚粉，其中含有高質(zhì)量的蛋白質(zhì)和必需氨基酸以及未知生長因子，具有良好的適口性、較高的消化吸收率[5]，可保證水產(chǎn)養(yǎng)殖生物保持較快速度生長，提高收益。魚粉的廣泛使用直接導(dǎo)致了魚粉飼料供應(yīng)不足，價格居高不下[6-7]，因此急需利用現(xiàn)有自然資源尋找可替代蛋白飼料，進(jìn)而開發(fā)高質(zhì)量的替代飼料資源[8-9]。從這個意義上說，單細(xì)胞蛋白（Single Cell Protein，SCP）是替代魚粉蛋白的有效解決方案[10-11]。

單細(xì)胞蛋白，也被稱為微生物蛋白、菌體蛋白，是指利用酵母、霉菌、藻類等單細(xì)胞生物經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)和擴(kuò)增之后獲得的生物體蛋白[12-14]。人類在幾個世紀(jì)前就開始把微生物用作食物和飼料，許多微生物自古以來就被用作飲食的一部分，例如公元前2500 年，發(fā)酵酵母就被用作面包的發(fā)酵劑，公元前50-100 年，埃及人和希臘人使用乳酸菌處理牛奶和奶酪[15]，非洲人把具有“蛋白之王”之稱的螺旋藻用作食物來彌補(bǔ)當(dāng)?shù)厝巳鄙俚牡鞍踪|(zhì)[16]。單細(xì)胞蛋白的生產(chǎn)技術(shù)是在100多年前發(fā)展起來的，而大規(guī)模生產(chǎn)是在20 世紀(jì)出現(xiàn)的。第一次世界大戰(zhàn)前后，德國認(rèn)識到可以使用微生物作為微生物蛋白質(zhì)大量生產(chǎn)，因而，面包酵母是在添加銨鹽的糖蜜培養(yǎng)基中產(chǎn)生的[17-18]。自此以后從細(xì)菌、真菌和藻類培養(yǎng)物中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)被廣泛用于食物和飼料中，由于其蛋白質(zhì)含量高、所含的必需氨基酸種類豐富、脂肪含量低、含有多種微量元素，可以用作膳食補(bǔ)充劑添加在動物飲食中，也可以作為部分蛋白的替代品[19-21]。文章對甲烷氧化菌產(chǎn)SCP的營養(yǎng)特性及在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用效果等作以綜述，綜合評價營養(yǎng)價值對水產(chǎn)動物生長性能及健康的影響。為甲烷氧化菌產(chǎn)SCP在水產(chǎn)飼料領(lǐng)域中的利用和開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 甲烷氧化菌的特性及新菌株的分離鑒定

1.1 甲烷氧化菌的特性

甲烷氧化菌是一類利用甲烷作為唯一碳源和能源的革蘭氏陰性菌，按照是否利用環(huán)境中的氧氣作為電子受體，可分為好氧甲烷氧化菌和厭氧甲烷氧化菌兩大類。工業(yè)上常用于生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的是Ⅰ型甲烷氧化菌中的γ-變形菌門，應(yīng)用較多的是Methylococcus capsulatus（Bath）菌株[22-23]。他們是一類獨(dú)特的革蘭氏陰性細(xì)菌，偏好氧氣濃度較高的環(huán)境，并且更容易進(jìn)行一些基因操作（見表1）。

表1 甲烷氧化菌的分類[24-26]

甲烷氧化菌生長時，以甲烷作為碳和能源的主要來源，把甲烷轉(zhuǎn)化成二氧化碳[27-28]，產(chǎn)生富含蛋白質(zhì)的生物質(zhì)[29-30]，生物質(zhì)中85%～95%來源于CH4[31]。甲烷氧化菌的特征酶是甲烷單加氧酶（MethaneMonooxygenase，MMO）[32]。甲烷氧化菌在MMO 作用下把甲烷氧化為甲醇，在甲烷轉(zhuǎn)化的第一步之后，甲醇被氧化成甲醛，甲醛可以進(jìn)一步氧化或同化為細(xì)胞碳固定途徑的底物。甲醇的氧化由甲醇脫氫酶（Methanol dehydrogenase，MDH）催化，對于革蘭氏陰性嗜甲烷細(xì)菌，甲醇脫氫酶以特定形式存在于胞質(zhì)中，并利用含有吡咯喹啉醌（Pyrroloquinoline Quineone，PQQ）作為其催化輔助因子。產(chǎn)生的甲醛可以以三種方式被使用：第一種是進(jìn)一步氧化成CO2；第二種是通過核酮糖單磷酸（RuMP）循環(huán)同化；第三種通過絲氨酸循環(huán)同化。上述兩個循環(huán)的操作導(dǎo)致產(chǎn)生丙酮酸，然后產(chǎn)生乙酰輔酶A作為進(jìn)一步細(xì)胞代謝的關(guān)鍵中間體。在RuMP途徑中，甲醛用于合成果糖-6-磷酸，并使用指定的核酮糖磷酸合成酶通過糖磷酸中間體進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為核酮糖-5-磷酸，用于生物質(zhì)生長[33]。

1.2 甲烷氧化菌新菌株的分離鑒定

甲烷氧化菌在自然界中分布十分廣泛，濕地、稻田、泥潭沼澤、污水污泥等都有甲烷氧化菌的存在，近年來也有許多學(xué)者分理出具有優(yōu)良蛋白潛質(zhì)的菌株。顧華兵等[34]從污泥中分離、篩選獲得一株甲烷氧化菌MO-01，根據(jù)該菌株的形態(tài)學(xué)、生理生化試驗(yàn)和16S rDNA序列同源性分析，證實(shí)該菌株與Methylobacterium zatmanii菌株有99%的同源性，屬于Methylobacterium屬，優(yōu)化了甲烷氧化菌的發(fā)酵條件，為以后放大生產(chǎn)SCP 提供了科學(xué)基礎(chǔ)。Thu等[35]從厭氧發(fā)酵器的廢水中分離出新的菌株——氧化甲烷BG3菌株，確定該菌株為甲基單胞菌屬，BG3 菌株的生物質(zhì)作為牲畜的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)來源，具有巨大的應(yīng)用潛力。

2 甲烷氧化菌生產(chǎn)SCP 及其與其他菌共培養(yǎng)生產(chǎn)SCP

2.1 甲烷氧化菌生產(chǎn)SCP

20 世紀(jì)90 年代一家挪威公司用莢膜甲基球菌生產(chǎn)了SCP，但由于當(dāng)時廉價的植物蛋白、微生物培養(yǎng)技術(shù)等限制，市場競爭激烈，造價較高的微生物蛋白無法繼續(xù)發(fā)展。近年來，微生物領(lǐng)域迅猛發(fā)展，大豆等植物蛋白價格持續(xù)上漲，導(dǎo)致水產(chǎn)飼料成本上漲[36]。而甲烷氧化菌以甲烷為唯一碳源和能量，不受土地、光照等因素限制，且生產(chǎn)出的SCP 蛋白含量高，吸引企業(yè)進(jìn)行產(chǎn)品商業(yè)化，表2 為甲烷氧化菌生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的商業(yè)化產(chǎn)品。

表2 甲烷氧化菌生產(chǎn)的單細(xì)胞蛋白商業(yè)化產(chǎn)品

2.2 甲烷氧化菌與其他菌共培養(yǎng)生產(chǎn)SCP

甲烷氧化菌來生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白主要分為單一菌種和兩種及兩種以上混合菌進(jìn)行培養(yǎng)生產(chǎn)，單一菌種生長較慢，而混合菌培養(yǎng)中非甲烷菌可以為甲烷菌提供所需的影響因子，可以減少代謝過程中的副產(chǎn)物對甲烷氧化菌的抑制。早在2002年，Bothek等[44]將甲基球菌Bath（Methylococcus capsulatusBath）分別和動脈瘤桿菌屬（Aneurinibacillus）、農(nóng)業(yè)短芽孢桿菌（Brevibacillus agri)、羅爾斯頓屬（Ralstonia）進(jìn)行共培養(yǎng)，研究發(fā)現(xiàn)非甲烷菌可以除去生物反應(yīng)器中的有機(jī)碳、乙酸等，從而促進(jìn)甲烷氧化菌的生長。Nunes 等[45]選用了產(chǎn)堿桿菌、動脈瘤芽孢桿菌、農(nóng)業(yè)短芽孢桿菌三種不同的異養(yǎng)細(xì)菌，分別進(jìn)行和甲烷氧化菌共培養(yǎng)。研究發(fā)現(xiàn)異養(yǎng)細(xì)菌不會利用會在甲烷進(jìn)行代謝，但是可以消耗反應(yīng)器中的有機(jī)碳，進(jìn)而增加了生物量的積累濃度，提高單細(xì)胞蛋白的產(chǎn)量，為甲烷氧化菌和其他微生物共培養(yǎng)提供了新思路。

Rasouli 等[46]把小球藻（Chlorella sorokiniana）和莢膜甲基球菌（Methylococcus capsulatus）共培養(yǎng)生產(chǎn)SCP，發(fā)現(xiàn)可以把工業(yè)廢水中的營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)換為SCP，蛋白質(zhì)組成與傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)來源相似，表明藻類或細(xì)菌的生物質(zhì)可以替代它們作為不同動物的飼料成分。Hill 等[47]把嗜堿性甲基微球菌20z（Methylomicrobium alcaliphilum 20z）和藍(lán)藻聚球菌PCC 7002（SynechococcusPCC 7002）進(jìn)行共培養(yǎng)，和單一菌種生長組做對比，發(fā)現(xiàn)混合菌生長的時間更久，獲得更高的生物量，可以為生產(chǎn)SCP 提供新思路。這種共培養(yǎng)技術(shù)在利用不同氣體流的能力方面是可擴(kuò)展的，其生物成分由模型細(xì)菌構(gòu)建，可以通過代謝定制來生產(chǎn)一系列生物燃料和生物產(chǎn)品。

肖扎等[48]用甲基單胞菌和嗜甲基單胞菌屬進(jìn)行共培養(yǎng)研究，以污水污泥厭氧消化產(chǎn)生的沼氣和廢棄廢水作為碳氮源來生產(chǎn)SCP，甲基單胞菌的作用是將甲烷氧化為甲醇，而嗜甲基菌的作用是同化積累的甲醇，以避免過量的甲醇對甲基單胞菌生長的抑制[49]，所生產(chǎn)的蛋白質(zhì)可以達(dá)到細(xì)胞干重的41%以上，其中決定了動物生長情況和鰓結(jié)構(gòu)完整性的組氨酸的含量分別是豆粕和魚粕的1.67 倍和2.09 倍[50]。孫立瑞等[51]把甲烷氧化菌和光合菌進(jìn)行共培養(yǎng)，把光合菌和甲烷氧化菌離心后的上清液和超聲破碎的沉淀分別加入甲烷氧化菌和光合菌中，進(jìn)行培養(yǎng)，探究細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)對彼此生長的促進(jìn)或抑制作用，發(fā)現(xiàn)他們之間存在著一定的促進(jìn)作用進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)光合菌在光照條件下吸收甲烷氧化菌同化甲烷產(chǎn)生的CO2，并且產(chǎn)生同化甲烷所需的O2，減少高含量CO2對甲烷氧化菌的抑制，縮短了發(fā)酵周期，增加了單細(xì)胞蛋白的產(chǎn)量[52]。

3 甲烷氧化菌產(chǎn)SCP 的營養(yǎng)特性及其在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用

3.1 甲烷氧化菌產(chǎn)SCP的營養(yǎng)特性

用于生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的微生物有細(xì)菌、真菌、藻類等，微藻生產(chǎn)的單細(xì)胞蛋白主要作為營養(yǎng)補(bǔ)充劑的使用[53]；真菌生產(chǎn)的單細(xì)胞蛋白可以應(yīng)用在人類飲食中，如香腸漢堡中所添加的是一種由絲狀真菌生產(chǎn)的具有類似肉制品質(zhì)地的單細(xì)胞蛋白[54]；細(xì)菌生產(chǎn)的單細(xì)胞蛋白可以應(yīng)用于畜禽飼料，近些年在水產(chǎn)領(lǐng)域應(yīng)用較多[55]。表3匯總了不同來源單細(xì)胞蛋白和動植物蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)。甲烷氧化菌干燥后蛋白含量占總量的70%左右，并且還含有動物機(jī)體所需的多種氨基酸、碳水化合物、多種維生素、核酸、脂肪、無機(jī)鹽等，含量較高的例如K+、Mg2+、Fe3+和Fe2+等，因此可以添加到飼料里為水產(chǎn)動物、畜禽等補(bǔ)充微量元素[59]。從營養(yǎng)成分組成的角度上說，甲烷氧化菌生產(chǎn)的單細(xì)胞蛋白與天然蛋白一致。從必需氨基酸含量上說，與魚粉相比，甲烷氧化菌生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的色氨酸含量較高，賴氨酸含量較低。與棉籽相比，甲烷氧化菌生產(chǎn)SCP 的含有更多的蘇氨酸和蛋氨酸。表4 為甲烷氧化菌產(chǎn)的單細(xì)胞蛋白和其他飼料中氨基酸含量。

表3 不同來源蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)[56-58]

表4 甲烷氧化菌產(chǎn)SCP和其他飼料氨基酸組成(g/kg干物質(zhì))[60-61]

3.2 甲烷氧化菌產(chǎn)SCP在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用

經(jīng)過國內(nèi)外專家進(jìn)行不同物種的飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，已經(jīng)明確甲烷氧化菌生產(chǎn)的SCP 可以部分替代魚粉蛋白，緩解飼料蛋白緊缺的現(xiàn)狀。飼喂加入SCP 的飼料，會改善魚、蝦等腸道問題，提高成活率等[62]。還有一些專家直接采用成品的甲烷氧化菌生產(chǎn)的蛋白飼料，證實(shí)了甲烷氧化菌生產(chǎn)的單細(xì)胞蛋白應(yīng)用在水產(chǎn)領(lǐng)域是安全無害的，并且具有一定優(yōu)勢。

3.2.1 改變腸道形態(tài)，降低死亡率

近年來，許多專家發(fā)現(xiàn)用甲烷氧化菌生產(chǎn)的SCP替代魚粉飼料，會降低魚、蝦等水產(chǎn)動物的死亡率。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，給水產(chǎn)動物飼喂含有SCP 的飼料，可以提高腸道微絨毛高度、增加了腸道黏膜褶皺深度，從而改善了腸道菌群，進(jìn)而提高了蝦的抗病率。陳永康等[63]進(jìn)行了12 d的副溶血性弧菌挑戰(zhàn)，對白蝦注射副溶血弧菌，飼喂SCP 與飼喂普通魚粉蛋白的白蝦作對比，發(fā)現(xiàn)用SCP替代15%的魚料蛋白飼喂的白蝦死亡率顯著下降，對白蝦的腸道進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)飼喂含有SCP 的飼料，改善了腸道微絨毛長度、增加了腸道黏膜褶皺高度。Jintasataporn 等[64]也通過飼喂試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對白蝦飼喂含有SCP 的飼料，會減少肝胰腺弧菌屬的負(fù)荷，從而提高蝦的存活率。張啟樂等[65]用莢膜甲基球菌蛋白代替魚粉對幼年大口鱸魚進(jìn)行飼喂，發(fā)現(xiàn)適量的莢膜甲基球菌蛋白可以提高腸壁總長度和腸壁絨毛長度，進(jìn)而提高了鱸魚的成活率。徐冰英等[66]直接采用莢膜甲基球菌蛋白替代基礎(chǔ)飼料中的魚粉蛋白來飼喂幼年黑鯛魚，經(jīng)過70 d 投喂試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)用莢膜甲基球菌蛋白替代24.80%的魚粉蛋白，可以顯著增加魚的中腸微絨毛密度，改變腸道。梁偉興等[67]用SCP 替代魚粉蛋白飼喂養(yǎng)珍珠龍膽石斑魚，在一定范圍內(nèi)，隨著SCP 替代魚粉蛋白含量增加，腸道絨毛高度呈變大趨勢，腸道絨毛密集程度增加。

3.2.2 提高飼料轉(zhuǎn)化率

試驗(yàn)表明，飼喂適量的SCP 飼料，可以提高水產(chǎn)動物的飼料轉(zhuǎn)化率，這可能是飼喂甲烷氧化菌生產(chǎn)的SCP 可以提高部分酶的活性來幫助水產(chǎn)動物進(jìn)食消化。Jintasataporn 等[64]飼喂SCP 的飼料和飼喂普通魚粉飼料的白蝦做對比，發(fā)現(xiàn)飼喂SCP 組的蝦飼料轉(zhuǎn)化率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通飼料組；徐冰英等[66]發(fā)現(xiàn)用8.27%的莢膜甲基球菌蛋白替代魚粉蛋白會增強(qiáng)黑鯛前腸的胰蛋白酶和中腸的淀粉酶活性，從而提高生長性能和飼料轉(zhuǎn)化率；恒宇等[68]把莢膜甲基球菌蛋白添加到幼年鯉魚的日糧中，發(fā)現(xiàn)在日糧中添加6%、8%和10%莢膜甲基球菌蛋白可改善鯉魚的生長性能和飼料利用率。

3.2.3 改善腸炎，保護(hù)腸道

飼料中的豆粕蛋白容易引起鮭科魚類患腸炎，它們對溶劑提取的豆粕特別敏感，主要是由豆粕中一種或多種醇溶性成分引起，而飼喂SCP 替代魚粉的飼料可以改善魚患腸炎的幾率，這可能與甲烷氧化菌的細(xì)胞壁中的脂多糖有關(guān)。Romarheim 等[69]在飼喂大西洋鮭魚的飼料中添加了莢膜甲基球菌細(xì)胞粉，證明了SCP 可以緩解因?yàn)轱曃苟蛊梢鸬哪c炎，起著保護(hù)腸道的作用。Romarheim 等[70]一項(xiàng)研究表明，SCP 可防止豆粕誘發(fā)的腸炎的發(fā)展，并且飼喂大西洋鮭魚的飼料中含有SCP，可以更多地使用豆粕，而不會對腸道健康產(chǎn)生不利影響。Kleiveland 等[71]為了驗(yàn)證這一觀點(diǎn)，用小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在水中添加3.5%葡聚糖硫酸鈉誘發(fā)小鼠患結(jié)腸炎，然后用SCP 飼喂小鼠，最后證實(shí)SCP 有可能通過增強(qiáng)結(jié)腸屏障功能來減弱葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎。

3.2.4 其他功能優(yōu)勢

添加一定量的SCP 替代魚粉蛋白，可以一定程度上改變魚肝臟對于脂類的合成。梁偉興等[67]用SCP替代魚粉蛋白飼喂珍珠龍膽石斑魚，發(fā)現(xiàn)肝臟組織的空泡化面積顯著增加，促進(jìn)了肝臟組織對脂類物質(zhì)的合成和積累，但肝細(xì)胞膜界限清晰，表明SCP 未對石斑魚肝臟組織造成損傷。還有研究表明，隨著飼料中SCP 水平的增加，抗炎基因的表達(dá)量增加，這證明了SCP有利于提高魚類抵抗疾病的能力。張啟樂等[65]發(fā)現(xiàn)關(guān)于炎性細(xì)胞因子基因的變化，增加莢膜甲基球菌蛋白代替魚粉蛋白含量，提高了大口鱸魚的Toll 樣受體2（TLR2）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-1β（IL-10）和轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）的表達(dá)水平，表明飼喂甲烷氧化菌生產(chǎn)的SCP的水產(chǎn)動物可以在一定程度上控制炎癥和阻止腸炎。

不同的水產(chǎn)動物，對于SCP 的適應(yīng)能力是有限的，在不影響魚的生長性能和健康的前提下，可以確定添加多少SCP 替代魚粉蛋白。徐冰英等[66]用莢膜甲基球菌蛋白替代24.80%的魚粉蛋白，對黑鯛的生長無不良影響，而替代8.27%的，可提高黑鯛的生長性能和飼料利用率。Biswas 等[72]在不影響黃尾魚的生長性能和飼料利用率的前提下，添加莢膜甲基球菌蛋白來替代30%以上的魚粉蛋白。鄭繼昌等[73]驗(yàn)證了用SCP替代30%魚粉蛋白，不會對大菱鲆幼魚的生長性能和健康產(chǎn)生不良影響。

4 展望

甲烷氧化菌生產(chǎn)的SCP 作為水產(chǎn)飼料的應(yīng)用前景廣闊，有力推動水產(chǎn)養(yǎng)殖可持續(xù)發(fā)展。主要優(yōu)點(diǎn)之一是甲烷氧化菌生產(chǎn)的SCP 蛋白含量高，且與魚粉的必需氨基酸組成及含量相近，使其成為魚粉的替代品；優(yōu)點(diǎn)之二是甲烷氧化菌把甲烷作為唯一能量和碳源，不像其他微生物生產(chǎn)的SCP 易染沙門氏菌等其他致病菌，更加安全。然而目前甲烷氧化菌在生產(chǎn)及應(yīng)用SCP 時也存在一些問題，生產(chǎn)時如何最大限度提高氣液傳質(zhì)的效率，這是甲烷生物轉(zhuǎn)化的最主要的挑戰(zhàn)；在應(yīng)用時，需要考慮不同水產(chǎn)物種對于單細(xì)胞蛋白的適應(yīng)性，不建議以甲烷氧化菌生產(chǎn)的SCP 作為單一蛋白來源，因其高濃度的蛋白含量可能會降低水產(chǎn)動物的飼料利用率，從而對生長性能造成影響，因此，仍需從營養(yǎng)調(diào)控和遺傳育種等多方面開展研究以消除高水平添加單細(xì)胞蛋白的不利影響。

目前國內(nèi)對于甲烷氧化菌生產(chǎn)的單細(xì)胞蛋白飼料的應(yīng)用還較少，一些商業(yè)化的產(chǎn)品也被應(yīng)用在動物中，相信不久的將來應(yīng)該就能看到甲烷氧化菌產(chǎn)的SCP出現(xiàn)在我國水產(chǎn)飼料行業(yè)。