張 羽 周雪艷 趙亮娟 李 凱 呂軍影（廣西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，南寧 530021）

系統(tǒng)性硬化?。╯ystemic sclerosis，SSc）簡(jiǎn)稱硬皮病，是一種結(jié)締組織自身免疫性疾病，以皮膚、關(guān)節(jié)、內(nèi)臟器官（如肺、胃腸道、心臟）的炎癥及進(jìn)行性纖維化為主要特征，病理表現(xiàn)為血管損傷和真皮中大量膠原蛋白過(guò)度積聚［1-3］。SSc 發(fā)病率為3～24 例/每10 萬(wàn)，好發(fā)于20～60 歲女性，可分為局限性SSc（lcSSc）和彌漫性SSc（dcSSc）兩種類型，其中dcSSc死亡風(fēng)險(xiǎn)更高［4-6］。SSc 目前尚無(wú)特效治療藥物。SSc 的發(fā)生發(fā)展由免疫功能紊亂引起，但確切病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚。近年腸道菌群對(duì)人體生理、病理及疾病的影響日益受到關(guān)注，越來(lái)越多的研究表明，多種自身免疫性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）、多發(fā)性硬化（multiple sclerosis,MS）和炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease,IBD）的發(fā)生發(fā)展均與腸道菌群失衡有關(guān)［7-10］。但目前對(duì)屬于自身免疫性疾病之一的SSc 與腸道菌群的相關(guān)研究較少。因此，本研究擬運(yùn)用16S rRNA 測(cè)序技術(shù)等探討SSc 腸道菌群變化及SSc 常用治療藥物——糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid，GCs）對(duì)其的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物來(lái)源及分組 6周齡雄性SPF級(jí)BALB/c小鼠，體質(zhì)量18～22 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)批號(hào)：SCXK（湘）2016-0002，動(dòng)物使用批號(hào)：SCXK（桂）2014-0003。動(dòng)物飼養(yǎng)溫度：（25±2）℃，相對(duì)濕度為（50±5）%，普通適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后隨機(jī)分為對(duì)照組（Control）、SSc 模型未用藥組（Model）、SSc模型醋酸潑尼松龍治療組（Pred），每組12 只。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)：201809031），整個(gè)實(shí)驗(yàn)程序符合《動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理?xiàng)l例》。

1.1.2 藥物、試劑和儀器 注射用鹽酸博來(lái)霉素（BLM，15 mg/瓶，浙江漢輝藥業(yè)有限公司，批號(hào)：H20055883）；醋酸潑尼松龍片（PAT，5 mg/片，浙江仙居藥業(yè)有限公司，批號(hào)：H33021207）；Sirius Red染色試劑盒（武漢博士德生物公司）；DNA 提取試劑盒、DNA 純化試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；高保真PCR 預(yù)混液（批號(hào)：M0532S，美國(guó)NEB公司）；T100 梯度PCR 儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；電泳裝置DYY-6C（北京市六一儀器廠）；Invitrogen qubit 3.0 分光光度計(jì)（美國(guó)Invitrogen 公司）；Agilent 2100生物分析儀系統(tǒng)（美國(guó)Agilent 公司）；NovaSeq 6000測(cè)序儀（美國(guó)Illumina公司）。

1.2 方法

1.2.1 SSc 小鼠模型構(gòu)建與藥物干預(yù) 依據(jù)文獻(xiàn)［11］，采用BLM 誘導(dǎo)SSc 小鼠模型。剔除各組小鼠背部相同區(qū)域面積約1.5 cm×1.5 cm 被毛，皮下注射0.1 ml 磷酸BLM 緩沖液（200 μg/ml），建立SSc 小鼠模型。模型成功標(biāo)準(zhǔn)：BALB/c 小鼠連續(xù)4 周每日皮下注射BLM 后誘導(dǎo)皮膚硬化和皮膚增厚，組織學(xué)表現(xiàn)為膠原束增粗、均質(zhì)化，肺纖維化誘導(dǎo)形成，膠原在肺內(nèi)積累。本研究共獲得24 個(gè)成功模型。Control 組皮下注射等體積PBS（0.01 mol/L）。造模期間，根據(jù)動(dòng)物與人體表面積劑量折算表計(jì)算Pred組小鼠灌胃醋酸潑尼松龍藥液（0.45 mg/ml）等效劑量為0.2 ml，Control 組和Model 組分別給予等劑量生理鹽水灌胃。以上操作1次/d，連續(xù)28 d。

1.2.2 樣品采集與處理 第28 天末次給藥結(jié)束后，禁食禁水12 h，收集每只小鼠新鮮糞便5～8 粒，放入滅菌PE 管，-80 ℃超低溫保存，以備腸道菌群16S rRNA 基因測(cè)序。實(shí)驗(yàn)結(jié)束第2 天，麻醉處死小鼠，留取皮膚、肺組織分裝于凍存管，用于Sirius Red染色。

1.2.3 一般生存狀態(tài) 造模期間每天觀察記錄各組小鼠精神狀態(tài)、飲食及形體變化、活動(dòng)能力、被毛生長(zhǎng)情況、皮膚彈性及硬度。

1.2.4 病理觀察 根據(jù)文獻(xiàn)［12］，Sirius Red 染色觀察各組小鼠皮膚、肺組織病理改變，測(cè)定組織膠原纖維含量。

1.2.5 16S rRNA 測(cè)序技術(shù)檢測(cè) 參考文獻(xiàn)［13］，使用基因組DNA 提取試劑盒提取糞便樣品中（200 mg）細(xì)菌基因組DNA。以細(xì)菌基因組DNA 為模板，分別以341F（5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′）和806R（5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′）作 為正向和反向引物擴(kuò)增16S rRNA 基因V3-V4高變區(qū)。擴(kuò)增體系30 μl：15 μl Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer、3 μl 引物、5～10 ng DNA模板和12 μl H2O。擴(kuò)增過(guò)程：98 ℃初始預(yù)變性1 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 個(gè)循環(huán)；最終72 ℃延伸5 min。DNA 純化試劑盒純化等質(zhì)量混合物PCR 產(chǎn)物，TruSeq DNA PCR-Free高通量文庫(kù)制備試劑盒構(gòu)建文庫(kù)，Invitrogen Qubit 3.0 分光光度計(jì)和Agilent 2100 生物分析儀系統(tǒng)評(píng)估DNA 文庫(kù)質(zhì)量。Illumina NovaSeq 6000 平臺(tái)進(jìn)行雙端測(cè)序（2×250，PE250），使用FLASH 進(jìn)行合并reads，Qiime 進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾。通過(guò)截?cái)嗟唾|(zhì)量堿基和篩選高質(zhì)量堿基，過(guò)濾后的Tags 序列與Gold 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，UPARSE 軟件7.0.1001 進(jìn)行操作分類單位（OTU）聚類，一致性為97%，再利用UCHIME 對(duì)嵌合體序列進(jìn)行鑒定和去除，獲得有效Tags。使用Silva 16S rRNA 數(shù)據(jù)庫(kù)的RDP 分類器算法分析對(duì)應(yīng)各16S rRNA 基因序列分類群，置信閾值為70%（以上操作均在廣西普斐信息科技有限公司實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用表示，采用SPSS23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)具有正態(tài)性且方差齊時(shí)，采用t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般生存狀態(tài) 造模前各組一般情況無(wú)差異。Control 組小鼠精神良好，動(dòng)作靈活敏捷，活潑好動(dòng)，食量正常，體形發(fā)育正常，體毛光亮順滑，生長(zhǎng)迅速，背部皮膚結(jié)構(gòu)完整，皮膚柔軟彈性好，無(wú)死亡。造模后，Model 組小鼠精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，行動(dòng)緩慢，活動(dòng)減少，進(jìn)食減少，體形逐漸消瘦，被毛暗淡無(wú)光澤，體毛無(wú)新長(zhǎng)，背部皮膚增厚粗糙、硬化，與皮下組織粘連，部分出現(xiàn)結(jié)痂現(xiàn)象。Pred 組小鼠精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)，行為能力稍恢復(fù)，但動(dòng)作仍緩慢，較安靜，食量增加不明顯，體形仍偏小，被毛缺乏光澤，體毛基本無(wú)再生，背部皮膚粗糙、硬化及結(jié)痂情況明顯改善，彈性逐漸恢復(fù)（圖1）。

圖1 各組小鼠一般生存狀態(tài)Fig.1 General survival status of mice in each group

2.2 皮膚、肺組織病理學(xué)指標(biāo) Control 組小鼠皮膚組織未見(jiàn)明顯病理改變，皮膚膠原纖維排列規(guī)整，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，未出現(xiàn)紊亂現(xiàn)象；與Control 組比較，Model 組小鼠皮膚成纖維細(xì)胞及膠原纖維明顯增加，出現(xiàn)較多纖維束，形態(tài)較粗，結(jié)構(gòu)紊亂，相互纏繞螺旋排列，肺組織紅色膠原纖維明顯增多、沉積，肺泡間隔增大、增多，肺組織正常結(jié)構(gòu)損壞，伴有形狀不同、大小不等的結(jié)節(jié)和條索樣改變，呈彌漫性肺纖維化表現(xiàn)。醋酸潑尼松龍干預(yù)后，Pred 組小鼠皮膚和肺組織成纖維細(xì)胞及膠原纖維明顯減少，可見(jiàn)少量纖維束形成，形態(tài)變細(xì)，部分組織疏松呈網(wǎng)狀，纖維結(jié)構(gòu)排列逐漸恢復(fù)有序、規(guī)則。肺泡間隔縮小、減少，肺組織破壞程度、彌漫性肺纖維化程度均改善（圖2）。

圖2 各組小鼠皮膚和肺組織Sirius Red染色Fig.2 Sirius Red staining of skin and lung tissues of mice in each group

2.3 皮膚、肺組織膠原纖維含量變化 Control 組小鼠皮膚及肺組織膠原纖維含量正常；與Control 組比較，Model 組小鼠皮膚、肺組織膠原纖維含量明顯增加（P<0.01）。與Model組比較，Pred組皮膚、肺組織膠原纖維含量明顯降低（P<0.01，圖3）。

圖3 各組小鼠皮膚及肺組織膠原纖維含量Fig.3 Contents of collagen fibrils in skin and lung tissues of mice in each group

2.4 OTU 物種注釋 共得到4 311 212 個(gè)原始讀數(shù)，過(guò)濾后剩余3 477 520個(gè)讀數(shù)。對(duì)36個(gè)樣本序列進(jìn)行分析聚類，篩選頻數(shù)最高的代表序列共1 542個(gè)OTU。使用GraPhlAn 結(jié)合OTU Table 對(duì)各分組樣本分別進(jìn)行單獨(dú)OTU 物種注釋，以總體報(bào)告形式展示優(yōu)勢(shì)菌種（圖4）。Control 組優(yōu)勢(shì)菌主要分布于擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形桿菌門（Proteobacteria）；Model 組優(yōu)勢(shì)菌主要分布于擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形桿菌門（Proteobacteria）、螺旋體菌門（Saccharibacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）；Pred組優(yōu)勢(shì)菌主要分布于擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形桿菌門（Proteobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）。

圖4 基于GraPhlAn的OTU注釋結(jié)果等級(jí)樹(shù)圖Fig.4 GraPhlAn based hierarchical tree plot of OTU annotation results

2.5 α 多樣性分析 物種累積箱形圖可用于描述樣本量增加與新物種出現(xiàn)速度的關(guān)系，是評(píng)價(jià)樣本量充分與否以及物種豐富度的有效工具。橫坐標(biāo)表示樣本量進(jìn)一步加大，箱形圖位置逐漸趨于平緩，表明樣本量對(duì)該環(huán)境中的物種增加產(chǎn)生影響較小，提示樣本量充分，物種足夠豐富（圖5）。

圖5 物種累積箱形圖Fig.5 Species cumulative box plot

分別對(duì)三組及兩組間進(jìn)行聚類分析（圖6），三組共有OTUs 575 個(gè)。Control 組與Model 組共有OTUs 610個(gè)，其中Control 組特有OTUs 735 個(gè)，Model 組特有OTUs 56 個(gè)；Control 組與Pred 組共有OTUs 620 個(gè)，其中Control 組特有OTUs 725 個(gè)，Pred組特有OTUs 53 個(gè)；Pred 組與Model 組共有OTUs 606 個(gè)，Pred 組特有OTUs 67 個(gè)，Model 組特有OTUs 60個(gè)。

圖6 韋恩圖Fig.6 Venn diagram

Observed_species 指數(shù)表示實(shí)際觀測(cè)到的OTU數(shù)，反映物種豐富度信息；PD_whole_tree 指數(shù)可顯示微生物群落系統(tǒng)遺傳多樣性。Model組Observed_species 和PD_whole_tree 指數(shù)顯著低于Control 組（P<0.01），而Pred 組與Model 組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，圖7、表1）。

表1 腸道菌群多樣性指數(shù)分析（，n=12）Tab.1 Analysis of diversity indexes of intestinal flora（，n=12）

表1 腸道菌群多樣性指數(shù)分析（，n=12）Tab.1 Analysis of diversity indexes of intestinal flora（，n=12）

Note：Compared with Control group，1）P<0.01.

圖7 Alpha多樣性箱型圖Fig.7 Alpha diversity boxplots

2.6 β多樣性分析

2.6.1 主成分分析（PCA）及無(wú)度量多維標(biāo)定法（NMDS）分析 Model 組與Control 組各點(diǎn)間距離較遠(yuǎn)，菌群組成差異較大；Model 組與Pred 組樣品距離較近，菌群組成較為相似，第一主成分對(duì)樣品差異的貢獻(xiàn)值為16.72%，第二主成分對(duì)樣品差異的貢獻(xiàn)值為13.87%（圖8A）。NMDS 分析顯示，Stress=0.073，樣本組成差異顯著。Control 組與Model 組各點(diǎn)距離較遠(yuǎn)，樣本間物種組成存在顯著差異；Model組和Pred 組間各點(diǎn)距離較近，物種組成差異較小，Control組與Pred組物種組成差異較大（圖8B）。

圖8 PCA及NMDS分析圖Fig.8 PCA and NMDS analysis plots

2.6.2 門和屬水平微生物區(qū)系組成比較 組間T-test 評(píng)估腸道菌群在門和屬水平上組間差異顯著（P<0.05）的物種，Control 組相比，Model 組變形桿菌門（Proteobacteria）豐度明顯偏高；而酸桿菌門（Acidobacteria）僅在Control 組富集。與Model 組相比，醋酸潑尼松治療后，放線菌門（Actinobacteria）、螺旋體菌門（Saccharibacteria）豐度顯著降低。與Control組相比，Pred組中厚壁菌門（Firmicutes）、變形桿菌門（Proteobacteria）豐度偏高，擬桿菌門（Bacteroidetes）、螺旋體菌門（Saccharibacteria）豐度偏低，酸桿菌門（Acidobacteria）缺乏（圖9A）。屬水平物種比較表明，與Control 組比較，Model 組擬桿菌屬（Bacteroides）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、普雷沃氏菌科_UCG-001（Prevotellaceae_UCG-001）豐度均值顯著降低（P<0.05）；螺桿菌（Helicobacter）、瘤胃梭菌屬_6（Ruminiclostridium_6）、文肯菌屬（Rikenella）、羅斯氏菌屬（Roseburia）、瘤胃菌科_UCG-005（Ruminococcaceae_UCG-005）豐度均值顯著升高（P<0.05）。醋酸潑尼松干預(yù)治療后，與Model 組比較，Pred 組藍(lán)綠藻菌屬（Lachnoclostridium）、顫桿菌屬（Oscillibacter）、糞球菌屬_1（Coprococcus_1）、瘤胃球菌屬_1（Ruminococcus_1）豐度均值升高（P<0.05）；別樣桿菌屬（Alistipes）、文肯菌屬（Rikenella）、瘤胃菌科_UCG-005（Ruminococcaceae_UCG-005）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、Candidatus_Saccharimonas豐度均值降低（P<0.05）。與Control 組比較，Pred 組小鼠腸道螺桿菌（Helicobacter）、藍(lán)綠藻菌屬（Lachnoclostridium）、未確定的瘤胃菌科（unidentified_Ruminococcaceae）、瘤胃球菌屬_1（Ruminococcus_1）、支原體菌屬（Mycoplasma）、顫桿菌屬（Oscillibacter）豐度均值顯著升高（P<0.05），纏結(jié)優(yōu)桿菌（Eubacterium_nodatum_group）、Marvinbryantia、瘤胃菌科_NK4A214_組（Ruminococcaceae_NK4A214_group）豐度均值顯著降低（P<0.05，圖9B）。

2.6.3 組間特征差異物種比較 線性判別分析LEfSe（LDA Effect Size）尋找組間差異顯著的物種，即Biomarker，具有高維生物標(biāo)識(shí)特點(diǎn)。LDA 值分布柱狀圖展示，門水平上，Control 組小鼠腸道富集擬桿菌門下的普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）、普雷沃氏菌科_UCG-001（Prevotellaceae_UCG-001）（倍變化評(píng)分分別為4.2 和4.125，圖10A）；與Model 組對(duì)比，Pred 組普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）豐度差異最大（倍變化評(píng)分為4.3，圖10B）。與Control 組對(duì)比，Pred組厚壁菌門下的梭菌綱（Clostridia）、梭菌目（Clostridiales）豐度差異最大（倍變化評(píng)分均為4.65），而Control 組豐度差異最大的為擬桿菌綱（Bacteroidia）、擬桿菌目（Bacteroidales）、擬桿菌科（Bacteroidetes）、擬桿菌科_S24_7_組（Bacteroidales_S24_7_group）（倍變化評(píng)分為4.6、4.6、4.6 和4.7，圖10C）。

圖10 組間LDA值分布柱狀圖及進(jìn)化分支圖Fig.10 LDA score bar graphs and evolutionary cladogram between groups

3 討論

SSc 是一種病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確的難治性自身免疫性疾病。研究報(bào)道，多種環(huán)境因素（感染因子、血管損傷、免疫異常、化學(xué)暴露和維生素D 缺乏）及遺傳易感性驅(qū)動(dòng)SSc發(fā)病，其中免疫異常被認(rèn)為與SSc關(guān)系最為密切［14-16］。近年研究表明，腸道菌群失衡可導(dǎo)致腸道黏膜損傷、免疫功能紊亂，出現(xiàn)炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-17 和TNF-α 等過(guò)表達(dá)誘發(fā)慢性炎癥，持續(xù)慢性炎癥誘發(fā)結(jié)締組織免疫性疾病，累及全身多個(gè)器官或組織［17-18］。腸道菌群與自身免疫性疾病的關(guān)系已成為當(dāng)下研究熱點(diǎn)。

正常情況下，菌群維護(hù)腸道黏膜屏障，對(duì)機(jī)體免疫、生長(zhǎng)發(fā)育和代謝起重要調(diào)節(jié)作用［19］。一旦菌群在定植部位發(fā)生豐度、多樣性、結(jié)構(gòu)及生物特性改變，平衡即被打破進(jìn)而誘發(fā)疾?。?0］。許多疾病進(jìn)程及轉(zhuǎn)歸均與腸道菌群關(guān)系密切，LU 等［21］研究2 型糖尿病時(shí)發(fā)現(xiàn)腸道菌群失衡是胰島素抵抗進(jìn)展的重要危險(xiǎn)因素。聶源等［22］研究肝癌與腸道微生態(tài)關(guān)系時(shí)也得到了同樣結(jié)論。研究顯示自身免疫性疾病與腸道菌群失衡有重大關(guān)系，RA、SLE 是菌群失調(diào)引起的異常免疫應(yīng)答［23-25］。目前關(guān)于自身免疫性疾病與腸道菌群失調(diào)的關(guān)系研究主要集中于強(qiáng)直性脊柱炎、自身免疫性胰腺炎和克羅恩病等疾病，對(duì)SSc與腸道菌群的研究很少［26-28］。根據(jù)以上研究及SSc發(fā)病特點(diǎn)，推測(cè)SSc發(fā)生發(fā)展可能也與腸道菌群失調(diào)有關(guān)。本研究運(yùn)用16S rRNA 基因測(cè)序技術(shù)對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的SSc 小鼠腸道菌群狀況進(jìn)行觀察，同時(shí)觀察了SSc 常用藥物GCs（醋酸潑尼松龍）在治療SSc小鼠過(guò)程中對(duì)腸道菌群的影響。

本研究采用BLM 誘導(dǎo)SSc 小鼠模型，這一建模方法最先由YAMAMOTO 等［29］于1999 年建立，具有與人類SSc 皮膚、肺組織學(xué)特征相似的特點(diǎn)，是目前學(xué)界公認(rèn)的SSc 模型之一。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)造模后小鼠出現(xiàn)精神差、活動(dòng)慢、進(jìn)食少、體型瘦小及皮膚明顯硬化等生存狀況不佳表現(xiàn)。病理發(fā)現(xiàn)皮膚、肺組織成纖維細(xì)胞及膠原纖維明顯增多，纖維束增粗，結(jié)構(gòu)排列紊亂；肺泡間隔增大、增多，肺組織正常結(jié)構(gòu)損壞，伴有彌漫性肺纖維化表現(xiàn)，符合SSc 模型特征，與人體SSc 臨床表現(xiàn)及病理改變基本一致。潑尼松龍能改善小鼠一般生存狀況及病理表現(xiàn)，皮膚、肺組織膠原蛋白含量改善最為明顯。

16S rRNA 細(xì)菌基因測(cè)序技術(shù)是通過(guò)對(duì)細(xì)菌16S rRNA 基因可變區(qū)進(jìn)行特異性引物設(shè)計(jì)，利用高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)不同樣品進(jìn)行高通量測(cè)序，獲得16S rRNA 基因序列，比對(duì)基因庫(kù)數(shù)據(jù)分析環(huán)境樣本中細(xì)菌的技術(shù)，目前廣泛用于腸道菌群譜鑒定分析。本研究發(fā)現(xiàn)，Model組與Control 組小鼠比較，腸道菌群發(fā)生明顯變化，通過(guò)Observed_species 和PD_whole_tree 指數(shù)圖發(fā)現(xiàn)腸道菌群豐富度、系統(tǒng)譜系多樣性顯著下降；通過(guò)韋恩圖、PCA 及NMDS圖分析發(fā)現(xiàn)Model組小鼠菌群組成結(jié)構(gòu)與Control組小鼠存在顯著差異；通過(guò)GraPhlAn 圖、T-test 圖得到兩組間門及屬水平上豐度差異顯著的大量具體物種；通過(guò)LEfSe 圖獲得組間最具特征性差異的生物標(biāo)志物。菌群這些改變可能參與SSc 發(fā)病及發(fā)展過(guò)程。變形菌門（Proteobacteria）包括很多病原菌屬，在Model 組中豐度異常升高，可通過(guò)腸道運(yùn)輸至體循環(huán)，啟動(dòng)免疫細(xì)胞，影響遠(yuǎn)端器官炎癥/纖維化反應(yīng)，與ANDRéASSON 等［30］近期對(duì)瑞典隆德大學(xué)、美國(guó)加利福尼亞大學(xué)洛杉磯分校的兩組SSc 患者糞便菌群研究結(jié)論相似。瘤胃梭菌屬_6（Ruminiclostridium_6）為致病菌，研究證實(shí)其豐度顯著升高可加速高脂飲食導(dǎo)致的動(dòng)脈硬化合并RA 疾病進(jìn)展［31］。文肯菌屬（Rikenella）豐度比例與甲狀腺功能亢進(jìn)引起的代謝異常程度呈正相關(guān)［32］。螺桿菌（Helicobacter）介導(dǎo)局部炎癥及免疫應(yīng)答，誘發(fā)宿主免疫損傷，與消化道疾病、免疫性疾病有關(guān)，其中幽門螺桿菌（H.pylori，HP）、肝螺桿菌是引起消化性潰瘍、胃癌、肝癌的病原菌，且在HP 感染自身免疫性疾病包括SSc患者比例普遍偏高［33］。RADI? 等［34］研究表明HP 陽(yáng)性與SSc 患者中皮膚及內(nèi)臟臨床受累程度有關(guān)，與疾病嚴(yán)重程度評(píng)分呈正相關(guān)，Model 組腸道中這些致病菌豐度顯著升高可能與SSc 發(fā)病密切相關(guān)。擬桿菌屬（Bacteroides）在Model 組豐度降低，與VOLKMANN等［35］報(bào)道加州大學(xué)洛杉磯分校17例SSc門診患者研究結(jié)果一致，豐度低可導(dǎo)致免疫功能紊亂、內(nèi)源性感染而致??；研究報(bào)道，乳酸桿菌屬（Lactobacillus）是益生菌，可保護(hù)腸道黏膜屏障，通過(guò)調(diào)控炎癥因子維持機(jī)體適度免疫，豐度低下可導(dǎo)致Th1/Th2 失衡，誘發(fā)RA［36］。本研究中Model 組其豐度降低，進(jìn)而打破免疫平衡，促發(fā)自身免疫異常而致病。普雷沃氏菌_UCG-001（Prevotellaceae_UCG-001）豐度與抗炎因子呈正相關(guān)，與促炎因子呈負(fù)相關(guān)［37］。Model 組小鼠皮膚、肺部炎癥浸潤(rùn)可能與其豐度顯著降低有關(guān)；普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）作為維持健康小鼠腸道微生態(tài)平衡的生物標(biāo)志物，能維持腸道正常通透性及屏障功能，其豐度下降可導(dǎo)致免疫活性增加進(jìn)而引發(fā)自身免疫?。?8］。瘤胃球菌科_UCG-005（Ruminococcaceae_UCG-005）、羅斯氏菌屬（Roseburia）可產(chǎn)生短鏈脂肪酸（SCFA），參與炎癥反應(yīng)和腸黏膜免疫，調(diào)控腫瘤免疫［39］。研究表明，瘤胃球菌科_UCG-005數(shù)量減少會(huì)加劇炎癥性腸病、胃癌癌前病變進(jìn)程，而豐度過(guò)高促使肝細(xì)胞損傷誘發(fā)癌變［40-41］。羅斯氏菌屬在一定條件下具有抗炎作用，在慢性風(fēng)濕性疾病、特發(fā)性關(guān)節(jié)炎等疾病中豐度持續(xù)下降，但在非病毒性肝細(xì)胞肝癌患者腸道中豐度顯著升高［42-43］。因此，Model組這些條件致病菌豐度顯著升高，可能與SSc 持續(xù)慢性炎癥病變最終導(dǎo)致免疫功能失調(diào)有關(guān)。

GCs 是SSc 常用治療藥物，一般認(rèn)為GCs 治療SSc 的機(jī)制主要是抗炎、免疫抑制及抗纖維增生，GCs 對(duì)腸道菌群的影響研究較少，尤其是對(duì)SSc 腸道菌群的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究觀察GCs藥物醋酸潑尼松龍對(duì)SSc 小鼠治療效果的同時(shí)，也觀察了對(duì)SSc 小鼠腸道菌群的影響，發(fā)現(xiàn)醋酸潑尼松龍治療過(guò)程中可有效改善SSc 小鼠一般生存狀態(tài)及皮膚和肺組織纖維化程度，治療28 d 后，腸道菌群也發(fā)生一系列變化。普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）（Biomarker）在Pred組豐度回調(diào)。既往研究表明，別樣桿菌屬（Alistipes）可致炎癥和腫瘤，驅(qū)動(dòng)人類結(jié)腸炎和結(jié)直腸癌發(fā)?。?4］；Pred 可下調(diào)其豐度抑制炎癥反應(yīng)和過(guò)度免疫應(yīng)答。藍(lán)綠藻菌屬（Lachnoclostridium）、顫桿菌屬（Oscillibacter）、糞球菌屬_1（Coprococcus_1）、瘤胃球菌屬_1（Ruminococcus_1）均為產(chǎn)丁酸鹽菌，具有抗炎作用，在Pred 組豐度顯著增加可能發(fā)揮積極抗炎作用［45-48］。雙岐桿菌屬（Bifidobacterium）是公認(rèn)的益生菌，為腸道提供酸性環(huán)境，維持腸道正常免疫功能，MS 狀態(tài)下，豐度降低導(dǎo)致Th17 過(guò)度激活，免疫耐受失控而發(fā)?。?9］。另有報(bào)道，Candidatus_Saccharimonas腸道豐度顯著升高有利于減輕腸道炎癥損傷，參與免疫調(diào)節(jié)及腸道修復(fù)［50］。實(shí)驗(yàn)中還觀察到Pred 組與Control 組比較，致病菌螺桿菌（Helicobacter）、支原體菌屬（Mycoplasma）豐度顯著升高［51］。推測(cè)Pred 對(duì)上述有益菌屬及致病菌豐度的逆向調(diào)節(jié)可能與激素治療后出現(xiàn)腸道屏障破壞、菌群失調(diào)導(dǎo)致腸道炎癥反應(yīng)加重、炎癥刺激自身抗原暴露、繼發(fā)自身免疫性疾病等副作用有關(guān)［52］。同時(shí)，Pred 組厚壁菌門的梭菌綱（Clostridia）、梭菌目（Clostridiales）、未確定的瘤胃菌科（unidentified_Ruminococcaceae）豐度顯著增多，有益菌Marvinbryantia、瘤胃菌科_NK4A214 組（Ruminococcaceae_NK4A214_group）、擬桿菌科_S24_7 組（Bacteroidales_S24_7_group），致病菌纏結(jié)真桿菌Eubacterium_nodatum_group豐度顯著降低［53-56］。Pred 對(duì)模型小鼠腸道各分類細(xì)菌群的豐度調(diào)節(jié)與Control 組存在明顯差異，Pred 組小鼠腸道菌群豐富度、譜系多樣性有一定程度改善，但菌群組成結(jié)構(gòu)與Model組相似，醋酸潑尼松龍無(wú)法完全恢復(fù)小鼠腸道微生態(tài)，可能是無(wú)法達(dá)到最佳SSc 治療效果的原因之一。提示醋酸潑尼松龍有限影響了SSc 小鼠失衡的腸道菌群譜，但并不能根本改善SSc 小鼠失調(diào)菌群。研究結(jié)果給SSc 治療帶來(lái)了一些啟示，應(yīng)用GCs 治療SSc 過(guò)程中尚需注意糾正腸道菌群失調(diào)狀態(tài)，聯(lián)用能夠調(diào)控腸道菌群紊亂的藥物和/或微生物制劑修復(fù)菌群失衡可能有利于提高SSc治療效果。

本研究的局限表現(xiàn)為樣本量小及缺乏時(shí)間縱向研究。盡管樣本量小，本研究觀察到了一些顯著關(guān)聯(lián)，表明本研究結(jié)果不是偶然的。此外，觀察到疾病表型影響，尚未研究至分子水平，對(duì)菌群與SSc病程中炎癥及纖維化的直接或間接聯(lián)系以及激素通過(guò)菌群對(duì)SSc的分子調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。