張瑩瑩 劉 斌

安徽醫(yī)科大學(xué)附屬阜陽人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué),安徽省阜陽市 236011

肺部感染是呼吸系統(tǒng)的常見臨床疾病,是死亡的主要原因之一[1]。肺部感染合并呼吸衰竭使患者面臨多病原體復(fù)合感染的風(fēng)險,嚴(yán)重情況下發(fā)展為敗血癥或多器官衰竭,導(dǎo)致28d的死亡率很高,這對患者和醫(yī)院來說是一個負(fù)擔(dān),不僅增加醫(yī)療費用,同時也增加患者住院時間[2-3]。因此控制肺部感染是治療重要部分,但最初不合理治療,使發(fā)病率和死亡率明顯升高[4]。因此,根據(jù)病原體培養(yǎng)結(jié)果快速識別致病微生物并對抗菌藥物進行調(diào)整,對急性和復(fù)雜感染非常重要。

檢測呼吸道病原體的傳統(tǒng)方法包括微生物學(xué)培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)檢查(涂片)、血清學(xué)檢測等,然而,所有這些方法都有其缺點,如靈敏度低、耗時長等[5]。有研究發(fā)現(xiàn),傳統(tǒng)培養(yǎng)中高達(dá)60%未能檢測出明確病原體[6]。隨著技術(shù)發(fā)展,宏基因組二代測序(mNGS)應(yīng)運而生,mNGS是一種檢測樣品中所有核酸的方法,包括對核酸片段進行擴增和精確測序,并與已知的參考片段進行比較、定位和整合,利用計算機算法獲得目標(biāo)核酸的完整序列,可以快速、高效和準(zhǔn)確地直接檢測臨床樣本中的基因組信息,全面鑒定細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲,在診斷效能方面優(yōu)于傳統(tǒng)檢測[7]。目前對于mNGS在肺部感染合并呼吸衰竭方面相關(guān)研究缺乏,而在臨床上病原學(xué)診斷對這類群體具有重要的意義。故本文旨在討論mNGS對于肺部感染并發(fā)呼吸衰竭患者病原學(xué)診斷及臨床治療等價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2022年1月—2023年2月本院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科收治肺部感染合并呼吸衰竭患者89例。這一研究符合本院倫理委員會的要求,患者在接受纖維支氣管鏡檢查前均于檢查同意書上簽字。倫理批件號:醫(yī)倫理審查[2022]14號。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):年齡≥18歲,男女不限;肺部感染、呼吸衰竭的診斷標(biāo)準(zhǔn)遵循《內(nèi)科學(xué)》第9版[8]。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①標(biāo)本不合格者;②妊娠或哺乳期女性;③資料不全者。

1.3 資料收集 收集入選患者的傳統(tǒng)培養(yǎng)及mNGS結(jié)果、抗生素使用情況、生化、C反應(yīng)蛋白等血檢。

1.4 傳統(tǒng)病原體檢測方法 本院行呼吸道病原體核酸檢測(PCR-熒光探針法)、微生物的涂片、培養(yǎng)等,標(biāo)本來源包括痰液、肺泡灌洗液、胸腔積液等。

1.5 mNGS檢測 mNGS 檢驗由天津金匙科技有限公司進行DNA 測序。首先將標(biāo)本進行核酸提取,并對DNA質(zhì)量進行評估,然后將構(gòu)建的文庫在Illumina測序儀器上檢測,最后經(jīng)過低質(zhì)量序列過濾、人源序列去除等生物信息分析之后進行報告解讀。mNGS 標(biāo)本大部分來源于肺泡灌洗液,采樣根據(jù)2017年《肺部感染性疾病支氣管肺泡灌洗病原體檢測中國專家共識》[9],由于小部分患者無法進行支氣管鏡灌洗,進行痰液、胸腔積液、血液取樣。

1.6 病原體判斷 確定病原體[10],可包括以下任何一條:(1)傳統(tǒng)檢測確定的陽性病原體與mNGS確定的陽性病原體一致;(2)傳統(tǒng)檢測或mNGS確定的陽性病原體與患者的臨床癥狀或治療反應(yīng)相同;(3)如果mNGS和傳統(tǒng)檢測檢出不同,需與病原體致病的文獻證據(jù)相一致。

1.7 分組標(biāo)準(zhǔn) 將肺部感染合并呼吸衰竭患者的宏基因檢驗數(shù)據(jù)與傳統(tǒng)檢驗數(shù)據(jù)分為2組,分別為mNGS組與傳統(tǒng)檢測組。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 統(tǒng)計分析采用 SPSS26.0 軟件。正態(tài)分布的計量資料組間比較采用獨立樣本t檢驗或校正后的t檢驗,偏態(tài)分布的計量資料組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗;計數(shù)資料以率(百分比)表示,組間比較采用χ2檢驗、McNemar檢驗或Fisher 精確檢驗。以P<0.05定義差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 mNGS和傳統(tǒng)微生物檢測結(jié)果比較 mNGS檢測的陽性率為93.26%(83/89),高于傳統(tǒng)微生物檢測的69.66%(62/89),差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 mNGS和傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)檢測(真菌+細(xì)菌培養(yǎng))結(jié)果比較 在89例感染性患者中,均執(zhí)行病原體培養(yǎng)檢測及mNGS檢測的共計81例,其中57例為傳統(tǒng)病原學(xué)培養(yǎng)陽性(70.37%),行mNGS陽性77例(95.06%),兩者的差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.3 mNGS和病原體核酸PCR檢測結(jié)果比較 89例病例中有64例同時行病原體PCR檢測及mNGS,其中PCR檢測陽性31例(48.44%),mNGS陽性58例(90.63%),經(jīng)檢驗兩者差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 mNGS與傳統(tǒng)方法效能比較 入組的89例患者,根據(jù)病原學(xué)檢測及臨床綜合分析來分組,確定病原體組有80例,非確定病原體組有9例,見表1。mNGS與傳統(tǒng)病原學(xué)檢測靈敏度分別為98.75%(95%CI 92.27～99.93)、57.50%(95%CI 45.95～68.32),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),特異度分別為55.56%(95%CI 22.65～84.66)、77.78%(95%CI 40.19～96.05),無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。mNGS與傳統(tǒng)病原學(xué)檢測的陽性預(yù)測值(PPV)分別為95.18%(95%CI 87.45～98.44)、95.83%(95%CI 84.57～99.28),陰性預(yù)測值(NPV)83.33%(95%CI 36.48～99.12)、17.07%(95%CI 7.70～32.65)。

表1 mNGS與傳統(tǒng)檢測結(jié)果分布

2.5 發(fā)展為重癥肺炎患者感染情況 納入研究的89例患者中,有80例確定病原學(xué),其中發(fā)展為重癥肺炎的患者38例,未發(fā)展重癥肺炎的患者42例。重癥組患者病情更為嚴(yán)重,住院時長較久,具有較高的中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞比率,較低的淋巴細(xì)胞計數(shù)、血小板,較高水平的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮、肌酐,監(jiān)護室住院時長較久,均較非重癥組有顯著性差異(P<0.05)。兩組感染類型中可見,發(fā)展為重癥肺炎患者單純感染、混合感染、細(xì)菌病毒真菌混合感染較未發(fā)展為重癥肺炎患者有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),感染類型分布見表2。

表2 重癥組與非重癥組感染類型分布[n(%)]

2.6 疾病轉(zhuǎn)歸情況 根據(jù)患者病原學(xué)檢出情況、臨床癥狀、輔助檢查進行分析,判斷病原微生物,并依此調(diào)整抗生素治療。80例患者確定病原體,44例調(diào)整了抗生素應(yīng)用,其中重癥組24例,非重癥組20例。兩組的好轉(zhuǎn)率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),但病死率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

表3 兩組患者疾病轉(zhuǎn)歸情況[n(%)]

3 討論

肺部感染導(dǎo)致肺組織病變,肺部炎性滲出增多,引起通氣功能障礙,此外,肺實質(zhì)破壞導(dǎo)致氣體彌散功能下降,最終引起呼吸衰竭,嚴(yán)重者各臟器功能損傷,甚至死亡。因此,對于肺部感染合并呼吸衰竭的患者,除給予呼吸支持外,盡早明確病原菌感染情況并采取針對性的抗感染治療措施非常關(guān)鍵。事實證明,二代測序在診斷感染方面有很大的臨床價值,并在一些指南和共識文件中被推薦[11-13]。本研究探討mNGS 在肺部感染合并呼吸衰竭患者中的病原學(xué)診斷及對臨床診療策略影響等方面的應(yīng)用價值。此研究收集了在我院呼吸科住院并行mNGS檢查的89例肺部感染合并呼吸衰竭患者,系統(tǒng)地比較了mNGS和傳統(tǒng)病原學(xué)檢測的檢驗結(jié)果。

本研究mNGS與傳統(tǒng)檢測方法進行了對比,結(jié)果顯示mNGS檢測的陽性率高于傳統(tǒng)微生物檢測,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。mNGS與傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)檢測、病原體核酸PCR檢測結(jié)果比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。綜上,從傳統(tǒng)微生物檢測、傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)檢測、病原體PCR檢測比較,mNGS診斷優(yōu)于以上檢測項目。Wang J等[14]研究結(jié)果顯示,mNGS在肺部混合感染中檢出率高于傳統(tǒng)方法,本研究結(jié)果與其一致。對于肺部感染合并低氧性呼吸衰竭需要早期精準(zhǔn)抗感染治療,因此mNGS檢測非常重要,特別對于常規(guī)檢測陽性率不高的病原體,如隱球菌、肺孢子菌等。對于一些復(fù)雜感染需要更大范圍的病原篩查,而mNGS對此有一定指導(dǎo)作用。

Ying Li等[15]研究顯示,在細(xì)菌診斷方面,mNGS對比培養(yǎng)法靈敏度及特異度分別為88.89%及74.07%,mNGS對比涂片法的靈敏度及特異度是100%及77.78%。Duan H等[16]研究發(fā)現(xiàn),mNGS的靈敏度高于傳統(tǒng)檢測(67.4%VS 23.6%,P<0.05),而在特異度方面未見統(tǒng)計學(xué)差異(68.8%VS 81.3%,P>0.05)。本研究與上述研究結(jié)果相符合,mNGS靈敏度較傳統(tǒng)病原學(xué)檢測高,且具有統(tǒng)計學(xué)差異,而在特異度方面無統(tǒng)計學(xué)差異,這可能與入院前已使用抗生素等因素,一些病原體培養(yǎng)難度大有關(guān)[17]。在一些體液樣本中,游離DNA很少,由于mNGS靈敏度較高,即使在微量核酸下mNGS也能獲得大量數(shù)據(jù),檢出覆蓋面廣的微生物,為臨床病原菌參考提供了有力證據(jù)。但是其特異度低,在報告中可能看到不致病病原體、不相關(guān)病原體,這些也與標(biāo)本污染等原因有關(guān),且不易鑒別,這需要質(zhì)控對比后進行排除。因此,為明確診斷,還需聯(lián)合傳統(tǒng)檢測技術(shù),以協(xié)助對疾病致病菌的判斷。

有研究表明在社區(qū)獲得性肺炎患者中,混合性感染類型多見的是兩種細(xì)菌感染或一種細(xì)菌感染與一種非典型病原體感染[18-19],重癥肺炎中呼吸道病毒感染較常見,混合病毒—細(xì)菌感染增加死亡風(fēng)險[20]。本研究數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),在發(fā)展重癥肺炎與未發(fā)展重癥肺炎患者相比,單純感染、混合性感染有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.015、0.007),在混合性感染中感染類型為細(xì)菌、真菌、病毒的混合感染有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.028),表明混合感染較單一感染嚴(yán)重程度高,發(fā)展為重癥肺炎可能性大,在10例細(xì)菌病毒真菌混合感染患者中,病死率為60%(6/10),提醒臨床醫(yī)生在重視此類感染的患者,在明確相關(guān)病原體后盡量早期合理應(yīng)用抗生素,降低患者的死亡率。在一些基礎(chǔ)疾病多,起病急,病情重,經(jīng)驗性抗感染治療效果不佳,提示可能為少見病原學(xué)感染,應(yīng)用mNGS檢測快速篩查病原體,可早期靶向治療干預(yù),使患者得到積極有效治療,阻止病情惡化。

本研究調(diào)整抗生素的患者有44例,重癥組24例,非重癥組20例。該兩組的好轉(zhuǎn)率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而病死率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),考慮重癥組部分患者病情惡化,家屬要求自動出院,未予以納入死亡例數(shù)的計算中有關(guān)。

mNGS應(yīng)用廣泛,但有一定局限,其本身測序讀長的上限,影響一些遺傳信息解析,且結(jié)果缺乏一致的判定標(biāo)準(zhǔn)。本研究也存在不足:(1)本文樣本量較少,引起實驗結(jié)果的偏差,結(jié)果需通過增加樣本量進一步驗證。(2)本研究中進行的mNGS檢測均為DNA檢測,未進行RNA檢測,可能存在病原學(xué)結(jié)果與實際不符的情況。(3)樣本送至外地實驗室,這增加了樣品污染和樣品核酸降解風(fēng)險。

mNGS給臨床提供了大量病原體信息,在報告中有些病原學(xué)測序濃度低或序列數(shù)不高,難以作為金標(biāo)準(zhǔn),也只是有提示意義。對于傳統(tǒng)方法難以檢測的微生物如厚壁結(jié)核菌、孢子菌等,mNGS陽性結(jié)果有較大意義。當(dāng)然,臨床醫(yī)師不能單純依靠檢測手段來確定病原菌,應(yīng)注重結(jié)合流行病學(xué)、不同類型患者等情況來進行綜合評估,比如呼吸機相關(guān)性肺炎其常見病原菌類型與醫(yī)院獲得性肺炎相似,但病原譜分布有一定差別,且耐藥率也不同,這些情況都需要醫(yī)師考慮到。

綜上,mNGS較傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測病原菌陽性率更高,整體優(yōu)于傳統(tǒng)檢測,根據(jù)mNGS檢測病原體結(jié)果指導(dǎo)抗感染方案可以提高治療效果,對指導(dǎo)臨床具有重要價值。雖然mNGS價格昂貴,在臨床應(yīng)用中仍有一定的局限性,但在嚴(yán)重感染,疑難病例中,可將mNGS作為傳統(tǒng)方法的補充,以促進精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的開展。