■ 周雷進(jìn)雨 馬精陽 袁月明 李錦生 馮偉志 周麗娜

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)工程技術(shù)學(xué)院，吉林長春 130118）

干酪乳桿菌作為一種重要的乳酸菌，已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療、微生物制劑和畜牧業(yè)等領(lǐng)域[1-2]。真空冷凍干燥是目前制備高品質(zhì)乳酸菌制劑的重要方法之一，與傳統(tǒng)干燥技術(shù)相比，具有便于運(yùn)輸、貯藏期長等特點(diǎn)[3]。但在凍干過程中，由于多種因素的變化，會導(dǎo)致細(xì)胞活力下降，甚至?xí)斐删w的死亡[4]。在凍干前添加保護(hù)劑，可以減少凍干過程中所帶來的損害，使其盡可能保持原有的理化性質(zhì)和生物活性[5-9]。

干酪乳桿菌能夠促進(jìn)免疫反應(yīng)，有利于宿主健康，研究表明，將干酪乳桿菌應(yīng)用到養(yǎng)殖業(yè)中，能夠有效地改善動物的健康以及生長性能，這對綠色生態(tài)養(yǎng)殖具有重要的意義[10-11]。復(fù)合凍干保護(hù)劑能夠有效地提高菌種在運(yùn)輸過程中的存活率，因此，在實(shí)際生產(chǎn)中具有較好的應(yīng)用前景。

為了提高凍干后菌種的存活率，本研究通過采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出各種類別凍干保護(hù)劑中對菌種存活率有顯著影響的材料，進(jìn)一步通過響應(yīng)面法對篩選出的保護(hù)劑材料進(jìn)行復(fù)配優(yōu)化，并以菌株的存活率為響應(yīng)指標(biāo)，探究一種干酪乳桿菌復(fù)合凍干保護(hù)劑的制備工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）粉劑由中國科學(xué)院微生物研究所提供，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室分離保藏。

1.1.2 試劑

山梨醇、甘露醇、甘油、硫代硫酸鈉，購自浙江一諾生物科技有限公司；蔗糖、明膠、磷酸鈉、谷氨酸，購自遼寧眾發(fā)生物科技有限公司；海藻糖、乳糖，購自山東優(yōu)索化工科技有限公司；維生素E，購自安徽酷爾生物工程有限公司；蛋白胨，購自上海博微生物科技有限公司；山梨醇、甘露醇、甘油、硫代硫酸鈉、蔗糖、明膠、磷酸鈉、谷氨酸、海藻糖、乳糖、維生素E、蛋白胨均為分析純，凈含量均為500 g。

1.1.3 儀器設(shè)備

GR85DR 型高壓蒸汽滅菌鍋（北京盛科信德科技有限公司）；超凈工作臺（冠森生物科技有限公司）；Centrifuge5702 型離心機(jī)（上海普瑾醫(yī)療科技有限公司）；CryoCubeF570型超低溫冰箱（購自上海蓓米爾生物科技有限公司）；電子天平（上海長耀儀器有限公司）；低溫保存箱（購自青島海爾集團(tuán)）；LRH-150型恒溫生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

活菌計(jì)數(shù)→離心5 min（3 000 r/min）→與凍干保護(hù)劑混合（單一、復(fù)合）→分裝→預(yù)冷凍24 h→超低溫冷凍1 h→冷凍干燥24 h→復(fù)水→活菌計(jì)數(shù)→菌種保護(hù)率[12]。

1.2.2 菌種活化

無菌條件下，取出菌種凍干粉，室溫解凍5 min后，按照2%的接種量接種到MRS 液體培養(yǎng)基中，并將其搖勻。在37 ℃恒溫條件下經(jīng)過48 h 培養(yǎng)后得到一代菌，再經(jīng)過48 h 培養(yǎng)后，得到二代菌，用于試驗(yàn)[13-14]。

1.2.3 預(yù)冷及凍干

將所制備的樣品進(jìn)行預(yù)冷凍24 h，預(yù)冷凍環(huán)境為-20 ℃[15]，預(yù)冷凍完成后放入-80 ℃環(huán)境中冷凍1 h[16]，最后進(jìn)行冷凍干燥操作，冷凍干燥環(huán)境條件為真空度3.08 Pa，溫度-85 ℃，冷凍干燥時間為24 h[17-18]。

1.2.4 單一種類保護(hù)劑材料的制備和選擇

采用單因素試驗(yàn)考察不同類型保護(hù)劑對凍干后干酪乳桿菌菌種存活率的影響，控制預(yù)冷和凍干的試驗(yàn)條件不變，以冷凍后菌種存活率為指標(biāo)，對冷凍保護(hù)劑、抗氧化劑、酸堿調(diào)整劑和填充劑進(jìn)行篩選，篩選出各類保護(hù)劑中凍干后菌種存活率最高的材料。將冷凍保護(hù)劑（蔗糖、海藻糖、甘油）、抗氧化劑（硫代硫酸鈉、維生素E、蛋白胨）、酸堿調(diào)整劑（磷酸、氨基酸、山梨醇）、填充劑（甘露醇、乳糖、明膠）中的每種材料分別同純化水混合成單一成分保護(hù)劑，其中冷凍保護(hù)劑和填充劑以10%的濃度進(jìn)行混合[19]，抗氧化劑和酸堿調(diào)整劑以1%的濃度進(jìn)行混合[20]，混合完成后與菌體完全接觸并搖勻，進(jìn)行預(yù)冷凍和冷凍干燥。每組材料進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，最后取平均值。

1.2.5 復(fù)合保護(hù)劑的響應(yīng)面法優(yōu)化

如表1 所示，以單因素試驗(yàn)篩選出來的海藻糖、硫代硫酸鈉、甘露醇、山梨醇為原料，以冷凍后菌種的存活率為指標(biāo)，使用三水平四因素的響應(yīng)面試驗(yàn)來進(jìn)行復(fù)配優(yōu)化，以此來確定復(fù)合保護(hù)劑的最佳配比。

表1 復(fù)合凍干保護(hù)劑各因素的水平選擇

1.2.6 活菌計(jì)數(shù)

在無菌條件下，將0.1 g 凍干粉溶于0.9 mL 的無菌水中，充分混合后備用，用無菌水將所得的菌懸液進(jìn)行梯度稀釋，將菌液用涂布棒均勻涂布到固體培養(yǎng)基上，在37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)48 h 后，取出并計(jì)數(shù)[21]。冷凍前的菌種數(shù)量為 5.1×109CFU/mL。

1.2.7 菌種存活率

式中：m——冷凍干燥后測得的活菌數(shù)量（CFU/mL）；

m0——冷凍干燥前測得的活菌數(shù)量（CFU/mL）。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2010 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用Design-Expert 13.0 軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并分析試驗(yàn)結(jié)果，P＜0.01 表示差異極顯著，P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一保護(hù)劑的確定

為了提高菌種在凍干過程中的存活率，以A（海藻糖）、B（甘油）、C（蔗糖）這3種材料為冷凍保護(hù)劑的試劑分別進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖1所示，海藻糖對菌種的保護(hù)效果最優(yōu)，顯著高于甘油和蔗糖（P＜0.05），蔗糖對菌種的保護(hù)效果最差，測得海藻糖組的菌種存活率為70.6%，甘油組和蔗糖組的菌種存活率分別為54.9%和39.2%。因此，選擇海藻糖作為冷凍保護(hù)劑材料。

圖1 冷凍保護(hù)劑對菌種存活率的影響

為了提高菌種在凍干過程中的存活率，以A（硫代硫酸鈉）、B（蛋白胨）、C（維生素E）這3 種材料為抗氧化劑的試劑分別進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖2 所示，硫代硫酸鈉對菌種的保護(hù)效果最好，顯著優(yōu)于維生素E 和蛋白胨（P＜0.05），維生素E 對菌種的保護(hù)效果最差，測得硫代硫酸鈉組的菌種存活率為52.9%，蛋白胨組和維生素E 組的菌種存活率分別為31.3%和25.5%。因此，選擇硫代硫酸鈉作為抗氧化劑材料。

圖2 抗氧化劑對菌種存活率的影響

為了提高菌種在凍干過程中的存活率，以A（甘露醇）、B（明膠）、C（乳糖）這3種材料為填充劑的試劑分別進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖3 所示，甘露醇對菌種的保護(hù)效果最佳，顯著高于乳糖和明膠（P＜0.05），乳糖對菌種的保護(hù)效果最差，測得甘露醇組的菌種存活率為45.1%，明膠組和乳糖組的菌種存活率分別為29.4%和11.8%。因此，選擇甘露醇作為填充劑材料。

圖3 填充劑對菌種存活率的影響

為了提高菌種在凍干過程中的存活率，以A（山梨醇）、B（磷酸）、C（谷氨酸）這3種材料為酸堿調(diào)整劑的試劑分別進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖4 所示，山梨醇對菌種的保護(hù)效果最優(yōu)，顯著高于磷酸和谷氨酸（P＜0.05），谷氨酸對菌種的保護(hù)效果最差，測得山梨醇組的菌種存活率為58.8%，磷酸組和谷氨酸組的菌種存活率分別為37.2%和9.8%。因此，選擇山梨醇為酸堿調(diào)整劑材料。

圖4 酸堿調(diào)整劑對菌種存活率的影響

如表3 所示，本研究構(gòu)建的回歸模型極顯著（P＜0.01），說明模型的可靠度較高，可以利用該模型指導(dǎo)干酪乳桿菌復(fù)合凍干保護(hù)劑工藝優(yōu)化。通過方差分析可以得出，4 個因素對冷凍后的活菌數(shù)的影響主次順序?yàn)椋篈＞D＞B＞C；即海藻糖＞山梨醇＞硫代硫酸鈉＞甘露醇。通過比較P值，可以得出B、C、AB、AC、AD、BC、BD、CD、D2對冷凍后活菌數(shù)影響不顯著（P＞0.05），同時也說明4個因素之間沒有交互作用；A對冷凍后的活菌數(shù)影響極顯著（P＜0.01）。說明在冷凍干燥過程中，冷凍保護(hù)劑對菌種提供的保護(hù)效果最明顯。

2.2 復(fù)合保護(hù)劑的確定

為了進(jìn)一步探究復(fù)合凍干保護(hù)劑對干酪乳桿菌菌種存活率的影響，以單因素試驗(yàn)篩選出的海藻糖、硫代硫酸鈉、甘露醇、山梨醇為供試材料，利用Box-Behnken 模塊進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，探究不同濃度的復(fù)合保護(hù)劑對菌種存活率的影響，結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果

軟件Design-Expert 13.0所得的擬合回歸方程：

Y=42-6.58×A-1.58×B+1.17×C+5.33×D+0.5×AB-1.5×AC+0.75×AD-2.25×BC+4×BD+0.25×CD-15.5×A2-6.75×B2-6.62×C2+0.625×D2

擬合回歸方程的方差分析見表3。

表3 擬合回歸方程的方差分析

2.3 各因素交互作用的分析

通常情況下，響應(yīng)面的等高線越接近于橢圓，則說明各因素間的交互作用越明顯；且當(dāng)響應(yīng)曲面越陡時，也能說明各因素間的交互作用越強(qiáng)。

由圖5 可知，各因素交互作用的等高線沒有表現(xiàn)為明顯的橢圓形，同時響應(yīng)曲面也呈現(xiàn)為相對平緩，說明各因素間的交互作用并不顯著，同上述的回歸分析結(jié)果相一致。

圖5 各因素交互作用的等高線和響應(yīng)面

2.4 復(fù)合保護(hù)劑最佳配比的效果驗(yàn)證

根據(jù)上述模型可以得出復(fù)合凍干保護(hù)劑的最佳配比為海藻糖15%、甘露醇15%、山梨醇3%、硫代硫酸鈉2%，以菌種存活率為指標(biāo)，利用該配比與5.1×109CFU/mL 濃度的菌種進(jìn)行混合試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表4 復(fù)合保護(hù)劑最佳配比的結(jié)果驗(yàn)證

由表4 可知，利用該配比制作的復(fù)合保護(hù)劑進(jìn)行試驗(yàn)，經(jīng)過576 h 的冷凍后，測得的菌種存活率為90%，在冷凍時間為576～672 h，菌種的存活率有所下降，降低了2%，冷凍672 h 后測得的菌種存活率為88%，說明該復(fù)合凍干保護(hù)劑能夠達(dá)到比較理想的保護(hù)效果。

3 討論

冷凍干燥是制備乳酸菌制劑的重要環(huán)節(jié)，在凍干前添加保護(hù)劑能夠有效保持菌種在凍干過程中的穩(wěn)定性，提高菌種存活率。不同保護(hù)劑的保護(hù)機(jī)制不同，單一保護(hù)劑一般不能達(dá)到良好效果。本研究在進(jìn)行復(fù)合凍干保護(hù)劑復(fù)配優(yōu)化時，考慮到干酪乳桿菌在冷凍干燥過程可能受到多種因素影響，因此選擇冷凍保護(hù)劑、抗氧化劑、酸堿調(diào)整劑和填充劑進(jìn)行加強(qiáng)或協(xié)同作用。復(fù)合凍干保護(hù)劑對菌種具有良好的保護(hù)效果，能夠有效的降低干酪乳桿菌在凍干過程中由工藝造成的失活或死亡，從而提高菌種的存活率，且保護(hù)效果作用時間較長，能夠有效解決實(shí)際生產(chǎn)中長期儲存困難的問題。

本研究所選擇的各類試劑對凍干后干酪乳桿菌均具有一定的保護(hù)效果，在冷凍保護(hù)劑中海藻糖對菌種的保護(hù)作用最佳，且在復(fù)配優(yōu)化試驗(yàn)中，海藻糖對凍干后的菌種存活率影響最顯著。海藻糖屬于非還原性糖，具有特殊的雙糖分子結(jié)構(gòu)，當(dāng)細(xì)胞處于冷凍干燥條件時，其能夠在細(xì)胞表面形成保護(hù)膜，可以較好地維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，從而能夠減少菌種細(xì)胞的死亡，提高菌種的存活率[22-24]。在抗氧化劑中硫代硫酸鈉對菌種的保護(hù)作用最佳，硫代硫酸鈉的抗氧化效果是通過自身氧化來提供的，當(dāng)試管環(huán)境中的氧和凍干品內(nèi)部的氧被消耗掉后，凍干品所接觸到的氧含量也會降低，使得氧化反應(yīng)也會減少，從而達(dá)到抗氧化效果[25]。在填充劑中甘露醇對菌種的保護(hù)作用最佳，甘露醇具有難被空氣氧化、易溶于水的特性，在冷凍干燥過程中，甘露醇在慢速凍結(jié)時會結(jié)晶，從而為活性組分提供支撐結(jié)構(gòu)，不僅能夠保護(hù)細(xì)胞，還不會與活性組分發(fā)生反應(yīng)，從而能夠提高菌種的存活率[26-27]。在酸堿調(diào)整劑中山梨醇對菌種的保護(hù)作用最佳，山梨醇是多元醇類，其不僅能夠調(diào)節(jié)酸堿度，還能夠?yàn)榛钚越M分提供支撐結(jié)構(gòu)，對菌體起到了雙重保護(hù)的作用[28]。

利用制備的復(fù)合凍干保護(hù)劑對干酪乳桿菌進(jìn)行凍干后的菌種存活率達(dá)到了90%，與單一類別保護(hù)劑作用效果相比較，復(fù)合凍干保護(hù)劑的保護(hù)效果均優(yōu)于各類單一類別保護(hù)劑。說明復(fù)合凍干保護(hù)劑能夠有效降低細(xì)胞流動性，維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和保護(hù)細(xì)胞內(nèi)代謝酶活性等[29-31]。通過驗(yàn)證試驗(yàn)可以得出經(jīng)過672 h 冷凍干燥后，菌種存活率為88%，說明該配比的復(fù)合凍干保護(hù)劑對干酪乳桿菌具有良好的長期保護(hù)效果。

4 結(jié)論

本研究通過單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，從12 種材料中篩選出對菌種存活率有顯著影響的海藻糖、硫代硫酸鈉、甘露醇、山梨醇這4 種試劑，這4 種試劑對菌種的保護(hù)效果最明顯。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過復(fù)配優(yōu)化試驗(yàn)對干酪乳桿菌復(fù)合凍干保護(hù)劑的配比進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳配比組合為A2B2C2D3，即海藻糖15%、甘露醇15%、山梨醇 3%、硫代硫酸鈉2%，在該配比下，冷凍后活菌數(shù)量為4.6×109CFU/mL，菌種存活率為90%。經(jīng)過672 h 的混合試驗(yàn)驗(yàn)證，得到的菌種存活率為88%。