錢 磊 季愛華 張文劍（濰坊市益都中心醫(yī)院心臟大血管外科，濰坊 262500）

鈣化性主動(dòng)脈瓣疾?。╟alcified aortic valve disease，CAVD）的主要特點(diǎn)為主動(dòng)脈瓣纖維增厚和鈣化，能夠引起主動(dòng)脈瓣狹窄，最終導(dǎo)致慢性心力衰竭［1］。隨著人口的老齡化，CAVD 的發(fā)生率逐年升高，并成為常見的心臟瓣膜病［2］。CAVD 病理過程復(fù)雜，包括內(nèi)皮功能障礙、脂質(zhì)沉積、慢性炎癥、細(xì)胞成骨分化等，最終導(dǎo)致瓣膜鈣化。其中炎癥細(xì)胞浸潤十分關(guān)鍵［3］。目前臨床治療CAVD 只能通過主動(dòng)脈瓣膜置換術(shù)，而缺乏有效藥物。因此在CAVD的致病機(jī)制上尋找治療靶點(diǎn)十分重要。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是轉(zhuǎn)化生長因子超家族成員，不但可以誘導(dǎo)骨、軟骨，以及皮下、肌肉的異位骨形成，還能調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和器官形成［4］。在CAVD 的進(jìn)展中，主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞（aortic valve interstitial cells，AVICs）會(huì)呈成骨樣分化，在分化過程中，堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）表達(dá)升高［5］。BMP2、BMP4在鈣化瓣膜組織中表達(dá)升高［6］。而BMP9 與BMP2、BMP4 功能類似，促成骨能力很強(qiáng)［7］。在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的炎癥環(huán)境中，BMP9促進(jìn)人牙周膜干細(xì)胞的成骨分化，上調(diào)炎癥標(biāo)志物表達(dá)［8］。在動(dòng)脈粥樣硬化中，BMP9可驅(qū)動(dòng)血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，造成局部動(dòng)脈粥樣硬化［9］。但BMP9在CAVD中的作用研究鮮有報(bào)道。

本研究的實(shí)驗(yàn)前期發(fā)現(xiàn)BMP9 在CAVD 患者組織中表達(dá)升高，推測BMP9 可能促進(jìn)瓣膜鈣化。由于心臟瓣膜鈣化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是AVICs 的成骨分化，因此本研究以豬AVICs 為研究對象，探討B(tài)MP9 對AVICs 成骨分化的影響，為CAVD 的治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 人瓣膜組織和豬AVICs 來源 選擇濰坊市益都中心醫(yī)院的主動(dòng)脈夾層患者為non-CAVD 組，主動(dòng)脈鈣化患者為CAVD組。取患者主動(dòng)脈瓣膜組織，一部分于4%多聚甲醛固定，另一部分于液氮保存。所有患者及家屬均簽署知情同意書。

于濰坊市青州市動(dòng)物檢疫定點(diǎn)屠宰場收集家豬（8～10 月齡，體質(zhì)量120～150 kg）主動(dòng)脈瓣膜組織，體外分離培養(yǎng)原代AVICs。本研究通過濰坊市益都中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（20200512）。

1.1.2 主要試劑及儀器 BMP9 干擾RNA（si-BMP9）、陰性對照干擾RNA（si-RNA）購自廣州銳博公司；重組腺病毒BMP7（recombinant adenovirus BMP7，Ad-BMP7）和攜帶綠色熒光蛋白基因的重組腺病毒（recombinant adenovirus carrying green fluorescent protein gene，Ad-GFP）購自上海漢恒公司；胎牛血清、胰蛋白酶、雄激素受體（androgen receptor，AR）染色試劑盒、ALP 染色試劑盒購自上海碧云天公司；M199培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、Vimentin、血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1，CD31）抗體購自萬類公司；BMP9、Runx2、OCN、OPN 抗體購自美國CST 公司；Notch2、發(fā)狀分裂相關(guān)增強(qiáng)子1（hairy and enhancer of split 1，Hes1）、Notch 胞內(nèi)域（Notch intracellular domain，NICD）、Toll 樣受體-4（Toll-like receptor-4，TLR4）、核因子κB p65（nuclear factor κB p65，NF-κB p65）抗體購自深圳市豪地華拓公司；二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒購自北京中杉金橋公司；冷凍離心機(jī)購自美國Beckman 公司；組織包埋機(jī)購自德國Leica 公司；蛋白電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀購自美國伯樂公司；電子顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色 取出4%多聚甲醛固定的主動(dòng)脈瓣膜組織并制成石蠟切片，經(jīng)烘片、二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫洗、枸櫞酸鈉緩沖液抗原修復(fù)、3%H2O2封閉、血清室溫封閉、一抗4 ℃孵育過夜、二抗室溫30 min，3，3′-二氨基聯(lián)苯胺（3，3′-Diaminobenzidine，DAB）顯色、蘇木素復(fù)染，后經(jīng)梯度乙醇脫水、透明、封片、顯微鏡（×200）下觀察。

1.2.2 豬AVICs 的分離、培養(yǎng)與鑒定 AVICs 的分離、培養(yǎng)：離體主動(dòng)脈瓣膜用含雙抗的PBS漂洗后保存于新鮮M199培養(yǎng)基中，PBS漂洗后用Ⅰ型膠原酶消化組織，將瓣膜剪成小塊，于膠原酶中消化過夜。次日離心收集細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的M199培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2條件中培養(yǎng)，每3 d換液1次。待細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)消化傳代。

免疫熒光鑒定細(xì)胞表型：豬AVICs 接種于24 孔板的爬片，待細(xì)胞密度達(dá)到50%時(shí)用4%多聚甲醛固定，0.5% Triton-X100 破膜，3%H2O2封閉，血清室溫封閉，加入α-SMA、Vimentin 和CD31 一抗（1∶50）4 ℃孵育過夜，加入熒光染料標(biāo)記的二抗（1∶200）室溫避光孵育2 h，DAPI 復(fù)染細(xì)胞核，于熒光顯微鏡（×200）下觀察α-SMA、Vimentin和CD31表達(dá)。

1.2.3 豬AVICs 的成骨分化誘導(dǎo) 取對數(shù)生長期的AVICs于M199培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度約50%時(shí)向培養(yǎng)基中加入10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μg/ml維生素C、100 nmol/L 地塞米松誘導(dǎo)AVICs細(xì)胞成骨分化。

1.2.4 BMP9 處理及實(shí)驗(yàn)分組 取對數(shù)生長期的AVICs，以2×105個(gè)/孔密度鋪于6 孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到約70%時(shí)，構(gòu)建BMP9 基因沉默及過表達(dá)體系。轉(zhuǎn)入siRNA，分為control 組（未轉(zhuǎn)染siRNA 的AVICs 細(xì)胞）、si-control 組（轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA 的AVICs細(xì)胞）、si-BMP9組（轉(zhuǎn)染BMP9-siRNA的AVICs細(xì)胞）。轉(zhuǎn)染重組腺病毒，分為Ad-GFP組（轉(zhuǎn)染GFP腺病毒的AVICs 細(xì)胞）、Ad-BMP9 組（轉(zhuǎn)染BMP9 腺病毒的AVICs細(xì)胞）。轉(zhuǎn)染48 h后，提取細(xì)胞總RNA用于qPCR 檢測；提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)用于Western blot檢測。

1.2.5 ALP 染色 將轉(zhuǎn)染后的AVICs 細(xì)胞接種于24 孔板，各組細(xì)胞加入鈣鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d，然后用PBS 洗滌3 次，4%多聚甲醛室溫固定后，加入NBT/BCIP 溶液行ALP 染色，避光30 min 后觀察染色結(jié)果。ALP 染色如細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)藍(lán)色輪廓，提示細(xì)胞內(nèi)ALP與染料結(jié)合。

1.2.6 AR 染色 將轉(zhuǎn)染后的AVICs 細(xì)胞接種于24孔板，各組細(xì)胞加入鈣鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d，PBS洗滌3 次，4%多聚甲醛室溫固定后，加入0.4% AR 染液染色，采用去離子水終止反應(yīng)，顯微鏡下觀察鈣鹽沉積情況。茜素紅染色細(xì)胞外出現(xiàn)深紅色鈣化結(jié)節(jié)，提示產(chǎn)生鈣質(zhì)。

1.2.7 qRT-PCR 檢測AVICs 中BMP9 及相關(guān)成骨指標(biāo)的mRNA 表達(dá) 采用Trizol 法提取AVICs 細(xì)胞總RNA。將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并使用SYBR Green 進(jìn)行擴(kuò)增，GAPDH 用作內(nèi)參。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，62 ℃ 30 s，共40 個(gè)循環(huán)。使用2-ΔΔCt公式計(jì)算BMP9、Runx2、OPN、OCN mRNA 的相對表達(dá)水平。BMP9-F：5′-ACGATCTGTTTCCCCTCATCT-3′，BMP9-R：5′-ATGCAGGGATGATGTTCTG-3′。Runx2-F：5′-GCACTACCCAGCCACCTTTA-3′，Runx2-R：5′-TATGGAGTGCTGCTGGTCTG-3′。OPN-F：5′-GAGCAAACAGACGATGTGGA-3′，OPN-R：5′-GACCAGCTCATCGGATTCAT-3′。OCN-F：5′-TCACACTGCTTGCCCTACTG-3′，OCN-R：5′-TGCCATAGAAGCGCCGATAG-3′。GAPDH-F：5′-GGTGAAGGTCGGAGTGAACG-3′，GAPDH-R：5′-CGTGGGTGGAATCATACTGGA-3′。

1.2.8 Wertern blot 檢 測CAVD 組織和AVICs 中BMP9、相關(guān)成骨指標(biāo)及Notch、TLR4 信號通路蛋白表達(dá) 取部分CAVD 組織和AVICs，加入適量RIPA組織裂解液進(jìn)行總蛋白提取，并測定各組蛋白濃度，緩沖液稀釋后進(jìn)行SDS-PAGE 分離蛋白，電泳完畢后迅速轉(zhuǎn)至PVDF 膜，于TBST 中室溫封閉2 h，分別加入BMP9、Runx2、OPN、OCN、Notch2、NICD、Hes1、TLR4、NF-κB p65 一抗（1∶2 000）4 ℃孵育過夜。TBST 洗滌3 次后，加入二抗（1∶10 000）室溫孵育2 h，最后避光加入ECL顯色劑顯色，Bio-Rad凝膠成像儀記錄蛋白灰度并拍照，以GAPDH 作為對照，對各組蛋白表達(dá)進(jìn)行相對定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Runx2、BMP9 在CAVD 組織中的表達(dá) 免疫組化結(jié)果（圖1A）及Western blot（圖1B）結(jié)果顯示，與non-CAVD 組相比，CAVD 組中Runx2、BMP9 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。說明BMP9能夠促進(jìn)瓣膜鈣化，且在CAVD的進(jìn)展中起重要作用。

2.2 豬AVICs 的形態(tài)及表型鑒定 接種24 h 后，AVICs 細(xì)胞呈長梭形，形態(tài)趨于一致，呈放射狀（圖2A）；免疫熒光染色結(jié)果顯示，α-SMA（圖2B）、Vimentin（圖2C）陽性表達(dá)；而CD31陰性表達(dá)（圖2D）。說明原代豬AVICs分離成功。

圖2 豬AVICs的形態(tài)及表型鑒定（×200）Fig.2 Morphology and phenotype identification of pig AVICs（×200）

2.3 BMP9促進(jìn)豬AVICs的成骨分化 ALP染色結(jié)果（圖3A）顯示，與si-control組相比，si-BMP9組藍(lán)紫色染色結(jié)節(jié)明顯減少，ALP 活性降低（P<0.05）；與Ad-GFP 組相比，Ad-BMP9 組藍(lán)紫色染色結(jié)節(jié)明顯增多，ALP 活性升高（P<0.05）。茜素紅染色結(jié)果（圖3B）顯示，與si-control組相比，si-BMP9組紅色鈣化結(jié)節(jié)明顯減少，茜素紅濃度降低（P<0.05）；與Ad-GFP 組相比，Ad-BMP9 組深紅色鈣化結(jié)節(jié)明顯增多，茜素紅濃度升高（P<0.05）。qRT-PCR（圖3C）和Western blot（圖3D）結(jié)果顯示，與si-control 組相比，si-BMP9組BMP9、Runx2、OPN和OCN mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低（P<0.05）；與Ad-GFP 組相比，Ad-BMP9 組BMP9、Runx2、OPN 和OCN mRNA 和蛋白表達(dá)水平明顯升高（P<0.05）。提示BMP9能夠促進(jìn)AVICs成骨分化，并提高成骨指標(biāo)表達(dá)。

圖3 BMP9促進(jìn)豬AVICs的成骨分化Fig.3 BMP9 promotes osteogenic differentiation of pig AVICs

2.4 BMP9對Notch、TLR4信號通路的影響 Western blot結(jié)果（圖4）顯示，與si-control組相比，si-BMP9組Notch2、NICD、Hes1、TLR4、NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P<0.05）；與Ad-GFP 組相比，Ad-BMP9組Notch2、NICD、Hes1、TLR4、NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P<0.05）。說明BMP9 可能通過Notch 和TLR4 信號通路調(diào)節(jié)AVICs 細(xì)胞的成骨樣分化。

圖4 BMP9對Notch、TLR4信號通路的影響Fig.4 Influence of BMP9 on Notch and TLR4 signaling pathway

3 討論

CAVD 是一種活躍的、細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的退行性疾病。健康瓣膜中AVICs 保持靜止，維持成纖維細(xì)胞樣特征，但在CAVD 中AVICs 會(huì)呈成骨樣分化，并伴有Runx2、OPN、OCN 和ALP 表達(dá)升高［10-11］。在骨形成及心臟瓣膜發(fā)育中，BMPs 起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)BMP2、BMP4、BMP7 在CAVD 中表 達(dá)升 高，表明BMPs 家族與CAVD 相關(guān)［12-14］。BMP2 的主要作用為直接誘導(dǎo)鈣化，而BMP9 主要參與內(nèi)皮病變。瓣膜鈣化過程中，最初表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞損傷和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，但最終將轉(zhuǎn)化為AVICs 表型［15］。研究發(fā)現(xiàn)，BMP9 可誘導(dǎo)VCAM-1 和ICAM-1 表達(dá)，引起血管炎癥，進(jìn)而誘導(dǎo)局部的動(dòng)脈粥樣硬化，且BMP9 也能使血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生鈣化，表明BMP9 在鈣化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［16-17］。本研究證實(shí)，在CAVD 組織中BMP9 表達(dá)升高，推測BMP9可能在CAVD 中起重要作用。通過構(gòu)建低表達(dá)和過表達(dá)BMP9 的AVICs發(fā)現(xiàn)敲減BMP9后，Runx2、OPN、OCN 等成骨指標(biāo)表達(dá)降低，同時(shí)ALP 染色變淺，鈣鹽沉積減少；BMP9過表達(dá)后，Runx2、OPN、OCN 表達(dá)增加，ALP 染色變深，鈣鹽沉積增加，說明BMP9 能夠促進(jìn)AVICs 成骨分化。

Notch 信號通路能夠調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等生理過程，同時(shí)Notch 信號通路在誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化及內(nèi)皮細(xì)胞鈣化中起重要作用。如謝正松等［18］發(fā)現(xiàn)過表達(dá)BMP4通過激活Notch 信號通路，促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨分化。MAJUMDAR 等［19］發(fā)現(xiàn)Notch 信號通路可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞鈣化。ZENG 等［20］研究表明Notch 信號通路在人心臟瓣膜間質(zhì)細(xì)胞鈣化過程中發(fā)揮重要的促進(jìn)作用。許多研究表明慢性炎癥反應(yīng)參與退行性瓣膜鈣化。TLR4是一種模式識(shí)別受體，可表達(dá)于主動(dòng)瓣膜間質(zhì)細(xì)胞，能夠誘導(dǎo)膜間質(zhì)細(xì)胞的成骨分化和造成炎癥反應(yīng)。如ZHENG 等［21］發(fā)現(xiàn)主動(dòng)瓣膜間質(zhì)細(xì)胞中TLR4、NF-κB 水平上調(diào)，miR-214 通過激活TLR4 通路促進(jìn)鈣化。SHEN 等［22］發(fā)現(xiàn)小鼠主動(dòng)瓣膜間質(zhì)細(xì)胞鈣化區(qū)中TLR4表達(dá)水平增加，TLR4基因敲除后，主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞鈣化程度明顯減弱。本研究中敲減BMP9 后，Notch2、NICD、Hes1、TLR4、NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平降低；過表達(dá)BMP9 后，Notch2、NICD、Hes1、TLR4、NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平升高，說明BMP9可能通過激活Notch 和TLR4信號通路發(fā)揮促鈣化作用，見圖5。

圖5 BMP9誘導(dǎo)豬AVICs成骨分化的作用機(jī)制Fig.5 Mechanism of BMP9 inducing osteogenic differentiation of pig AVICs

綜上所述，BMP9 能夠促進(jìn)AVICs 的成骨樣分化，這一作用機(jī)制可能與Notch 和TLR4 信號通路的激活有關(guān)。為CAVD 的治療提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。抑制AVICs BMP9 表達(dá)或阻斷Notch 和TLR4 信號通路，可能會(huì)延緩瓣膜鈣化進(jìn)程。