余雙英 劉璐 張軍東

（1. 上海昊海生物科技股份有限公司 上海 201613；2. 上海利康瑞生物工程有限公司 上海 201707）

豬源纖維蛋白黏合劑在臨床常用于手術(shù)中輔助止血，該產(chǎn)品生物相容性好、無(wú)毒無(wú)刺激，能有效黏附于創(chuàng)口起到良好的止血和促進(jìn)創(chuàng)口愈合的作用[1-3]。豬源纖維蛋白黏合劑主要是由豬纖維蛋白原、豬凝血酶及相應(yīng)的稀釋劑組成的一種復(fù)合制劑，氨丁三醇作為豬凝血酶稀釋劑的一種重要輔料，根據(jù)相關(guān)要求需控制其含量。因此，建立一種適合本產(chǎn)品中氨丁三醇含量的測(cè)定方法尤為重要。

國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)[標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：WS-10001-(HD-0467)-2002]氨丁三醇注射液[4]和《中華人民共和國(guó)藥典》2020 年版四部藥用輔料氨丁三醇中的含量測(cè)定均采用滴定法：以甲基紅做指示劑，用鹽酸滴定液（0.1 mol/L）滴定。但是在豬凝血酶稀釋劑制備過(guò)程中添加了稀鹽酸調(diào)節(jié)產(chǎn)品的pH，鹽酸會(huì)對(duì)最終滴定結(jié)果有干擾，故排除滴定法。

氨丁三醇屬帶鄰位的多羥基醇，相對(duì)分子質(zhì)量較小，且沒(méi)有紫外吸收，但能夠在強(qiáng)堿條件下與氫氧化銅發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，生成深藍(lán)色的氨丁三醇銅溶液，利用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定絡(luò)合物的吸光度，從而計(jì)算出氨丁三醇的含量。已有文獻(xiàn)[5-6]采用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定不同產(chǎn)品中氨丁三醇的含量，但本品中除氨丁三醇外還有其他一些對(duì)測(cè)定產(chǎn)生干擾的組分，不適合用于本品中氨丁三醇的測(cè)定。因此，本研究針對(duì)公司產(chǎn)品特點(diǎn)，對(duì)測(cè)定方法中采用的波長(zhǎng)、硫酸銅及氫氧化鈉溶液的濃度或用量、離心轉(zhuǎn)速等條件均進(jìn)行了改進(jìn)，最終建立的方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，并經(jīng)過(guò)了方法學(xué)驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

豬凝血酶稀釋劑（公司自產(chǎn)）；氨丁三醇對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；硫酸銅、氫氧化鈉、鹽酸（分析純級(jí)，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；氯化鈣（藥用級(jí)，廣東省臺(tái)山市新寧制藥有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外- 可見(jiàn)分光光度計(jì)（Cary 60，Aglient Technologies）；ME104 和ME1002 分析天平、S220 pH計(jì)[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；H1650 臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）。

1.3 溶液配制

1）氫氧化銅懸濁液 在10 mL 離心管中分別依次加入5%氫氧化鈉溶液3.5 mL 和15%硫酸銅溶液0.3 mL，立即振蕩混勻，即得氫氧化銅懸濁液（需現(xiàn)配現(xiàn)用）。

2）對(duì)照品儲(chǔ)備液（24 mg/mL） 精密稱取對(duì)照品氨丁三醇0.6 g 于25 mL 容量瓶中，加水溶解后，稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。

3）線性溶液 分別精密量取0.25、0.40、0.50、0.60、0.75 mL 對(duì)照品儲(chǔ)備液于10 mL 容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得一系列質(zhì)量濃度分別為0.60、0.96、1.20、1.44、1.80 mg/mL 的線性溶液。

4）供試品儲(chǔ)備液（24 mg/mL） 精密稱取氨丁三醇0.6 g，置于25 mL 容量瓶中，加少量與凝血酶稀釋劑中相同濃度的氯化鈣溶液（45 mmol/L）溶解后，然后用氯化鈣溶液稀釋至刻度，搖勻，作為供試品樣品儲(chǔ)備液。

1.4 檢測(cè)波長(zhǎng)

制備4 組氫氧化銅懸濁液，各組中分別加入3 mL空白溶液（純化水）、3 mL 空白基質(zhì)（不含氨丁三醇的凝血酶稀釋劑）、3 mL 對(duì)照品溶液（1.20 mg/mL）和3 mL 供試品溶液，立即振蕩混勻，于10 000 r/min 離心5 min，取上清液再次于10 000 r/min 離心5 min，然后取上清液于400 ～800 nm 波長(zhǎng)下進(jìn)行全波段掃描，確定檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.5 回歸方程

取5 份氫氧化銅懸濁液，分別加入上述不同質(zhì)量濃度的線性溶液3 mL，立即振蕩混勻，于10 000 r/min 離心5 min，取上清液重復(fù)離心一次，然后取上清液在620 nm 波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，并以純化水為空白對(duì)照。以吸光度對(duì)氨丁三醇濃度作線性回歸，求得回歸方程。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

對(duì)照品和樣品溶液在620 nm 處具有最大吸收，而空白溶液和空白基質(zhì)在該波長(zhǎng)下基本沒(méi)有紫外吸收（圖1），表明此波長(zhǎng)下測(cè)定的專屬性較好，故選擇620 nm 為測(cè)定波長(zhǎng)。

圖1 全波段掃描圖

2.2 線性回歸方程

經(jīng)計(jì)算得線性回歸方程為y=0.100 6x+0.011 9，相關(guān)系數(shù)r=0.998 5，說(shuō)明氨丁三醇對(duì)照品溶液在0.579 3～1.737 9 mg/mL 范圍內(nèi)，氨丁三醇濃度和吸光度線性關(guān)系良好。

2.3 準(zhǔn)確度

分別制備濃度為70%、100%、130%的樣品液各3份進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示其平均回收率分別是100.21%、98.36%、97.59%；9 份樣品液的平均回收率為98.72%（n=9），RSD 為1.46%（n=9）（表1），表明回收率較好。

表1 準(zhǔn)確度測(cè)定

2.4 精密度（重復(fù)性/中間精密度）

兩位研究人員于不同日期各測(cè)定供試品溶液6 份，測(cè)得氨丁三醇含量的平均值分別為1.166 4 mg/mL、1.114 6 mg/mL（n=6）；12 份樣品的平均值為1.140 5 mg/mL（n=12），RSD 為3.59%（n=12），結(jié)果滿足內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)（RSD ≤5.0%）。

2.5 溶液穩(wěn)定性

對(duì)照品和供試品溶液于室溫放置0 或24 h，測(cè)定結(jié)果顯示，兩時(shí)間氨丁三醇含量測(cè)定結(jié)果的比值均滿足內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)（95.0%～105.0%）（表2），表明對(duì)照品和供試品溶液的穩(wěn)定性良好。

表2 溶液穩(wěn)定性

2.6 耐用性

在其他條件不變的情況下，分別調(diào)整離心轉(zhuǎn)速為（10 000±500）r/min、檢測(cè)波長(zhǎng)為（620±2）nm、氫氧化鈉濃度為5%±0.5%，氨丁三醇含量與正常條件下測(cè)得的結(jié)果比值均在95.0%～105.0%（表3），表明該方法耐用性良好。

表3 耐用性試驗(yàn)

2.7 供試品檢測(cè)

取3 批豬凝血酶稀釋劑（ 批號(hào)20201101、20201201、20201203），測(cè)得其氨丁三醇含量分別為1.183 2 mg/mL、1.201 4 mg/mL、1.167 9 mg/mL，說(shuō)明該方法適用于豬凝血酶稀釋劑中氨丁三醇含量測(cè)定。

3 討論

1）離心條件的選擇 在建立方法過(guò)程中比較了離心條件分別為8 000 r/min 離心2 次（5 min/次）、10 000r/min 離心1 次（5 min/次）和10 000 r/min 離心2 次（5 min/次，第一次離心后取上清液再次離心）對(duì)離心效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前兩種離心方式均會(huì)有少量片狀沉淀漂浮在上層清液中，對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生干擾；而第三種離心效果相對(duì)較好，沉淀與上清液能夠完全分離，從而使測(cè)定結(jié)果更加準(zhǔn)確。

2）氫氧化銅懸濁液的制備 本方法根據(jù)產(chǎn)品特點(diǎn)，參考文獻(xiàn)[6]調(diào)整了氫氧化鈉和硫酸銅的用量，由于氫氧化銅懸濁液不穩(wěn)定，需現(xiàn)配現(xiàn)用，且加入供試品溶液后需立即震蕩混勻，否則氫氧化銅易分解產(chǎn)生黑色氧化銅沉淀，干擾測(cè)定結(jié)果。

方法改進(jìn)后，采用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定豬凝血酶稀釋劑中氨丁三醇含量，方法簡(jiǎn)單、專屬性強(qiáng)，且線性、精密度、準(zhǔn)確度較好，樣品中其他成分不干擾測(cè)定結(jié)果，是比較理想、便捷的一種含量測(cè)定方法。