于楨鈺 張 淼 王 娟 馬素娜 謝世平 許前磊（河南中醫(yī)藥大學(xué)，鄭州 450046）

小G 蛋白屬于G 蛋白大家族，除了參與細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖、細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等外，也與免疫、炎癥、自噬及凋亡等方面密切相關(guān)［1-4］。獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）即艾滋病，是感染人類(lèi)免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）后，CD4 免疫細(xì)胞被攻擊引起一系列免疫缺陷的傳染性疾病［5］。研究發(fā)現(xiàn)，小G 蛋白在艾滋病感染進(jìn)程中扮演重要角色，不論是其進(jìn)入及潛伏的機(jī)制，還是后續(xù)激活發(fā)病分泌等機(jī)制均有重要聯(lián)系，但具體機(jī)制尚不明確［6-8］。肺脾氣虛證是艾滋病感染者的常見(jiàn)證候之一，氣是維持人體細(xì)胞運(yùn)化的關(guān)鍵，小G蛋白作為細(xì)胞骨架的重要組成及其信號(hào)調(diào)節(jié)者，與氣的推動(dòng)、防御及氣化功能十分相似，因此本研究選取了艾滋病肺脾氣虛證外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）進(jìn)行研究［9］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來(lái)源 收集2018 年河南省某地艾滋病肺脾氣虛證患者及同地區(qū)健康對(duì)照者血液樣本各20例，提取PBMC，設(shè)為艾滋病肺脾氣虛證組及健康對(duì)照組，進(jìn)行iTRAQ-MS 檢測(cè)。獲取一般信息，對(duì)艾滋病肺脾氣虛證組及健康對(duì)照組的性別與年齡進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明組間具有可比性（表1）。中醫(yī)證型診斷標(biāo)準(zhǔn)：參考課題組“艾滋病中醫(yī)證候分布規(guī)律及證候標(biāo)準(zhǔn)建立與驗(yàn)證”中“HIV/AIDS 常見(jiàn)證候診斷量表”肺脾氣虛證診斷量表（編號(hào)：90409004）［10］。艾滋病肺脾氣虛證組納入標(biāo)準(zhǔn)：①HIV 抗體陽(yáng)性且中醫(yī)診斷為肺脾氣虛證；②年齡18～60 歲；③自愿簽署知情同意書(shū)者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者并發(fā)嚴(yán)重機(jī)會(huì)性感染者；②神志不清、癡呆、不愿配合及不愿簽署知情同意書(shū)者。健康對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：①同地區(qū)HIV 抗體檢測(cè)陰性者，年齡為18～60 歲；②無(wú)嚴(yán)重臟器疾病或慢性病急性發(fā)作者；③無(wú)神志不清、癡呆、各種精神病者；④自愿簽署知情同意書(shū)者。本研究經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)：2018HL-050-01）。

表1 HIV/AIDS 肺脾氣虛證組（F）與健康對(duì)照組（J）基線資料Tab.1 Baseline data of HIV/AIDS lung spleen qi deficiency syndrome group（F）and healthy control group（J）

1.1.2 主要儀器及試劑 Human 14 多重離心親和去除系統(tǒng)購(gòu)自Agilent；iTRAQ 試劑盒購(gòu)自AB SCIEX公司；C18柱購(gòu)自Sigma。

1.2 方法

1.2.1 PBMC的提取 EDTA 真空采血管采集入組者晨起外周血10 ml，加等體積PBS吹打均勻。將稀釋后的血液緩慢加在Ficoll液面上，2 000 r/min離心20 min，收取白膜層（PBMC），洗滌離心（1 500 r/min 10 min），重復(fù)2 次。棄上清加1 ml 細(xì)胞凍存液，-80 ℃保存。

1.2.2 iTRAQ-MS檢測(cè)

1.2.2.1 樣本采集及混合 艾滋病肺脾氣虛證組的20 例PBMC 標(biāo)本分為4組，記為FP01、FP02、FP03、FP04。健康對(duì)照組的20 例PBMC 標(biāo)本分為4 組，記為JK01、JK02、JK03、JK04。每組5 例，每例取出10 μl樣品置于EP管中渦旋混合。

1.2.2.2 蛋白質(zhì)的提取及定量 在樣本中加入蛋白裂解液混勻，冰浴5 min，加入DTT，冰浴超聲15 min，13 000 g 離心20 min，加入冷丙酮，-20 ℃過(guò)夜，加入TEAB 溶解，56 ℃水浴30 min，靜置30 min，采用Bradford 法測(cè)定蛋白濃度。

1.2.2.3 蛋白質(zhì)酶解及iTRAQ 標(biāo)記 胰蛋白酶消化樣品蛋白質(zhì)，將酶解后的肽段經(jīng)C18 柱脫鹽真空冷燥，加入TEAB 溶解多肽，按照iTRAQ-8 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行標(biāo)記混合。

1.2.2.4 液相色譜-質(zhì)譜分析 2%乙腈/0.1%甲酸溶解多肽樣本后，應(yīng)用質(zhì)譜儀分析樣本，多肽溶液與C18 捕獲柱洗脫（緩沖液梯度90 min，流速300 nL/min），流動(dòng)相A：2%乙腈/0.1%甲酸/98%H2O，流動(dòng)相B：98%乙腈/0.1%甲酸/2%H2O。在離子累積時(shí)間為250 ms 條件下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜圖掃描，離子累積時(shí)間50 ms條件下收集30個(gè)前體離子的二級(jí)質(zhì)譜圖。MS1 光譜于350～1 500 m/z 條件內(nèi)收集，MS2光譜在100～1 500 m/z條件下收集。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料組間對(duì)比采用卡方檢驗(yàn)。按照f(shuō)lod change>1.5 或flod change<0.67 標(biāo)準(zhǔn)篩選，P<0.05 結(jié)果視為差異蛋白，組間對(duì)比采用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性評(píng)估。查庫(kù)鑒定：將差異蛋白在UniProt（https：//beta.uniprot.org）網(wǎng)站中進(jìn)行搜索。

2 結(jié)果

2.1 一般信息 對(duì)艾滋病肺脾氣虛證組（F）及健康對(duì)照組（J）的性別與年齡進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較，P>0.05，表明組間具有可比性（表1）。

2.2 蛋白鑒定結(jié)果 如表2 所示，按照篩選標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示相比于健康對(duì)照組，艾滋病肺脾氣虛證組差異表達(dá)蛋白為222 個(gè)，其中上調(diào)蛋白169 個(gè)，下調(diào)蛋白53 個(gè)。將差異蛋白在UniProt 網(wǎng)站中進(jìn)行搜索，篩出小G 家族相關(guān)蛋白，結(jié)果顯示9 個(gè)顯著上調(diào)的小G 蛋白，分別為：Rho 家族Rac1、Cdc42、RhoA；Rab 家 族Rab7A、Rab8A、Rab13、Rab21、Rab27B；Rap家族Rap2B。

表2 HIV/AIDS 肺脾氣虛證組（F）與健康對(duì)照組（J）差異小G蛋白Tab.2 Difference of small G protein between HIV/AIDS lung slpeen qi deficiency syndrome group（F）and healthy control group（J）

3 討論

小G 蛋白是細(xì)胞活動(dòng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者，作為不活躍的鳥(niǎo)苷二磷酸（GDP）結(jié)合狀態(tài)和活躍的鳥(niǎo)苷三磷酸（GTP）結(jié)合狀態(tài)的分子開(kāi)關(guān)，作用于整個(gè)細(xì)胞，包括細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，調(diào)節(jié)了細(xì)胞的增殖分化、細(xì)胞信號(hào)、囊泡運(yùn)輸、遷移或凋亡等［1，11-12］。小G蛋白家族包括Rho、Rab、Rap 等成員，其中Rho 主要參與細(xì)胞骨架的動(dòng)力與形態(tài)，Rab 主要負(fù)責(zé)膜轉(zhuǎn)運(yùn)及囊泡運(yùn)輸，Rap 參與細(xì)胞的黏附、遷移及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等［11，13］。小G 蛋白作為GDP/GTP 分子開(kāi)關(guān)，通過(guò)招募特定結(jié)合伙伴，如各種激酶、磷酸酶及運(yùn)動(dòng)蛋白影響囊泡的形成和運(yùn)輸，HIV 病毒可利用細(xì)胞運(yùn)輸機(jī)制組裝和釋放新的傳染性顆粒［14］。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用iTRAQ-MS 蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)方法，以艾滋病肺脾氣虛證為研究對(duì)象，篩選出其與健康對(duì)照組PBMC 差異表達(dá)的9個(gè)小G蛋白。

3.1 Rho GTPase 家族 RhoA、Rac1 和Cdc42 在本次實(shí)驗(yàn)中顯著上調(diào)，三者關(guān)系密切，且皆為Rho GTPase 家族成員，在病毒生命周期的不同階段調(diào)節(jié)HIV-1 的復(fù)制，參與病毒的進(jìn)入、轉(zhuǎn)錄和釋放［14］。HIV 可通過(guò)Env 包膜蛋白觸發(fā)RhoA、Rac1 與Cdc42信號(hào)激活；RhoA 和Rac1 通過(guò)提高Env 蛋白與CD4和輔助受體分子（CXCR4/CCR5）的結(jié)合聚集及病毒-細(xì)胞膜融合的效率促進(jìn)HIV-1 病毒的進(jìn)入；CD4和輔助受體分子CCR5 的病毒接合又激活Rac1 和Cdc42，并導(dǎo)致GTPase 信號(hào)級(jí)聯(lián)中蛋白質(zhì)大規(guī)模磷酸化與肌動(dòng)蛋白重塑，可促進(jìn)HIV 病毒融合孔的形成和擴(kuò)大［6，12，15-16］。與Env 蛋白相似，Nef 也 介 導(dǎo)Rac1 活性，Env 與Nef 的介導(dǎo)效應(yīng)與Rac1/Cdc42-Wave2-Arp2/3 肌動(dòng)蛋白聚合途徑有關(guān)［17］。LUCERA等［8］研究表明細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)因子Rho GTPase家族中RhoA、Cdc42 和RhoA 的抑制劑可降低病毒感染，表明Rho 信號(hào)家族的多個(gè)成員是促進(jìn)CD4+T 細(xì)胞最佳HIV-1 感染的宿主依賴(lài)性因素。NIKOLIC 等［16］研究表明HIV-1 激活了Cdc42，促進(jìn)了HIV 病毒在樹(shù)狀突細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞之間形成的感染性突觸間的傳播。總之，Rho 家族中RhoA、Rac1 和Cdc42 與細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)密切相關(guān)，且與HIV 病毒的進(jìn)入、復(fù)制及傳播有關(guān)，而抑制其相關(guān)活性可減少病毒感染。本研究中，Rho 家族中RhoA、Rac1 和Cdc42 蛋白對(duì)比健康組呈現(xiàn)的上調(diào)差異可能與病毒感染相關(guān)，對(duì)此需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

3.2 Rab GTPase 家 族 Rab7A、Rab8A、Rab13、Rab27B、Rab21 等差異蛋白在本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果中上調(diào)，其屬于GTPase 家族中的Rab 家族。Rab GTPase蛋白除了與HIV 病毒感染相關(guān)，也與自噬及細(xì)胞凋亡炎癥關(guān)系密切［2，4，18］。

CAILLET 等［14］證明了Rab7A 是HIV-1繁殖所必需的，Rab7A 調(diào)節(jié)Env 蛋白的加工與HIV-1 的傳染性，Rab7A 耗竭降低了Env 的加工，削弱了病毒的傳染性；Rab7A 敲除細(xì)胞釋放的病毒，傳染性降低，其與限制性因子BST2 的表達(dá)有關(guān)（BST2 可將新形成的病毒顆粒物理束縛在感染細(xì)胞表面，阻止其釋放）。RAB7A 能夠調(diào)節(jié)AKT（蛋白激酶B）和PAK1（P21-activated kinase1）活性，AKT 和PAK 都與細(xì)胞凋亡通路有關(guān)；而RAB7A 的過(guò)度表達(dá)也導(dǎo)致NF-κB表達(dá)增加［3］。MARGIOTTA 等［19］實(shí)驗(yàn)表明Rab7A 控制晚期內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)，直接與Rac1 相互作用，Rab7A 和Rac1 之間的協(xié)調(diào)是將自噬與細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸和信號(hào)傳遞相結(jié)合的關(guān)鍵。BAYLISS 等［20］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Rab8A是HIV-1轉(zhuǎn)運(yùn)到病毒學(xué)突觸（VS）從而感染CD4+T細(xì)胞的重要調(diào)節(jié)因子，敲除Rab8A 潛在地阻止了病毒通過(guò)VS的有效反式感染，Rab8A可控制囊泡運(yùn)輸和促進(jìn)膜突起，Rab8A缺失抑制了膜的突起，從而減少了HIV-1的反式感染。Rab13通過(guò)激活A(yù)MP 依賴(lài)的蛋白激酶（AMPK），阻斷mTOR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)靶點(diǎn)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬［18］。Rab27b 參與了內(nèi)體-溶酶體途徑，與Rab8A 共同參與了自噬體形成［21］。LI 等［22］研究表明Rab21 可通過(guò)促進(jìn)TLR4 內(nèi)體運(yùn)輸和下游信號(hào)激活調(diào)節(jié)脂多糖誘導(dǎo)的促炎反應(yīng)，Rab21 的敲除有效抑制了脂多糖誘導(dǎo)的多種促炎細(xì)胞因子如IL-1b、IL-6和TNF-α表達(dá)。

以上結(jié)果表明，Rab 相關(guān)的幾個(gè)蛋白的下調(diào)或敲除限制了病毒感染，而其上調(diào)與激活似乎誘導(dǎo)加重了炎癥反應(yīng)及自噬。在本實(shí)驗(yàn)中，Rab7A、Rab8A出現(xiàn)上調(diào)，這可能說(shuō)明HIV/AIDS肺脾氣虛證患者體內(nèi)存在正在進(jìn)行的病毒細(xì)胞間感染。相關(guān)Rab蛋白同時(shí)出現(xiàn)上調(diào)也可能與HIV/AIDS 長(zhǎng)期慢性感染炎癥相關(guān)，尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。

3.3 Rap GTPase 家 族 Rap2B 是Rap GTPase 成員，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞過(guò)程，包括細(xì)胞骨架組織和細(xì)胞增殖，Rap2B相關(guān)轉(zhuǎn)導(dǎo)在自噬過(guò)程、突觸形成等方面作用復(fù)雜［23］。Rap2B 誘導(dǎo)了ERK 的磷酸化，是p53的直接靶基因，在細(xì)胞凋亡和遷移的調(diào)控中以p53依賴(lài)的方式發(fā)揮作用［24-25］。Rap2B 同時(shí)可以促進(jìn)MAPK/ERK、PI3K/AKT 和NF-κB 等多種信號(hào)通路的激活［26］。MAPK/ERK、PI3K/AKT 和NF-κB 等通路與HIV 的感染與致病密切相關(guān)，HIV 病毒Nef 及Tat 蛋白可通過(guò)調(diào)控T 細(xì)胞 ERK 激酶活性調(diào)節(jié)病毒的轉(zhuǎn)錄、感染及復(fù)制［27-28］。DEL等［29］研究也表明HIV-1感染改變了T 細(xì)胞表面分子表達(dá)，改變了細(xì)胞骨架重塑及相關(guān)的細(xì)胞事件，并通過(guò)影響各種信號(hào)通路調(diào)節(jié)T 細(xì)胞活化。Rap2B 在艾滋病肺脾氣虛證組中上調(diào)，可能與病毒感染導(dǎo)致的T細(xì)胞活化相關(guān)。

肺脾氣虛證是艾滋病中最常見(jiàn)的臨床證型之一，肺脾氣虛證患者易出現(xiàn)感冒、咳嗽、泄瀉、自汗、乏力等癥狀，肺脾氣虛證患者由于肺之生發(fā)百脈主治節(jié)功能受損，脾之氣血生化來(lái)源不足，引起氣的推動(dòng)、防御及氣化功能下降，導(dǎo)致感染者正氣不足，抵抗力弱，機(jī)體內(nèi)環(huán)境調(diào)節(jié)出現(xiàn)紊亂。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了9 個(gè)上調(diào)的小G 蛋白差異表達(dá)，結(jié)合文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)小G 蛋白R(shí)ho GTPase 家族在病毒的伊始攻擊中發(fā)揮更重要作用，Rab GTPase、Rap GTPase 家族在病毒進(jìn)入細(xì)胞后的復(fù)制轉(zhuǎn)錄及激活各種通路引發(fā)的后續(xù)炎癥、自噬和凋亡等中發(fā)揮作用，這正與機(jī)體各方面機(jī)能代謝信號(hào)傳導(dǎo)密切相關(guān)，但其在感染HIV病毒病程及肺脾氣虛證中的具體功能作用仍處于探索階段。本研究進(jìn)行了證型的初步蛋白篩選，有助于進(jìn)一步研究小G蛋白與艾滋病肺脾氣虛證的感染及發(fā)病相關(guān)機(jī)制，課題組后期將對(duì)小G 蛋白進(jìn)行深入研究，以期為中西醫(yī)結(jié)合治療艾滋病提供新思路。