褚果果 王 婧 鞠文媛 陳陽(yáng)陽(yáng) 李曉慧 張海飛 宋麗娟 黃建軍 王 青 肖保國(guó)馬存根（山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科/細(xì)胞生理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030001）

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種由自身免疫功能紊亂引起多灶性和散在性軸突和神經(jīng)元損傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）疾病，也是導(dǎo)致年輕人殘疾的常見(jiàn)病之一［1］。作為一種慢性炎癥性、脫髓鞘性、神經(jīng)變性疾病，MS的具體病因仍不清楚，但多項(xiàng)研究表明，CNS內(nèi)氧化應(yīng)激可導(dǎo)致神經(jīng)組織多種損傷，如炎癥、髓鞘破壞和軸突變性，是導(dǎo)致MS 發(fā)生、進(jìn)展和臨床癥狀的重要因素。因此，近年來(lái)應(yīng)用多種抗氧化劑改善MS，如輔酶Q10、褪黑素和維生素C等［2］。

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是MS的經(jīng)典動(dòng)物模型。法舒地爾是最早獲批主要用于改善腦血流異常的ROCK抑制劑，但其具有抗氧化作用，可明顯減輕EAE 的臨床癥狀［3-6］。然而，法舒地爾在臨床實(shí)踐中存在安全窗窄、半衰期短等缺點(diǎn)，限制了其治療慢性疾病的長(zhǎng)期應(yīng)用。作為法舒地爾的代謝產(chǎn)物，羥基法舒地爾（Hydroxyfasudil，HF）也被發(fā)現(xiàn)對(duì)ROCK 具有選擇性抑制作用，且其生物學(xué)活性更高，半衰期更長(zhǎng)，然而目前關(guān)于HF 治療EAE 的研究較少［7］。HF 是否可以通過(guò)抑制氧化應(yīng)激發(fā)揮對(duì)EAE小鼠的治療作用值得探討。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)觀察HF 對(duì)EAE 小鼠的治療效果及其對(duì)氧化應(yīng)激的影響，探究可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與動(dòng)物 BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞系由中國(guó)科學(xué)院上海分院細(xì)胞庫(kù)提供；16只8～10 周齡清潔級(jí)健康C57BL/6 小鼠，體質(zhì)量17～22 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。適應(yīng)性飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境：22～25 ℃，自由進(jìn)食和飲水，保持12 h/12 h 明暗交替。飼養(yǎng)1周后開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)已通過(guò)山西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑與儀器 羥基法舒地爾（美國(guó)MedChemExpress 公司）；MOG35-55肽段（中國(guó)西安聯(lián)美生物科技有限公司）；滅活結(jié)核分枝桿菌H37Ra（mycobacterium tuberculosis，TB，美國(guó)BD公司）；百日咳毒素（pertussis toxin，PTX，美國(guó)Enzo Life Sciences公司）；完全弗氏佐劑（complete Freund′s adjuvant，CFA，美國(guó)Sigma 公司）；MTT 細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、牢固藍(lán)（luxol fast blue，LFB）染色液、HE 染色試劑盒、DPPH、ABTS 自由基清除檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；活性氧（reactive oxygen，ROS）、活性氮（reactive nitrogen species，RNS）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）ELISA 試劑盒（中國(guó)泛柯實(shí)業(yè)有限公司）；核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2）抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology 公司）；血紅素加氧酶-1（heme oxygenase 1，HO-1）抗體（中國(guó)愛(ài)必信生物科技有限公司）；anti-β-actin（美國(guó)Bioworld 公司）。冰凍切片機(jī)、顯微鏡（德國(guó)Leica公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥 BV2 細(xì)胞鋪于96 孔板，貼壁后加入不同濃度的HF 孵育24 h。BV2 細(xì)胞隨機(jī)分為正常對(duì)照組、LPS組和LPS+HF 組。HF（15 μg/ml）預(yù)處理2 h 后給予LPS（1 μg/ml）刺激24 h。小鼠根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分為EAE 組和HF 組，分籠飼養(yǎng)，每組8 只。每只小鼠于腰背部分兩點(diǎn)皮下注射CFA 乳化劑，由MOG35-553.2 mg 和TB 64 μg 充分混懸配制，注射劑量為100 μl/只。于免疫后當(dāng)天和48 h 后腹腔注射PTX，劑量為300 ng/只。HF 組小鼠于免疫后第3 天起腹腔注射HF 干預(yù)，劑量為40 mg/（kg·d），EAE組小鼠注射等量生理鹽水。

1.2.2 癥狀評(píng)估 從第0 天起由至少兩名觀察者隔天對(duì)小鼠癥狀進(jìn)行觀察并評(píng)分。5 分法評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)臨床癥狀，不發(fā)病計(jì)0分；尾部柔軟，張力部分喪失計(jì)1分；后肢無(wú)力或共濟(jì)失調(diào)，左右搖晃步態(tài)計(jì)2 分；雙側(cè)后肢完全癱瘓計(jì)3 分；雙后肢及尾部癱瘓伴前肢力弱計(jì)4分；精神萎靡，四肢癱瘓或?yàn)l死狀態(tài)計(jì)5 分。若癥狀介于兩者之間，則記錄中間分?jǐn)?shù)（±0.5分）。

1.2.3 組織制備 每組取4只小鼠，生理鹽水經(jīng)心尖處灌注后，固定，然后迅速剝離脊髓組織，10%、20%、30%蔗糖溶液梯度脫水，將腰膨大段用OCT膠包埋，冰凍切片機(jī)切片，用于染色。每組剩余小鼠剝離的脊髓組織勻漿提取蛋白用于Western blot檢測(cè)。

1.2.4 MTT 檢測(cè)細(xì)胞活力 每孔加入10 μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液加入100 μl DMSO，振蕩10 min后于490 nm處測(cè)量吸光度（OD）值。

1.2.5 DPPH、ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 DPPH 實(shí)驗(yàn) 將空白提取液、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品溶液和不同濃度的HF 溶液各10 μl 加入190 μl DPPH 工作液中，避光室溫靜置30 min，于515 nm 處檢測(cè)OD值。清除率（%）=（A空白-A測(cè)定）/A空白×100%。

1.2.5.2 ABTS實(shí)驗(yàn) 空白組：將24 μl蒸餾水加至180 μl ABTS 混合液中，測(cè)定組和陽(yáng)性對(duì)照組（positive contral，PC）：將陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品溶液和不同濃度的HF 溶液各6 μl 加至180 μl ABTS 混合液和18 μl 蒸餾水中反應(yīng)10 min，于593 nm 處測(cè)定OD 值。清除率（%）=（A空白-A測(cè)定）/A空白×100%。

1.2.6 HE染色 脊髓切片復(fù)溫，蘇木素染色10 min，快速?zèng)_洗2 次，每次2 min，水洗后分化15 s，自來(lái)水沖洗，伊紅染色1.5 min，蒸餾水清洗5 min，快速脫水，透明，封片，觀察。

1.2.7 LFB 染色 脊髓冰凍切片復(fù)溫，60 ℃浸泡于LFB 染液中20 h，95%乙醇浸泡10 min 去除多余染液，分化液分化15 s，70%乙醇分色30 s，至灰白質(zhì)清晰，蒸餾水沖洗，脫水，透明，封片，觀察。

1.2.8 氧化抗氧化指標(biāo)ROS、RNS、MDA、SOD、CAT 和GSH-Px 的檢測(cè) 將BV2 細(xì)胞上清液和小鼠脊髓勻漿于5 000 r/min 離心10 min。取包被好的96 孔板，每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，分別將10 μl 上清液或小鼠脊髓勻漿加入孔中，然后每孔中再加入40 μl樣品稀釋液和100 μl酶標(biāo)二抗溶液，37 ℃靜置1 h，清洗3～5 次后，每孔各加入50 μl A、B 顯色液，避光靜置10 min，每孔加入50 μl 終止液，即刻使用酶標(biāo)儀于450 nm處檢測(cè)各孔OD值。

1.2.9 免疫熒光染色 脊髓切片恢復(fù)至室溫，PBS中浸泡除去OCT 膠，1%BSA 封閉30 min 后，分別加Nrf2（1∶300）和HO-1（1∶200）抗體稀釋液，4 ℃孵育過(guò)夜，洗去一抗，加入二抗稀釋液孵育2 h，洗去抗體，封片，觀察。

1.2.10 Western blot 檢測(cè) 取各組小鼠脊髓蛋白樣品，100 ℃加熱10 min。每條泳道加入30 μg 蛋白，于10%聚丙烯酰胺凝膠上恒壓（120 V）電泳分離蛋白，然后濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜。將膜浸泡于5%脫脂牛奶中1 h，TBST 洗滌3～5 次后，加入Nrf2 一抗（1∶1 000）、HO-1 一抗及內(nèi)參β-actin 一抗（1∶5 000），4 ℃孵育過(guò)夜，次日經(jīng)TBST 充分洗滌后，加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶5 000）室溫靜置2 h，TBST 洗滌3～5 次，每次5 min?；瘜W(xué)發(fā)光法顯影曝光，觀察拍照，以Nrf2、HO-1條帶灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值的比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析采用GraphPad Prism8.0 進(jìn)行，各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)均以表示。多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩組均數(shù)采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

2.1 HF 在體外對(duì)自由基的清除作用 與PC 組［（95.33±2.52）%、（95.00±2.00）%］相比，HF 在體外對(duì)DPPH 和ABTS自由基幾乎沒(méi)有清除作用，且在3.75～60 μg/ml 的濃度范圍內(nèi)自由基清除率無(wú)明顯差異。見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度HF對(duì)自由基的清除作用Fig.1 Scavenging effect of different concentrations of HF on free radicals

2.2 HF 對(duì)BV2 細(xì)胞活力的影響 當(dāng)HF 在低濃度范圍內(nèi)（3.75、7.5、15 μg/ml），細(xì)胞活力與對(duì)照組（0 μg/ml）間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，不同濃度組間細(xì)胞活力差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)HF 濃度達(dá)到較高濃度（30、60 μg/ml）時(shí)，細(xì)胞活力顯著下降（P<0.05）。根據(jù)MTT 結(jié)果，后續(xù)的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)采用對(duì)細(xì)胞活力沒(méi)有影響的15 μg/ml HF。見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度HF對(duì)BV2細(xì)胞活性的影響Fig.2 Effects of different concentrations of HF on viability of BV2 cells

2.3 HF對(duì)BV2細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 與LPS組相比，經(jīng)HF 干預(yù)后BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中氧化產(chǎn)物ROS、RNS 和MDA 產(chǎn)生均減少（P<0.05），抗氧化酶SOD和GSH-Px 含量顯著增加（P<0.05），而CAT 含量在兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 HF對(duì)BV2細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響Fig.3 Effects of HF on oxidative stress in BV2 cells

2.4 HF 抑制EAE 小鼠的臨床癥狀 自免疫后第11 天開(kāi)始，EAE 組小鼠尾部遠(yuǎn)端張力減弱，出現(xiàn)下垂，且隨免疫時(shí)間延長(zhǎng)逐漸加重，平均發(fā)病時(shí)間為免疫后（16.34±4.98）d，臨床評(píng)分的平均最高分值為（3.84±1.09）。HF 組小鼠并未出現(xiàn)任何臨床癥狀，EAE 組小鼠臨床評(píng)分持續(xù)上升。免疫后第16～28天，EAE組小鼠癥狀普遍較為嚴(yán)重，臨床評(píng)分與HF 組相比開(kāi)始出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 EAE組和HF組小鼠臨床評(píng)分變化Fig.4 Differences in clinical scores between EAE group and HF group mice

2.5 HF抑制脊髓炎癥、改善髓鞘脫失 HE染色結(jié)果表明，EAE 組小鼠脊髓白質(zhì)內(nèi)有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，HF 組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少（P<0.05）。根據(jù)LFB 對(duì)髓鞘染色的結(jié)果分析，EAE 組小鼠脊髓白質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量未著色的空泡，說(shuō)明白質(zhì)內(nèi)髓鞘脫失嚴(yán)重，而HF 組脊髓白質(zhì)染色均一致密，未見(jiàn)明顯脫失（P<0.05），與臨床評(píng)分表現(xiàn)一致。見(jiàn)圖5。

圖5 HF 對(duì)EAE 小鼠脊髓內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和髓鞘脫失的影響Fig.5 Effects of HF on infiltration of inflammatory cells and demyelination in spinal cord of EAE mice

2.6 HF 對(duì)EAE 小鼠氧化應(yīng)激的影響 與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，與EAE 組相比，HF 顯著減少脊髓勻漿中氧化產(chǎn)物ROS、RNS 及MDA 含量（P<0.05），提高抗氧化酶SOD、CAT 和GSH-Px 含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖6。

圖6 HF對(duì)EAE小鼠氧化應(yīng)激的影響Fig.6 Effects of HF on oxidative stress in EAE mice

2.7 HF 激活Nrf2/HO-1抗氧化通路 Nrf2/HO-1是體內(nèi)一條重要的抗氧化通路，為驗(yàn)證HF 的抗氧化作用是否與Nrf2/HO-1 通路有關(guān)，采用免疫熒光染色和Western blot 檢測(cè)兩組小鼠脊髓內(nèi)Nrf2 和HO-1的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與EAE 組相比，HF 組小鼠脊髓內(nèi)Nrf2 和HO-1 蛋白表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。提示HF 可能通過(guò)激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路發(fā)揮抗氧化作用。見(jiàn)圖7。

圖7 HF激活了Nrf2/HO-1抗氧化通路Fig.7 HF activated Nrf2/HO-1 antioxidant pathway

3 討論

由于CNS 巨大的耗氧量及少突膠質(zhì)細(xì)胞的高脂質(zhì)含量使其容易受到氧化應(yīng)激的攻擊。在生理?xiàng)l件下，ROS 和RNS 作為信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程的調(diào)節(jié)介質(zhì)發(fā)揮重要作用，而SOD、CAT 和GSH-Px 等酶構(gòu)成了酶抗氧化劑系統(tǒng)，反饋性地抑制氧化產(chǎn)物的過(guò)多產(chǎn)生，維持氧化還原穩(wěn)態(tài)［8-9］。ROS 和RNS 的過(guò)多產(chǎn)生、線粒體功能障礙、抗氧化防御系統(tǒng)功能不佳均在MS 的病理中發(fā)揮關(guān)鍵作用［10］。事實(shí)上，氧化應(yīng)激會(huì)對(duì)所有類(lèi)型的膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷，但由于少突膠質(zhì)細(xì)胞本身缺乏抗氧化防御能力，少突膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元更為敏感，因此氧化應(yīng)激在MS 患者大腦中誘導(dǎo)線粒體損傷和能量障礙，從而導(dǎo)致髓鞘脫失和神經(jīng)變性。神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激密切相關(guān)，而在炎癥環(huán)境下，ROS 和RNS 水平急劇升高，導(dǎo)致細(xì)胞死亡［11］。研究發(fā)現(xiàn)在MS 患者腦內(nèi)活動(dòng)脫髓鞘區(qū)域，大量蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核苷酸受到廣泛的氧化損傷，受損的少突膠質(zhì)細(xì)胞顯示高水平的氧化DNA，而氧化磷脂優(yōu)先在運(yùn)輸紊亂的軸突中積累［12］。有研究表明，ROCK 的激活能夠促進(jìn)自由基過(guò)度產(chǎn)生，提高氧化應(yīng)激水平，其還可由氧化應(yīng)激狀態(tài)引起，加強(qiáng)惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡［13-15］。在對(duì)EAE 小鼠CNS 氧化應(yīng)激與神經(jīng)元損傷之間的時(shí)空相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞是EAE 小鼠CNS內(nèi)氧化損傷的主要來(lái)源之一［16］。因此在本實(shí)驗(yàn)中采用LPS 刺激的BV2 細(xì)胞進(jìn)行ROCK 抑制劑HF在體外抗氧化能力的研究。結(jié)果表明HF 可明顯減少氧化產(chǎn)物ROS、RNS 及MDA 產(chǎn)生，促進(jìn)抗氧化酶SOD、CAT 和GSH-Px 表達(dá)，表現(xiàn)出良好的抗氧化能力，并且該結(jié)果在EAE小鼠中也得到驗(yàn)證。

Nrf2 是一種重要的抗氧化防御的調(diào)節(jié)因子，在受到氧化刺激時(shí)，其可由胞質(zhì)轉(zhuǎn)入核內(nèi)，激活一種被稱(chēng)為抗氧化反應(yīng)元件的基因表達(dá)，通過(guò)調(diào)節(jié)多種抗氧化蛋白、解毒酶和外源性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基礎(chǔ)和誘導(dǎo)表達(dá)，消除過(guò)多的氧化產(chǎn)物，在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用［17］。Nrf2的另一個(gè)重要功能是通過(guò)抑制NF-κB 激活降低炎癥反應(yīng)，從而減少細(xì)胞因子的產(chǎn)生和氧化反應(yīng)［18］。法舒地爾作為ROCK抑制劑可導(dǎo)致APP/PS1 轉(zhuǎn)基因癡呆模型小鼠海馬神經(jīng)元中Nrf2 和抗氧化分子上調(diào)，因此可能是通過(guò)激活Nrf2信號(hào)通路，促進(jìn)大腦抗凋亡能力，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［4］。有研究發(fā)現(xiàn)，法舒地爾靜脈給藥后，可以立刻在血液中檢測(cè)到HF，血漿中HF 的濃度最高值約為母物的80%［19］。因此，HF可能是法舒地爾的重要活性成分。本實(shí)驗(yàn)在明確HF 抗氧化作用的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索了其作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)HF 也可促進(jìn)EAE 小鼠脊髓中Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)。HF對(duì)Nrf2信號(hào)通路的激活表明其有潛力成為治療MS 優(yōu)良的抗氧化劑。

綜上所述，HF 在體外對(duì)DPPH 和ABST 自由基無(wú)直接清除作用，在體內(nèi)則改善EAE 小鼠的臨床癥狀，減輕CNS 炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和髓鞘脫失，表現(xiàn)出良好的治療效果，其機(jī)制可能與激活Nrf2/HO-1 信號(hào)通路，抑制氧化應(yīng)激有關(guān)?；谖墨I(xiàn)報(bào)道的其優(yōu)良的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特征，使HF 在臨床治療上具有良好的應(yīng)用前景。