劉寶玲,陳天寶,柳旭輝,王 剛,王曉虎,蔡汝健*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所,廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測實驗站,廣東廣州 510640;2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動物科技學(xué)院,廣東廣州 510225;3.云浮力智農(nóng)業(yè)有限公司,廣東云浮 527500)

在自然界中,細(xì)菌多以生物膜的形式存在,細(xì)菌黏附、聚集于接觸的生物或非生物表面,形成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的生物膜,以此保護(hù)細(xì)菌免受抗生素或其他不利因素的侵害并促進(jìn)耐藥菌株的產(chǎn)生,使細(xì)菌更難被根除。細(xì)菌生物膜是一種重要的毒力因子,在逃避宿主免疫系統(tǒng)、定植和感染中起著至關(guān)重要的作用,Bhattacharya M等[1]研究發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌生物膜能釋放白細(xì)胞介素形成細(xì)胞外陷阱并逃避中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷。生物膜的形成在臨床上是個極大的困擾,因為細(xì)菌生物膜容易在醫(yī)療器械或植入物上附著,引起患者的反復(fù)感染或是影響金屬植入物表面的電化學(xué)阻抗而導(dǎo)致植入物腐蝕[2]。美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)揭示,在所有微生物和慢性感染中,分別有65%和80%與生物膜形成有關(guān)[3]。

抗菌藥物是抑制和去除細(xì)菌生物膜的有效藥物,但由于生物膜對細(xì)菌的自我保護(hù)以及細(xì)菌對抗生素的耐藥性,生物膜相關(guān)感染難以通過抗生素的治療和免疫功能清除[4],大多數(shù)抗菌藥物對細(xì)菌生物膜的抑制或消除效果不佳,并且容易加劇細(xì)菌的耐藥。為了防止生物膜的形成或破壞病原菌的已形成的生物膜,抗菌藥物潛在替代物新型抗生物膜藥物的相關(guān)研究是當(dāng)前的一個研究熱點,其中主要包括納米銀、天然提取物、噬菌體、抗菌肽等,他們具有不同程度的抗生物膜效果,論文綜述討論了生物形成的相關(guān)影響因素以及抑制或消除細(xì)菌生物膜的新型藥物的相關(guān)研究進(jìn)展。

1 生物膜

1.1 生物膜形成的影響因素

微生物以不同或相同物種的聯(lián)合體形式存在而形成生物膜,生物膜的形成是一個多步驟的復(fù)雜過程,包括細(xì)菌從自由的浮游狀態(tài)向生物膜的固著形式的轉(zhuǎn)變,細(xì)菌生物膜形成能力在一定程度上是菌株依賴性的,并受環(huán)境條件的影響。溫度、pH、營養(yǎng)、黏附環(huán)境、群體感應(yīng)對生物膜形成至關(guān)重要。

溫度是決定細(xì)菌生物膜產(chǎn)量和密度的重要因素,并且影響細(xì)菌生物膜的結(jié)構(gòu)和形狀。Kim S等[5]研究表明溫度對銅綠假單胞菌生物膜的形成影響顯著,在20℃時生物膜總生物量和厚度顯著增加,且不同菌株的情況均有不同。Bisht K等[6]發(fā)現(xiàn)溫度不但影響銅綠假單胞菌生物膜的結(jié)構(gòu),并且影響其基因和蛋白的表達(dá)。

細(xì)菌生存離不開環(huán)境中的營養(yǎng)成分,營養(yǎng)成分和濃度以及特定鹽類的存在會影響生物膜的形成,如鈣、硫酸鎂等[7]。短期的營養(yǎng)缺乏能增強(qiáng)細(xì)菌黏附,研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌在堿性環(huán)境和營養(yǎng)成分有效性降低的環(huán)境中形成生物膜能力增強(qiáng)[8],而長期的營養(yǎng)缺乏阻礙了生物膜的成熟。

黏附是細(xì)菌形成生物膜的重要一環(huán),細(xì)菌所處的表面環(huán)境是細(xì)菌黏附的重要影響因素。研究表明,不同的環(huán)境中細(xì)菌的黏附能力不同,導(dǎo)致形成生物膜的能力也有所不同。細(xì)菌在粗糙的有機(jī)膜表面比光滑的玻璃蓋玻片表面更容易形成生物膜[9]。

生物膜的形成涉及群體行為,并依賴于群體感應(yīng)的復(fù)雜調(diào)節(jié),群體感應(yīng)相當(dāng)于細(xì)菌的信號交流系統(tǒng),細(xì)菌通過群體感應(yīng)發(fā)出相應(yīng)的信號,在細(xì)菌生物膜形成過程中調(diào)節(jié)各類信號分子的合成分泌,調(diào)節(jié)細(xì)菌的黏附、定植,生物膜的成熟、分散等[10]。

1.2 細(xì)菌生物膜的耐藥機(jī)制

形成生物膜是大多數(shù)微生物的重要保護(hù)機(jī)制,并為微生物提供許多優(yōu)勢,如高傳染性、抗菌藥物抗性和強(qiáng)存活性。細(xì)菌抗菌藥物耐藥性和生物被膜形成能力之間呈正相關(guān)性[11],生物膜的頑固性是由復(fù)雜的物理和生物特性決定的,涉及多種遺傳和分子因素以及微生物-宿主細(xì)胞的相互作用,生物膜促進(jìn)細(xì)菌耐藥的具體機(jī)制是復(fù)雜的。首先,生物膜的基質(zhì)較厚,藥物難以滲透,生物膜內(nèi)部營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣量少,細(xì)菌代謝頻率低,對抗菌藥物的消耗少[12];其次,生物膜存在排外機(jī)制,把藥物排出的同時免受外界不利因素的干擾[13];耐藥基因的積累也是生物膜促進(jìn)耐藥的重要原因,并有研究表明生物膜促進(jìn)細(xì)菌耐藥性的水平轉(zhuǎn)移[14],自然形成的生物膜內(nèi)的細(xì)菌類型往往是復(fù)雜的,單一抗菌藥物難以對抗多種細(xì)菌。另外,群體感應(yīng)除了影響生物膜的形成,也是誘導(dǎo)耐藥性的重要原因。

2 抗生物膜藥物

2.1 納米銀

納米銀(AgNPs)是近年來新型的抗菌材料,具有顯著的抗菌作用,具有廣譜、高效的特點,并且具有巨大的抗生物膜潛力。Hetta等[15]研究表明AgNPs抑制多重耐藥的鮑曼不動桿菌生物膜的形成,Zhang Y等[16]研究發(fā)現(xiàn)AgNPs破壞銅綠假單胞菌生物膜,Ali A R等[17]研究發(fā)現(xiàn)AgNPs對金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌具有抗生物膜活性。

AgNPs抗生物膜的機(jī)制主要包括抑制細(xì)菌的黏附和運(yùn)動,刺激強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激反應(yīng),破壞鐵穩(wěn)態(tài),阻斷有氧和無氧呼吸,影響群體感應(yīng)(QS)系統(tǒng),抑制相關(guān)基因的表達(dá)[15,16,18]。雖然AgNPs具有廣譜、高效、不易產(chǎn)生耐藥的優(yōu)點,但它的生物毒性是不容忽視的,并且AgNPs對細(xì)菌的作用不具有特異性,容易影響正常微生物的活性。

2.2 天然提取物

天然提取物是指采用一定的方法從天然產(chǎn)品中提取的相關(guān)化學(xué)成分,來源廣且容易獲得。大量的天然提取物具有抗生物膜的特殊功效,如中藥提取物、植物精油。

2.2.1 中藥及其提取物 中藥及其提取物是重要的藥物來源,近年來,中藥抗生物膜的相關(guān)研究逐漸增多,并且研究表明許多中藥及其提取物在抗生物膜上具有顯著效果,例如,苦參、柴胡、大青葉、白頭翁、板藍(lán)根、蒲公英6味中藥的水提液和醇提液在高濃度下對金黃色葡萄球菌生物膜均有不同程度的抑制作用[19];高濃度五倍子、紅花及黃連水煎液能抑制維氏氣單胞菌生物膜的形成[20],球姜酮能減少鮑曼不動桿菌生物膜的形成并能破壞其已形成的生物膜[21];大麻酚具有抗變形鏈球菌生物膜的作用,有可能成為齲齒預(yù)防治療的潛在藥物[22];大蒜對產(chǎn)生志賀毒素的耐藥性大腸埃希氏菌表現(xiàn)出抗生物膜活性[23];中藥及其提取物抑制細(xì)菌生物膜的可能機(jī)制是通過影響luxS/AI-2系統(tǒng)的控制[24],干擾群體感應(yīng)系統(tǒng)、細(xì)菌的黏附及蛋白質(zhì)表達(dá)[25]。

2.2.2 植物精油 植物精油(EOs)是從芳香植物中分離出的大量不同種類的萜類化合物和酚類化合物的混合物,在過去幾十年中因其表現(xiàn)出廣泛的生物特性而受到極大關(guān)注,研究表明大量精油是抗生物膜天然藥物的極好候選物,近年來,在眾多的精油種類中,關(guān)于抗生物膜研究報道比較多的精油包括:山蒼子精油[26]、茶樹精油[27]、丁香精油[28]、牛至精油[29]、百里香精油[30]、肉桂精油[31]等,根據(jù)這些研究數(shù)據(jù),精油對細(xì)菌具有顯著的抗生物膜的效果,其中包括了與人類疾病密切相關(guān)的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、耐藥鮑曼不動桿菌等。精油大多以濃度依賴性方式強(qiáng)烈抑制生物膜形成,其主要作用機(jī)制包括:抑制相關(guān)基因的表達(dá)[26],影響生物膜內(nèi)細(xì)菌結(jié)構(gòu)的完整性和代謝活性[32],抑制胞外多糖和胞外蛋白的合成,抑制群體感應(yīng)[33]等。

雖然精油具有顯著的抗生物膜效果,并且來源廣,制備簡單,但由于其自身特性具有穩(wěn)定性低、揮發(fā)性強(qiáng)、氣味濃烈的缺陷,克服這些缺陷是精油進(jìn)入臨床應(yīng)用之前所必須實現(xiàn)的。

2.3 噬菌體

噬菌體是存在于自然界中感染細(xì)菌的病毒,具有物種水平特異性的優(yōu)勢,如果用于治療感染,將有利于保護(hù)正常微生物群體。研究發(fā)現(xiàn)噬菌體能有效抑制或消除細(xì)菌生物膜,能作為有價值的抗生物膜劑,Gong C等[34]研究發(fā)現(xiàn)噬菌體在室溫下能有效地減少沙門氏菌在堅硬表面上附著和形成生物膜,Al-Zubidi M等[35]研究表明SHEF2噬菌體可以在體外根除糞腸球菌形成的生物膜。有研究報道了2種腸球菌噬菌體siphovirus vB-EfaS-Zip和podovirus vB-EfaP-Max能在不同溫度和pH范圍內(nèi)穩(wěn)定、高效地對抗多種生物被膜,短潛伏期并且對上皮細(xì)胞的沒有細(xì)胞毒性,證明了它們在控制慢性傷口中存在的感染性生物被膜方面的治療用途[36]。

如上所述,噬菌體有巨大的抗生物膜潛力,噬菌體的存在能降低生物膜的完整性和黏附性[37],在臨床上有成功緩解難治性生物膜相關(guān)的假體膝關(guān)節(jié)感染的案例的報道[38]。噬菌體抗生物膜的優(yōu)勢包括它們在感染部位繁殖的能力、高特異性、防止副作用以及它們的進(jìn)化能力,并且也不受抗生素耐藥性的影響,但其特異性也是局限性,抗菌譜窄,單一噬菌體在多種微生物混合感染的治療案例中不能覆蓋到每種微生物[39],并且噬菌體本身作為病毒也可能會促發(fā)宿主免疫系統(tǒng)而被消滅。

2.4 抗菌肽

抗菌肽對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都具有抗菌活性,并且不容易引發(fā)耐藥性,大量的研究表明抗菌肽具有顯著的抗生物膜作用,使用抗菌肽作為抗生物膜劑有望成為控制生物膜相關(guān)感染的潛在方式?？咕目梢砸种萍?xì)菌生物膜的形成或破壞已形成的生物膜,如抗菌肽Temprine-La(FS)抑制2型豬鏈球菌生物被膜形成[40]。Park S C等[41]研究發(fā)現(xiàn)合成抗菌肽可以減少銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌預(yù)先形成的生物膜;WLBU2和蜂毒素稀疏地分散生物膜而不破壞細(xì)菌[42]; 研究表明天然存在的人和牛乳鐵素構(gòu)建體的合成二聚肽具有進(jìn)一步開發(fā)為抗生物膜劑的潛力[43]。Chen D等[44]研究發(fā)現(xiàn)形成淀粉樣蛋白的六肽(AFhPs)對革蘭氏陽性菌表現(xiàn)出高效的廣譜抗菌膜活性,可作為潛在的新型抗生物膜劑。

如上所述,抗菌肽作為一種新型抗菌劑,在抗生物膜方面也具有巨大的潛力,主要通過抑制細(xì)菌的黏附[45]、影響相關(guān)基因的表達(dá),阻斷胞外多糖的合成與分泌[40]等方式來抑制生物膜的形成。通過去除碳水化合物、細(xì)胞外DNA和消除細(xì)胞外聚合物質(zhì)[41]等方式破壞以形成的生物膜。

3 小結(jié)

生物膜在體內(nèi)是異質(zhì)的、復(fù)雜的,并且體內(nèi)環(huán)境也較為復(fù)雜,因此藥物在體內(nèi)的作用要難于體外作用。目前抗生物膜藥物的相關(guān)研究眾多,在這篇綜述中只列舉了部分新型抗生物膜藥物的相關(guān)文獻(xiàn),在這些文獻(xiàn)中有許多體外試驗證據(jù)支持納米銀、天然提取物、噬菌體、抗菌肽用于抑制或消除細(xì)菌生物膜的有效性,但很少有臨床試驗來評估其臨床療效,將各類抗生物膜藥物進(jìn)行系統(tǒng)性、比較性研究的文章也少有報道,這些藥物也并沒有真正成為抗生素的替代物,可能原因是它們的藥理作用還沒有研究透徹,其中可能存在未知的風(fēng)險或是副作用,這也是未來的可研究方向。眾所周知的是,生物膜是細(xì)菌的自我保護(hù)機(jī)制,如何去除這層保護(hù),使藥物能夠直接作用于細(xì)菌以發(fā)揮抗菌作用是當(dāng)下研究熱點。另外,其具體作用機(jī)制的研究是使這些潛在抗生素替代物能真正走上臨床的必經(jīng)之路,在未來的研究中可以考慮進(jìn)行系統(tǒng)性的研究,篩選出最優(yōu)抗生物膜藥物進(jìn)行臨床試驗并評估療效。